Monitoraggio dell'attività neutrofila elastasi e cathepsin G nei campioni di espettorato umano

I seguenti protocolli descrivono l’analisi eseguita sull’espettorato umano. La gestione dei campioni umani è stata approvata dal comitato etico dell’Università di Heidelberg e il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti o dai loro genitori / tutori legali (S-370/2011) e controlli sani (S-046/2009). NOTA: I seguenti protocolli descrivono la preparazione del campione e la quantificazione dell’attività delle proteasi della serina neutrofila (NSP). Le procedure sperimentali qui presentate si concentrano sulla misurazione dell’attività dell’espettorato umano e dell’elastasi neutrofila14,20,21 (NE) o catepsina G15 (CG). Tuttavia, lievi adattamenti nel protocollo di preparazione del campione rendono possibile l’analisi delle cellule derivate dal sangue e degli omogeneati tumorali. Inoltre, le attività della matrice metalloproteinasi 12 e della catepsina S possono essere studiate in modo simile mediante sonde FRETdedicate 22,23,24,25,26. 1. Preparazione del campione: isolamento cellulare e separazione supernatante NOTA: Se possibile, il trattamento dell’espettorato deve essere effettuato entro 120 minuti dall’espettorazione e l’espettorato deve essere conservato sul ghiaccio fino a ulteriore lavorazione. Se l’espettorazione spontanea dell’espettorato non è possibile, indurre l’espettorato come descrittoin precedenza 19. In breve, inalare 200 μg del salbutamolo antagonista del recettore β-2 prima di iniziare la procedura di induzione dell’espettorato. Successivamente, inalare una soluzione salina ipertonica (6%) per 15 minuti utilizzando un nebulizzatore. Raccogliere l’espettorato espettorato in una piastra di Petri. Separare i grumi di muco dalla saliva in una piastra di Petri con l’aiuto di una punta di pipetta. Pesa il muco.NOTA: Il peso medio di un campione di muco è di 0,8 g (variabile tra 0,1 g e 5 g); 0,1 g sono generalmente sufficienti per eseguire le procedure menzionate. Aggiungere 4 parti (v/w) di Sputolysin al 10% (in PBS) all’espettorato (ad esempio: 4 mL di 10% di Sputolysin per ogni grammo di espettorato).ATTENZIONE: La sputolisina è composta da ditiothiothreitol concentrato nel tampone fosfato, quindi maneggiarla con cura. Incubare la miscela a temperatura ambiente (RT) su uno shaker a dondolo per 15 minuti per sciogliere il muco. Per motivi di sicurezza, posizionare lo shaker in una cappa aspirante. Temprare la reazione aggiungendo lo stesso volume di PBS freddo (ad esempio: 1 mL di PBS freddo per ogni mL di 10% Sputolysin). Mescolare con pipettazione per ottenere una soluzione omogenea. Filtrare la miscela attraverso un colino a celle di nylon da 100 μm in un tubo da 50 ml. Ripetere il passaggio di filtrazione attraverso un filtro a celle in nylon da 40 μm. Centrifugare la soluzione per 10 min a 300 x g a 4 °C. Trasferire accuratamente la frazione supernatante in un tubo fresco e conservarla sul ghiaccio.NOTA: Le frazioni supernatanti possono essere conservate a -20 °C o -80 °C fino a ulteriori analisi. Rimorsi delicatamente il pellet cellulare in 500 μL di PBS freddo e posizionarlo sul ghiaccio.NOTA: La frazione cellulare deve essere elaborata immediatamente. 2. Misurazione dell’attività della proteasi della serina neutrofila NOTA: Qui vengono introdotti diversi metodi per quantificare l’attività dei NSP tramite i reporter FRET. La scelta della tecnologia è dettata dalla specifica questione biomedica e dallo scopo dell’esperimento. Le sonde presentate sono state ampiamente testate per la loro specificità rispetto a una serie di enzimi rilevanti per ipolmoni 14,15. Sebbene le sonde siano specifiche verso il loro enzima bersaglio, controllare sempre la specificità della sonda sul campione clinico di interesse. Ciò può essere ottenuto incubando il campione con uno specifico inibitore della proteasi prima dell’aggiunta della sonda, che dovrebbe abolire qualsiasi aumento del rapporto D/A. Quantificazione dell’attività dei NSP solubili tramite saggio fluorimetro o lettore di lastreNOTA: L’attività proteasi nelle frazioni solubili del campione può essere rilevata con qualsiasi strumento in grado di rilevare la fluorescenza.Scongelare gli enzimi sul ghiaccio. Fino