رصد نيوتروفيلي إيلاستاز وكاثيبسين G النشاط في عينات البلغم البشري
Summary
توفر البروتوكولات الموصوفة هنا دليلا لتصور وقياس نشاط البروتياز العدلي في البلغم البشري. تمتد تطبيقات هذا التحليل من تقييم العلاجات المضادة للالتهابات ، إلى التحقق من صحة العلامات الحيوية ، وفحص الأدوية والدراسات السريرية الفوج الكبيرة.
Abstract
Proteases هي المنظمين لعدد لا يحصى من العمليات الفسيولوجية والتحقيق الدقيق في أنشطتها لا يزال تحديا الطب الحيوي مثيرة للاهتمام. من بين ~600 proteases المشفرة من قبل الجينوم البشري, يتم التحقيق بدقة proteases سيرين العدلات (NSPs) لتورطهم في بداية وتطور الظروف الالتهابية بما في ذلك أمراض الجهاز التنفسي. فريد, NSPs يفرز ليس فقط منتشر داخل السوائل خارج الخلية ولكن أيضا توطين لأغشية البلازما. خلال تشكيل فخ خارج الخلية العدلية (NETs) ، تصبح NSPs جزءا لا يتجزأ من الكروماتين المفرز. مثل هذا السلوك المعقد يجعل فهم الفيزيولوجيا المرضية NSPs مهمة صعبة. هنا، تظهر بروتوكولات مفصلة لتصور وقياس وتميز خالية والأغشية ملزمة العدلات elastase (NE) وكاثيبسين G (CG) الأنشطة في عينات البلغم. NE و CG هي NSPs التي أنشطتها لها أدوار منشط الذهن في مسببات الأمراض من التليف الكيسي (CF) ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD): أنها تعزز إعادة عرض الأنسجة، وتنظيم الاستجابات المناعية المصب وترتبط مع شدة أمراض الرئة. تظهر البروتوكولات كيفية فصل الكسر السائل والخلوي ، وكذلك عزل العدلات عن البلغم البشري لتحديد كمية النشاط الأنزيمي عبر مراسلي نقل الطاقة بالرنين بالرنين الصغير Förster (FRET). لجمع رؤى محددة في الدور النسبي للأنشطة NE وCG، يمكن قياس قراءات FRET من خلال تقنيات مختلفة: 1) في قياسات قارئ لوحة المختبر تسمح للكشف عن الإنتاجية العالية والجزء الأكبر من نشاط البروتيز؛ ‘2’ في قياسات قارئ لوحة المختبر تسمح للكشف عن الإنتاجية العالية والجزء الأكبر من نشاط البروتيز؛ ‘2’ في قياسات قارئ الصفائح المختبرية؛ ‘2’ إتاحة إمكانية زيادة الإنتاجية والكشف بالجملة عن نشاط البروتيز؛ ‘2’ في قياسات قارئ الصفائح المختبرية؛ ‘2’ إتاحة إمكانية الكشف عن نشاط البروتيز على نحو كبير؛ ‘2’ القياسات التي يمكن أن تكون ذات إنتاجية عالية أو ii) المجهر confocal يحل بشكل كبير نشاط الغشاء ملزمة على سطح الخلية; 3) صغير جزيء FRET تدفق قياس الخلايا تمكن من التقييم السريع للعلاجات المضادة للالتهابات عن طريق خلية واحدة protease النشاط الكمي وphenotyping. إن تنفيذ هذه الطرق يفتح الأبواب لاستكشاف علم الأحياء المرضية NSPs وإمكاناتها كعلامات بيولوجية لشدة المرض ل CF و COPD. ونظرا لإمكانات التوحيد القياسي، والقراءة القوية وبساطة النقل، فإن التقنيات الموصوفة قابلة للمشاركة على الفور للتنفيذ عبر مختبرات البحوث والتشخيص.
Introduction
الإلستازي العدلي (NE), الكاثيبسين G (CG), بروتيناز 3 (PR3) وبروتياز سيرين العدلات 4 (NSP4) هي بروتياز سيرين العدلات الأربعة (NSPs)1. يتم تخزينها، جنبا إلى جنب مع myeloperoxidase، داخل حبيبات العدلات الأولية أو azurophilic. نظرا لمحتواها المرتفع من البروتيوليك ، يتم تنظيم إفراز الحبيبات الأولية بإحكام ويجب تحدي العدلات بشكل متسلسل مع فتيلة وتفعيل المحفزات2.