all’uso, conservare NE e CG in tampone di stoccaggio acido (acetato di sodio da 50 mM, NaCl da 200 mM, pH 5,5) per evitare l’autosa scissione. Per impostare una curva standard enzimatica, preparare una diluizione seriale 1:2 dell’enzima (33.9 – 0.271 nM per NE; 42.6 – 0.333 nM per CG) nel tampone di attivazione (10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl a pH 7.5). Il buffer di attivazione ha un pH neutro e quindi consente la catalisi enzimatica in modo efficiente. Per preparare la concentrazione standard più elevata (concentrazione di NE: 33,9 nM), diluire 1 μL di NE (33,9 μM) in 999 μL di tampone di attivazione. Per preparare il secondo standard (concentrazione NE: 16,95 nM), mescolare 200 μL della prima diluizione con 200 μL di tampone di attivazione. Procedere di conseguenza per preparare le restanti diluizioni 1:2. L’ultimo standard, che è lo spazio vuoto, è composto da un buffer di attivazione puro. Si raccomanda la misurazione di duplicati tecnici o triplicati. Durante la preparazione standard e del campione, cercare di mantenere le fiale sul ghiaccio. Parallelamente alla preparazione standard, diluire i campioni di espettorato nel buffer di attivazione. Diluire i campioni umani prima di valutare la loro attività proteasi per rimanere nella gamma lineare di aumento del segnale del reporter (rapporto donatore/accettore). Se i campioni del paziente non fossero diluiti, la scissione si verifica troppo rapidamente per un raccordo affidabile. Poiché l’espettorato del donatore sano contiene meno proteasi attive rispetto ai campioni di pazienti affetti da CF e BPCO, vengono generalmente eseguite diverse diluizioni (1:10 per il supernatante sano dell’espettorato, 1:20-500 per il supernatante di espettorato di pazienti affetti da BPCO o CF).NOTA: Per misurare quantitativamente l’attività proteasi in campioni in cui la loro concentrazione è sconosciuta, è necessario misurare in parallelo una curva standard con concentrazioni enzimatiche note, idealmente sulla stessa piastra. La concentrazione di enzima attivo nell’espettorato umano viene calcolata interpolando i pendenze misurati nei campioni di espettorato umano con quelli misurati con le curve standard. Prima di preparare i campioni per la misurazione, impostare lo strumento. Impostare la lunghezza d’onda di eccitazione per la sonda NE FRET (NEmo-114) su 354 nm e impostare la lunghezza d’onda di rilevamento su 400 nm per il donatore e 490 nm per l’accettore. Impostare la lunghezza d’onda di eccitazione per la sonda CG FRET (sSAM15) su 405 nm e impostare l’emissione su 485 (donatore) e 580 nm (accettore). Aggiungere 40 μL di campioni, standard o vuoti nei pozzali di una piastra nera a mezza area da 96 po’. Per preparare il master mix contenente i giornalisti (concentrazione del reporter nel master mix: 10 μM), diluire il materiale della sonda (1 mM in DMSO) 1:100 nel buffer di attivazione. Preparare il volume di mixaggio principale necessario moltiplicando 10 μL x il numero di pozzi di piastre richiesti. Per raggiungere la concentrazione finale ottimale (2 μM) per la misurazione della fluorescenza dei reporter NEmo-1 e sSAM, aggiungere 10 μL della miscela principale a ciascun pozzo (contenente 40 μL di entrambi i campioni, standard o vuoti) e iniziare la lettura. I reporter NEmo-1 e sSAM monitoreranno quindi l’attività solubile dell’elastasi neutrofila e della catepsina G, rispettivamente.NOTA: Se un iniettore di reagente non è disponibile, assicurarsi di avviare la lettura il prima possibile dopo l’aggiunta del reporter ai campioni. Avviare la misurazione del lettore di lastre e registrare il rapporto donatore/accettore aumentare ogni 60-90 secondi per almeno 20 minuti o fino a quando l’aumento del segnale raggiunge un plateau. Una volta esportati i dati, calcolare il rapporto donatore/accettore (rapporto D/A) dividendo le unità di fluorescenza relative del donatore (RFU) con l’accettore RFU per ogni punto di tempo e campione. Calcolare la media del rapporto D/A e la deviazione standard di ciascun campione. Determinare la pendenza all’interno della crescita lineare della variazione del rapporto D/A. La pendenza è un indicatore della velocità di scissione enzimatica per una sonda FRET. Calcolare la concentrazione di enzima attivo nell’espettorato adattando i pendenze di regressione lineare derivati dai campioni umani con quelli calcolati dallo standard enzimatico. Quantificazione dell’attività degli NSP legati a membrana tramite saggio fluorimetro o lettore di piastre Isolare le cellule dell’espettorato come descritto in precedenza. Resuspend 3 x 104 cellule in un volume di 40 μL di PBS. Aggiungere bene le celle al lettore di lastre. Impostare lo strumento. Impostare la lunghezza d’onda di eccitazione per la sonda NE FRET legata alla membrana (NEmo-214) su 405 nm e impostare la lunghezza d’onda di rilevamento su 485 nm per il donatore e 580 nm per l’accettore. Impostare la lunghezza d’onda di eccitazione per la sonda CG FRET legata alla membrana (mSAM15) su 405 nm e impostare l’emissione su 485 (donatore) e 580 nm (accettore). Per preparare il mix master contenente i reporter, diluire il materiale della sonda nel buffer di attivazione a una concentrazione di 10 μM. Preparare il volume di mix master necessario moltiplicando 10 μL X il numero di pozzi di piastra richiesti. Per raggiungere la concentrazione finale ottimale (2 μM) per la misurazione della fluorescenza dei reporter NEmo-2 e mSAM, aggiungere 10 μL della miscela principale a ciascun pozzo (contenente 40 μL di entrambi i campioni, standard o vuoti) e iniziare la lettura. I reporter NEmo-2 e mSAM monitoreranno quindi l’attività neutrofila elastasi e catapsina G legata alla membrana, rispettivamente.NOTA: È possibile utilizzare un controllo negativo cellulare, ad esempio cellule che non secernono attivamente i PNE. Ad esempio, l’incubazione dei reporter con 3 x 104 progenitori di leucociti HL-60 cellule promielocitiche rappresenta un valido controllo negativo della scissione. Variazione record del rapporto donatore/accettore per almeno 20 minuti o fino a quando l’aumento del segnale raggiunge un plateau. Analizzare i dati come descritto sopra. Misurazione dell’attività degli NSP legati alla membrana tramite microscopia a fluorescenzaDeterminare il numero di condizioni che devono essere analizzate.NOTA: Per ogni misurazione del campione di espettorato, si raccomanda la preparazione e l’analisi di un ulteriore controllo positivo (PC) e negativo (NC). Per ogni misurazione, resuspend 3 x 104 celle di espettorato in un volume di 50 μL PBS in un tubo da 1,5 ml. Come controllo negativo, incubare le cellule dell’espettorato con uno specifico inibitore (Sivelestat, inibitore specifico della NE, o inibitore della catepsina G I, inibitore specifico del CG, ad una concentrazione finale di 100 μM). Incubare per 10 minuti a RT. Come controllo positivo, incubare le cellule dell’espettorato con l’enzima appropriato (NE o CG rispettivamente a 340 nM o 200 nM) per 10 minuti a RT. Aggiungere 50 μL di PBS contenente il reporter FRET e una macchia nucleare (in una diluizione finale 1:1000) a ciascun tubo (cellule positive trattate con controllo, cellule trattate con controllo negativo e cellule non trattate) al fine di raggiungere una concentrazione finale della sonda di 2 μM. Incubare per 10-20 min a RT.IMPORTANTE: L’aggiunta di una macchia nucleare facilita l’imaging della microscopia a fluorescenza in quanto consente di cercare cellule di interesse dell’espettorato senza utilizzare i canali della sonda FRET e quindi di evitare lo sbiancamento del reporter. Inoltre, la macchia di DNA consente di segmentare le cellule dell’espettorato in base alla forma del loro nucleo. Ad esempio, i neutrofili possono essere facilmente identificati dai loro nuclei multilobulari. Inoltre, è possibile recuperare ulteriori informazioni sulla vitalità delle cellule (i neutrofili con un nucleo più segmentato hanno maggiori probabilità di essere vivi).NOTA: Oltre a quella legata alla membrana, l’attività di NE o CG legato al DNA nell’espettorato umano può essere misurata allo stesso modo per mezzo di H-NE e H-CG, sonde FRET extracellulari che associano il DNA27. Durante la preparazione della miscela master, H-NE e H-CG possono essere aggiunti alla concentrazione di 10 μM e incubati con espettorato prima della preparazione di citospini e scivolo. La quantificazione del rapporto D/A sul DNA extracellulare procede in modo identico a NEmo-2 e mSAM, con l’unica differenza che gli