داخل البلعوم، NSPs وظيفة وكلاء مبيدات الجراثيم داخل الخلايا3. عندما يفرز, NSPs تصبح وسطاء قوية للالتهاب: أنها تصلب السيتوكينات ومستقبلات السطح, تفعيل مسارات موازية الموالية للالتهابات3. الأهم من ذلك ، تتميز الظروف الالتهابية بإفراز NSPs غير المنضبط. على سبيل المثال، داخل الشعب الهوائية الملتهبة، النشاط NE المفرط يسبب فرط أمان المخاط، الخلايا الكؤوس metaplasia، تعطيل CFTR ومصفوفة خارج الخلية إعادة عرض4،5. كاثيبسين G يشارك في التهاب كذلك: فإنه يشق على وجه التحديد وينشط عنصرين من الأسرة IL-1, IL-36α وIL-36β6. بالتنسيق مع NE، CG يشق مستقبلات protease تنشيط على ظهارة مجرى الهواء وينشط أيضا TNF-α وIL-1β.
الذاتية المضادة للبروتياز مثل ألفا-1-أنتيتريبسين, ألفا-1-أنتيتشيموتريبسين ومثبط بروتياز الكريات البيض إفراز تنظيم elastase العدلات وكاثيبسين G النشاط5. ومع ذلك ، على مدار تطور مرض الرئة ، يتجاوز إفراز البروتياز المستمر ستويتشيومتريا الدرع المضاد للبروتيز ، مما يؤدي إلى عدم حل العدلات في الشعب الهوائية ، وتفاقم الالتهاب وتلف الأنسجة5،7. على الرغم من أن تركيز NE والنشاط في الكسور القابلة للذوبان من الشعب الهوائية المريض وقد ثبت أن علامة بيولوجية واعدة من شدة المرض8, NE وCG المنتسبين أيضا إلى غشاء البلازما العدلات والحمض النووي خارج الخلية عن طريق التفاعلات الكهروستاتيكية9,10 حيث تصبح أقل سهولة لمكافحة proteases. الأهم من ذلك، حددت الدراسات ما قبل السريرية سيناريو حيث يظهر نشاط البروتيز المرتبط بسطح الخلية في وقت سابق و / أو بشكل مستقل عن نظيره القابل للذوبان4،11. في الواقع ، لتصبح قابلة للكشف ، والنشاط بروتياز الحرة يحتاج أولا إلى تطغى على الدرع المضادة للبروتيز. بدلا من ذلك، على سطح الخلية، نشاط بروتياز غشاء ملزمة لا تزال سليمة جزئيا على الأقل بسبب عدم إمكانية الوصول إلى مثبطات كبيرة لغشاء البلازما الخلية12. مثل هذا السلوك protease معقدة لها عواقب هامة على ظهور التهاب بوساطة العدلات وانتشار, وبالتالي يحتاج إلى التحقيق مع أدوات دقيقة وغنية بالمعلومات.
على مر السنين، وجدت المسابير المستندة إلى نقل الطاقة بالرنين Förster (FRET) العديد من التطبيقات الطبية الحيوية كأدوات تقيم بكفاءة وسرعة نشاط بروتياز محدد في العينات البشرية13. للعمل، تتكون مراسلي البروتيز من عزر التعرف (أي الببتيد)، الذي يتم التعرف عليه من قبل الإنزيم المستهدف والاعتماد على FRET، وهي عملية مادية حيث، عند الإثارة، يقوم الفلوروفور المانح بنقل الطاقة إلى جزيء مقبول. المعالجة التي يشغلها الإنزيم على المراسل ، وهي انشقاق جزء الاعتراف ، تؤدي إلى أن ينتشر المقبول بعيدا عن المتبرع: وبالتالي يتم قياس نشاط الإنزيم على أنه تغيير يعتمد على الوقت في المتبرع على مضان المقبول. وهذه القراءة هي تطبيع ذاتي ونسبة، وبالتالي تتأثر بشكل هامشي فقط بالظروف البيئية مثل الحموضة وتركيز المسبار المحلي. NEmo-114 و sSAM15 هي تحقيقات FRET التي تقدم تقارير محددة عن نشاط NE و CG على التوالي. ومع ذلك، فإن هؤلاء المراسلين لا ي توطين على وجه التحديد إلى أي مقصورة الخلوية، وبالتالي يتم استخدامها لرصد نشاط البروتيز الموجود في السوائل البشرية. من أجل رصد نشاط البروتيز بطريقة موضعية مكانيا ، قمنا نحن وآخرون بتطوير مسابير FRET التي ترتبط بمكونات دون الخلية عبر العلامات الجزيئية14و15و16و17و18و19. سمحت هذه الاستراتيجية الاصطناعية بتطوير NEmo-2 و mSAM ، وهما مسباران FRET مجهزان بمراسي الدهون التي يتم توطينها في غشاء البلازما. هؤلاء المراسلين غذت فهم أعمق من NE وCG proteases في التليف الكيسي وأمراض الانسداد الرئوي المزمن14,15.