aggregati di DNA extracellulare sono segmentati invece di singole cellule27. Dissetare la reazione aggiungendo 100 μL di PBS ghiacciato e trasferire campioni sul ghiaccio. Citospin la miscela su vetrini di microscopia, asciugare all’aria, fissare con metanolo ghiacciato 10% per 10 min, asciugare all’aria e montare con un mezzo di montaggio appropriato.NOTA: Le diapositive di microscopia possono essere conservate a 4 °C al buio per un massimo di un mese fino a ulteriori analisi. Acquisire immagini di microscopia utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo di olio PL APO 40x o 63x. Per aumentare la qualità dell’immagine e ridurre i tempi di acquisizione è consigliata una modalità sequenziale di acquisizione delle immagini. Immagina la macchia nucleare prima tramite eccitazione a 633 nm con la linea elio-neon-laser e registra la sua emissione tra 650 e 715 nm. Registrare il donatore (cumarina 343) del reporter FRET tra 470 e 510 nm all’eccitazione a 458 nm con un laser argon. Acquisire l’emissione di accettore sensibilizzato (5,6-TAMRA) tra 570 e 610 nm dopo l’eccitazione dell’unico donatore. Registrare l’emissione di accettore diretto in un canale separato tra 470 e 510 nm su un’eccitazione ottimale dell’accettore a 561 nm utilizzando il laser APSS (Pumped Solid State) del diodo. Impostare il foro stenopeico all’inizio dell’esperimento e mantenerlo durante il corso della sessione di imaging.NOTA: A causa delle loro piccole dimensioni, si consiglia l’uso di un obiettivo di microscopio 40x o 63x per visualizzare correttamente i neutrofili. Di solito, le immagini vengono acquisite in diversi canali consecutivi, a partire dalla lunghezza d’onda di eccitazione più lunga per prevenire il fotobleaching del reporter durante l’acquisizione. Immagine di almeno 100 celle per condizione per statistiche conclusive. Per l’analisi delle immagini al microscopio utilizzare un software appropriato: segmentare le celle e calcolare il rapporto D/A in base al pixel, in seguito calcolare la media o mediana di una data regione di interesse che viene selezionata manualmente dall’utente. Per i risultati rappresentativi si veda la figura 1. Figura 1: Immagini rappresentative e quantificazione dell’attività NE legata alla membrana sui neutrofili isolati dall’espettorato del paziente CF. a) Immagini rappresentative di microscopia confocale di neutrofili pre-incubati (pannello superiore) per 10 min con 100 μM di Sivelestat (w/) o lasciati non trattati (w/o) (pannello inferiore) prima dell’aggiunta del reporter NEmo-2 (2 μM). La prima colonna da sinistra mostra la macchia nucleare, la seconda il canale donatore, la terza il canale accettore e l’ultima il rapporto D/A calcolato ottenuto dividendo i canali donatore e accettore su base pixel per pixel. I confini della regione di interesse (singolo neutrofilo) sono raffigurati come linee tratteggiate. Sono indicate le barre di scala (10 μm) e di taratura (rapporto D/A). b)Box- e dot-plot che mostrano il rapporto D/A dei neutrofili dell’espettorato di un paziente CF rappresentativo. Le cellule incubate con cellule inibitorie e non trattate sono mostrate rispettivamente in grigio e blu. Ogni punto rappresenta una cellula (N: w/ inibitore = 113 e w/o inibitore = 96). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Misurazione dell’attività degli NSP legati alla membrana tramite citometria del flusso Resuspend 1 x 106 celle in 100 μL di PBS in un tubo di polistirolo facs da 5 ml e posizionare il tubo sul ghiaccio. Per gateare i neutrofili dell’espettorato, utilizzare i seguenti anticorpi: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) e CD66b (1:50). Preparare un mix master sufficiente per tutti i campioni. Metti il mix maestro sul ghiaccio al buio. Impostare la strategia di gating come descritto nella figura 2. I neutrofili sono gated come 7AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ eventi. Gli eventi gated verranno quindi analizzati per la loro attività proteasi legata alla membrana per il loro donatore (λexc = 405 nm, λem = 450/50 nm) e accettore (λexc = 405 nm, λem = 585/42 nm) intensità fluorescenti medie (IFM). Aggiungere 2 μL di FcBlock a ciascun campione e incubare per 5 minuti a RT. Aggiungere gli anticorpi scelti a ciascun