هنا، يتم توفير بروتوكولات مفصلة لتصور وتكميم للذوبان والأغشية ملزمة NE وCG الأنشطة في البلغم البشري عن طريق سلسلة نيمو وسام من تحقيقات FRET. لمعالجة الجوانب المتنوعة من الفيزيولوجيا المرضية NSPs وتوفير مجموعة من الأساليب التي يمكن استخدامها وفقا للحاجة الخاصة بالمستخدم ، يتم عرض التحليل عبر التحليل الطيفي الفلوري ، والتنظير المجهري الفلوري وقياس التدفق الخلوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتشرح البروتوكولات المبلغ عنها نهجا مختلفة لقياس نشاط إيلاستاز العدلات والكاثيبسين G في عينات البلغم البشري. النقاط الحرجة لقياس نشاط إنزيم ناجح هي 1) التوقيت الدقيق وتوحيد الإجراء المنطوق و2) استخدام ضوابط سلبية وإيجابية موثوقة. إذا تم استيفاء هذه الشروط، لا تقتصر الطرق الموصوفة على البلغم ولكن يمكن أيضا تكييفها بسهولة لتحليل نشاط البروتيز في الدم وسوائل الحمم الهوائية وأقسام الأنسجة أو المتجانسات.
كل من التقنيات الثلاث لها نقاط قوتها والقيود، والتي غالبا ما تكمل بعضها البعض. على سبيل المثال، يسمح قياس التدفق الخلوي بالتحليل السريع لتجمعات الخلايا النادرة وكذلك الفينوتينينج الخلوي ولكنه يفتقر إلى معلومات الاستبانة المكانية، والتي يمكن تحقيقها عن طريق المجهر. بدلا من ذلك، تسمح قياسات قارئ اللوحة بإجراء تقييم مواز لعدة عينات أو ظروف بطريقة عالية الإنتاجية. وبما أنه لا يمكن تجميد خلايا البلغم الطازجة وتخزينها، فإن الطرق الثلاث تتطلب معالجة العينات بسرعة بعد التوقع. وهذا يحد من مرونة أو إنتاجية قياسات النشاط المرتبطة بالغشاء. تطوير بروتوكول قياس التدفق الخلوي الذي يسمح لإصلاح الخلايا بعد إضافة التحقيق والانقسام الأنزيمي من شأنه أن يفتح على القياس الموازي لعدد أكبر من الأنابيب. وعلاوة على ذلك، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لمعالجة وتخزين مسابير فريت. في الواقع، تخضع بعض الأمينواسيدات الموجودة في ركيزة الببتيد، مثل الميثيونين، للأكسدة مما يؤدي إلى انخفاض حساسية المراسل. لزيادة العمر الافتراضي للمراسل (يقدر بحوالي ثلاثة أشهر عند 20 درجة مئوية) ، يمكن تخزينها في حجم صغير aliquots (1-2 ميكرولتر) تحت غاز خامل مثل النيتروجين أو الأرجون.
في CF وأمراض الرئة الالتهابية المزمنة الأخرى من المهم الكشف عن الالتهاب في أقرب وقت ممكن ، والمؤشرات الحيوية الموثوقة لديها القدرة على تحقيق مثل هذا الهدف. إمكانية الكشف عن نشاط NSPs المرتبط بالسطح ، والذي ثبت أنه ضار للأنسجة المحيطة ، أيضا في الظروف التي لا يوجد فيها نشاط NE مجاني أو قليل ، يضيف مستوى آخر من المعلومات القيمة ، والتي لا يمكن تحقيقها بصعوبة عن طريق الطرق الأخرى الموجودة4،11.