tubo e incubare per 30 minuti sul ghiaccio al buio. Lavare le celle aggiungendo 2 mL di PBS freddo e centrifugare per 5 minuti a 300 x g e 4 °C. Scartare le cellule supernatanti e resuspend in 200 μL di PBS freddo. Dividere i 200 μL in due tubi con 100 μL ciascuno e aggiungere 5 μL di soluzione di colorazione di vitalità cellulare in ciascun tubo. Metti i tubi sul ghiaccio. Aggiungere un inibitore specifico NSP appropriato (per NE utilizzare Sivelestat a concentrazione finale di 225 μM, per CG utilizzare catepsina G Inibitore I a 100 μM) alla provetta di controllo negativo (NC). Incubare i campioni a RT per 10 minuti al buio. Aggiungere 100 μL di PBS freddo al campione, filtrarlo attraverso un filtro da 40 μm in un tubo FACS pulito per evitare l’intasamento dello strumento. Aggiungere il reporter (per NE, NEmo-2 ad una concentrazione finale di 4 μM, per CG, mSAM ad una concentrazione finale di 2 μM) al campione NC, vortice delicatamente il tubo. Inizia ad acquisire cellule incubate con l’inibitore specifico per regolare leggermente, se necessario, i cancelli e le tensioni dei PMT del reporter. Registrare almeno 1000 neutrofili. Conservare il campione a temperatura ambiente.NOTA: Sebbene sia possibile registrare più eventi, 1000 celle garantiscono un buon compromesso tra statistiche corrette e tempo di registrazione. Procedere di conseguenza con i seguenti tubi (campioni di espettorato non trattati). Per registrare le variazioni del rapporto D/A dovute all’attività proteasi legata alla membrana, registrare 1000 neutrofili da ogni tubo ogni 5-10 minuti.NOTA: Dopo aver superato con successo la scissione del reporter FRET, l’intensità delle IFM del canale donatore aumenterà nel tempo. L’intensità delle IFM del canale accettore dovrebbe diminuire o rimanere costante nel tempo. Calcola il rapporto FRET dividendo il donatore per i valori del canale accettore per i campioni misurati sui singoli neutrofili vitali gated. Normalizzare le misurazioni del campione dividendoli con il corrispondente punto di tempo di 0 minuti (per risultati rappresentativi e analisi cfr. figura 2).NOTA: La registrazione di almeno due punti di tempo (cioè 0 e 10 min) è necessaria per una misurazione dinamica della variazione del rapporto D/A. Per normalizzare la misurazione dell’attività per ciascun campione, il rapporto D/A misurato in punti di tempo successivi (ad esempio, 10 min) è diviso per il rapporto calcolato immediatamente dopo l’aggiunta della sonda (0 min). Figura 2: Strategia di Gating e grafici rappresentativi dell’attività NE legata alla membrana misurati sui neutrofili isolati dall’espettorato del paziente CF. a)Per gateare i neutrofili dell’espettorato vengono utilizzati i seguenti anticorpi: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) e CD66b (1:50). I neutrofili sono gated come 7-AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ eventi. Gli eventi gated vengono analizzati per il loro donatore (λexc= 405 nm, λem= 450/50 nm) e accettore (λexc= 405 nm, λem= 585/42 nm) intensità medie di fluorescenza (IFM). b)Istogrammi rappresentativi dei neutrofili cf dell’espettorato analizzati per la loro attività NE legata alla membrana. La colonna sinistra mostra il segnale del donatore, la colonna destra mostra il segnale accettore. La riga superiore mostra intensità di fluorescenza media delle cellule trattate con Sivelestat (w/) per 10 minuti prima dell’aggiunta del reporter. La riga inferiore mostra cellule non trattate (w/o) la cui fluorescenza reporter viene misurata immediatamente (0 min, grigio) e 10 min (blu) dopo l’aggiunta del reporter. I neutrofili sono gated secondo la strategia mostrata nel pannello a. c) La tabella dati mostra un set di dati rappresentativo costituito da IFM grezze per il donatore e segnale accettore sui neutrofili misurati su diversi punti di tempo (0-3-5-10-15-20 min) e il rapporto D/A calcolato. Il rapporto D/A può essere normalizzato, cioè al punto di tempo di 0 minuti (carattere bianco). 0 min indica una registrazione eseguita il prima possibile dopo l’aggiunta del reporter al tubo di flusso con celle di espettorato macchiate. I dati delle IFM sono mostrati come ± deviazione standard per 1000 neutrofili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.