يمكن استخدام المراسلين لدراسة ارتباط نشاط NSP المرتبط بالغشاء مع شدة وتطور أمراض الرئة ، خاصة في بدايتها المبكرة. يمكن استخدام الأساليب لمراقبة فعالية العلاج (على سبيل المثال ، العلاجات المضادة للالتهابات أو تحوير CFTR الفعال للغاية وأجهزة القوية28)والتحقيق في التثبيط الناتج عن الالتهاب المدفوع بالنيوتروف. بالإضافة إلى ذلك ، تستند البروتوكولات إلى إجراءات عينة غير جراحية تحمل مخاطر منخفضة للغاية للمريض ، وبالتالي ، يمكن استخدامها على نطاق واسع جدا وفتح الأبواب أمام العديد من التطبيقات المثيرة.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا المشروع من خلال منح من وزارة التعليم والبحوث الألمانية (FKZ 82DZL004A1 إلى M.A.M) ومؤسسة البحوث الألمانية (SFB-TR84TP B08 إلى M.A.M). تم دعم العمل الموصوف في هذه المخطوطة من قبل المركز الألماني لأبحاث الرئة (DZL) و EMBL هايدلبرغ من خلال زمالة دكتوراه في M.G. ونشكر ج. شاترني، وس. بوتز، وه. شورمان على المساعدة التقنية الخبيرة.
Materials
| 100 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431752 | |
| 2300 EnSpire (Multilabel Plate Reader) | PerkinElmer | ||
| 35x10mm Dish, Nunclon Delta | Thermo Fisher Scientific | 150318 | |
| 40 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431750 | |
| 50 mL tubes | Sarstedt | 10535253 | |
| 7-AAD, viability dye | Bio Legend | 420404 | 5 µL/100 µL |
| Balance | OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd. | PR124 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tubes 5 mL | BD Bioscience | 352054 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | ||
| black flat bottom 96 well half area plate | Corning Life Science | 3694 | |
| Cathepsin G | Elastin Products Company | SG623 | |
| Cathepsin G Inhibitor I | Merck KGaA | 219372 | |
| Centrifuge 5418R | Eppendorf AG | EP5401000137 | |
| Combitips advanced 1.0 mL | Eppendorf AG | 0030 089 430 | |
| cOmplete proteinase inhibitor | Roche | 11697498001 | |
| Countig chambers improved Neubauer | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442 | |
| coverslips Ø 25mm | Thermo Fisher Scientific | MENZCB00250RA003 | |
| Cytospin 4 | Thermo Fisher Scientific | ||
| DRAQ5 (nuclear stain) | BioStatus Limited | DR50050 | 1:10000 |
| FACSDiva software, v8.0.1 | BD Bioscience | ||
| FcBlock | BD Bioscience | 564219 | |
| Fiji (Fiji Is Just ImageJ) | fiji.sc | ||
| Flow Jo software, v10 | TreeStar | ||
| FluoQ Plugin, v3-97 | |||
| Heraeus Megafuge 16R | Thermo Fisher Scientific | ||
| Human Sputum Leucocyte Elastase | Elastin Products Company | SE563 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Mini Rock-Shaker | PEQLAB Biotechnologie GmbH | MR-1 | |
| mouse anti-human CD14, Pe-Cy7, clone M5E2 | BD Bioscience | 557742 Lot:8221983 | 1:50 |
| mouse anti-human CD16, AF700, clone 3G8 | BD Bioscience | 557820 Lot:8208791 | 1:50 |
| mouse anti-human CD45, APC-Cy7, clone 2D1 | BD Bioscience | 557833 Lot:8059688 | 1:33 |
| mouse anti-human CD66b, PE/Dazzel 594, clone G10F5 | BioLegend | 305122 Lot:B241921 | 1:50 |
| mSAM | in house | 2 mM | |
| Multipette plus | Eppendorf AG | ||
| NEmo-1 | SiChem | SC-0200 | 1 mM |
| NEmo-2E | SiChem | SC-0201 | 2 mM |
| Pari Boy SX with an LC Sprint jet nebulizer | Pari | 085G3001 | |
| phosphate buffered saline | Gibco | 10010-015 | |
| ROTI Histokitt (mounting medium) | Carl Roth GmbH + Co.KG | 6638.1 | |
| Salbutamol | Teva GmbH | ||
| Sivelestat | Cayman Chemicals | 17779 | |
| Sputolysin | Calbiochem | 560000-1SET | |
| sSAM | in house | 2 mM | |
| SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Korkmaz, B., Moreau, T., Gauthier, F. Neutrophil elastase, proteinase 3 and cathepsin G: Physicochemical properties, activity and physiopathological functions. Biochimie. 90 (2), 227-242 (2008).
- Sheshachalam, A., Srivastava, N., Mitchell, T., Lacy, P., Eitzen, G. Granule Protein Processing and Regulated Secretion in Neutrophils. Frontiers in Immunology. 5, 448 (2014).
- Pham, C. T. N. Neutrophil serine proteases: Specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Gehrig, S., et al. Lack of neutrophil elastase reduces inflammation, mucus hypersecretion, and emphysema, but not mucus obstruction, in mice with cystic fibrosislike lung disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (9), 1082-1092 (2014).
- McKelvey, M. C., Weldon, S., McAuley, D. F., Mall, M. A., Taggart, C. C. Targeting proteases in cystic fibrosis lung disease paradigms, progress, and potential. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (2), 141-147 (2020).
- Clancy, D. M., et al. Extracellular Neutrophil Proteases Are Efficient Regulators of IL-1, IL-33, and IL-36 Cytokine Activity but Poor Effectors of Microbial Killing. Cell Reports. 22 (11), 2937-2950 (2018).
- Giacalone, V. D., Margaroli, C., Mall, M. A., Tirouvanziam, R. Neutrophil adaptations upon recruitment to the lung: New concepts and implications for homeostasis and disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-21 (2020).
- Sly, P. D., et al. Risk Factors for Bronchiectasis in Children with Cystic Fibrosis. New England Journal of Medicine. 368 (21), 1963-1970 (2013).
- Owen, C. A., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Campbell, E. J. Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: A novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. Journal of Cell Biology. 131 (3), 775-789 (1995).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Margaroli, C., et al. Elastase Exocytosis by Airway Neutrophils Associates with Early Lung Damage in Cystic Fibrosis Children. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. , (2018).
- Owen, C., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Carolina, N. Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: a novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. The Journal of cell biology. 131 (3), 775-789 (1995).
- Garland, M., Yim, J. J., Bogyo, M. A Bright Future for Precision Medicine: Advances in Fluorescent Chemical Probe Design and Their Clinical Application. Cell chemical biology. 23 (1), 122-136 (2016).
- Gehrig, S., Mall, M. A., Schultz, C. Spatially resolved monitoring of neutrophil elastase activity with ratiometric fluorescent reporters. Angewandte Chemie – International Edition. 51 (25), 6258-6261 (2012).
- Guerra, M., et al. Cathepsin G Activity as a New Marker for Detecting Airway Inflammation by Microscopy and Flow Cytometry. ACS Central Science. 5 (3), 539-548 (2019).
- Hu, H. Y., et al. In vivo imaging of mouse tumors by a lipidated cathepsin S substrate. Angewandte Chemie – International Edition. 53 (29), 7669-7673 (2014).
- Korkmaz, B., et al. Measuring elastase, proteinase 3 and cathepsin G activities at the surface of human neutrophils with fluorescence resonance energy transfer substrates. Nature Protocols. 3 (6), 991-1000 (2008).
- Craven, T. H., et al. Super-silent FRET Sensor Enables Live Cell Imaging and Flow Cytometric Stratification of Intracellular Serine Protease Activity in Neutrophils. Scientific Reports. 8 (1), 13490 (2018).
- Mu, J., et al. A small-molecule fret reporter for the real-time visualization of cell-surface proteolytic enzyme functions. Angewandte Chemie – International Edition. 53 (52), 14357-14362 (2014).
- Hagner, M., et al. New method for rapid and dynamic quantification of elastase activity on sputum neutrophils from patients with cystic fibrosis using flow cytometry. European Respiratory Journal. 55 (4), 1902355 (2020).
- Dittrich, A. S., et al. Elastase activity on sputum neutrophils correlates with severity of lung disease in cystic fibrosis. European Respiratory Journal. , 1701910 (2018).
- Cobos-Correa, A., Trojanek, J. B., Diemer, S., Mall, M. A., Schultz, C. Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12 activity in pulmonary inflammation. Nature Chemical Biology. 5 (9), 628-630 (2009).
- Hu, H. -. Y., et al. FRET-based and other fluorescent proteinase probes. Biotechnology Journal. 9 (2), 266-281 (2014).
- Trojanek, J. B., et al. Airway mucus obstruction triggers macrophage activation and matrix metalloproteinase 12-dependent emphysema. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (5), 709-720 (2014).
- Wagner, C. J., Schultz, C., Mall, M. A. Neutrophil elastase and matrix metalloproteinase 12 in cystic fibrosis lung disease. Molecular and Cellular Pediatrics. 3 (1), 25 (2016).
- Gaggar, A., et al. The role of matrix metalloproteinases in cystic fibrosis lung disease. The European respiratory journal. 38 (3), 721-727 (2011).
- Guerra, M., et al. Protease FRET Reporters Targeting Neutrophil Extracellular Traps. Journal of the American Chemical Society. 142 (48), 20299-20305 (2020).
- Middleton, P. G., et al. Elexacaftor-Tezacaftor-Ivacaftor for Cystic Fibrosis with a Single Phe508del Allele. New England Journal of Medicine. 381 (19), 1809-1819 (2019).
