通过冷冻软X射线断层扫描对细胞进行3D制图描述

1. 样品制备 准备网格支持 用紫外线照射网格3小时，碳膜朝上进行灭菌。 可选：如果出现单元格未附加到网格的问题，请使用以下步骤之一。 通过对网格进行等离子体处理来水亲化碳载体箔，以增加样品扩散和更好的细胞附着力。 将格栅碳面朝上放在辉光放电室设备中，并根据设备将格栅暴露在等离子体中30秒至15分钟（使用Ar或/和O2）。 使用聚-L-赖氨酸（PLL）功能化网格 在培养皿中加入60μL PLL的单个液滴，并将网格放在PLL滴的顶部，碳膜朝下。在37°C下孵育30分钟，并使用滤纸印迹PLL。 用胎牛血清（FBS）使网格功能化。 将网格淹没在FBS中过夜。将网格浸入缓冲溶液中进行洗涤，并将网格放在滤纸上以除去多余的液体。 在网格上生长贴壁细胞 在100mm的细胞培养皿中培养细胞以达到80%-90%汇合度（图2A）。 在P60培养皿（总共3 mL）中Au网格的顶部接种1-5 x 10 5个细胞/ mL（根据系统调整值）。注意： 细胞悬浮液的添加必须非常小心地完成，网格的碳膜在60mm的细胞培养皿中朝上。每个条件准备几个网格，每个P60培养皿一个条件（图2B）。 让细胞沉降，直到网格上的汇合度在每个网格正方形中达到几个细胞（1到10个，取决于细胞大小）（取决于细胞系，这可能需要长达24小时）。注意： 在冻结之前，应使用可见光显微镜（VLM）检查网格，评估碳膜完整性以及每个网格中的电池汇合度（图2C）。等到网格上达到适当的细胞密度。如果网格太合流或碳箔断裂，请重新开始。 细胞悬浮液沉积在网格上 使用跳槽中的镊子选择准备好的Au或Cu网格（参见第1.6节）。 制备1-5×105 细胞悬浮液（在细菌的情况下光密度吸光度为0.3），并向网格中加入4μL制备的悬浮液。 将网格与液滴水平孵育几分钟，以允许细胞沉积，然后将保持网格的镊子置于气候控制的玻璃化室内，设置为适当的温度和湿度条件（步骤1.6.1）。 可选：样品的荧光标记注意： 用荧光标记样品的某些细胞器可能是有益的。根据感兴趣的情况，可以使用特异性荧光团或稳定表达荧光蛋白的细胞或转染以短暂表达目标蛋白。这允许使用冷冻落射荧光显微镜轻松检测细胞，并有助于找到感兴趣的细胞以进行随后的X射线成像。在下文中，该方案仅详细说明了荧光基团的使用。 为荧光基团准备一个工作溶液（参见制造商的建议）并遵循特定的方案。 将荧光基团加入含有网格的培养皿中，轻轻混合。 在黑暗环境中孵育，并在孵育完成后直接进入步骤1.6。注意：一旦孵育完成，重要的是要准备好玻璃化，以避免非特异性标记，从而模糊荧光信号。 用于层析成像投影对准的金纳米颗粒（NPs）制备 取一等分试样1mL金基准储备溶液（Mistral为100nm或B24为250nm），并以低速离心（以避免聚集）1分钟，以使NPs沉淀。注意： 如果可能的话，最好让基准点在一夜或更长时间内自然沉降，以避免聚集。 取出上清液。在冷冻前，立即将NPs重新悬浮在20μL无血清培养基或缓冲溶液中，以获得均质溶液。注意： 建议进行超声处理和涡旋处理，以帮助使溶液均质化。 急冻网格注意：液氮会导致冷灼伤，应穿戴适当的防护装备（长实验室外套、安全护目镜、手套、长裤和封闭的鞋子）。乙烷具有高度爆炸性，应远离任何火花或明火。 按照制造商的说明准备和使用切入式冷冻仪。注意： 湿度通常设置为80%-90%;温度将取决于细胞类型（酵母最大30°C，哺乳动物细胞37°C，昆虫细胞28°C等）。 从边缘的培养皿上取一个带有安装镊子的网格，非常小心不要弯曲网格并将其安装在切入式冷冻设备上。确保细胞朝向远离印迹纸。 可选：在贴壁细胞的情况下，在缓冲液中洗涤网格三次。 在细胞顶部（通过腔室右侧的孔）加入1.5μL Au NP基准，并在印迹和击落网格之前静置30秒。注意： 在细胞悬浮的情况下，在安装镊子之前，在网格中仍然处于水平位置时将Au NP基准添加到网格中，并让它们静置30秒。印迹对于高质量电网至关重要。转印距离在开始之前需要校准;印迹纸的平整度对于可重复的印迹很重要（遵循制造商的说明）。需要评估每种细胞类型的印迹时间。 为每个条件准备多个网格。转移网格并在低温下储存以保持玻璃化。 使用冷冻可见光显微镜筛选网格 将液氮下的网格从冷冻盒转移到预冷式低温台内的标准冷冻盒（3 mm TEM网格的三个位置）（请参阅制造商的说明）。 将冷冻盒放置在冷冻台桥上，冷冻台安装在宽视场落射荧光光显微镜上。 使用长工作距离物镜（10x，50x，100x）在-196.5°C下对网格进行成像，以定位适合冷冻SXT成像的细胞并评估网格质量（是否存在厚冰，碳支撑膜的完整性，荧光信号的存在等）。 使用明场或/和荧光成像定位感兴趣的细胞。注意：在此阶段，如果显微镜上存在链接的相机，请捕获图像。将其用于图像关联。 筛选后，将网格返回到液氮储存杜瓦瓶中的冷冻箱中。注意：如果未找到好的样品，请重复样品制备步骤，修改任何参数。通常，需要修改的参数是印迹时间，以防冰太厚或汇合，如果每个网格正方形的细胞太多。 2. 装入透射X射线显微镜（TXM） 用液氮冷却转印室，直到达到<100 K，冷却工作站（图3A），然后打开工作站边缘的加热器。等到它停止沸腾。 将包含网格的所需冷冻盒放入工作站中的相应位置（图3A）。注意在冷冻条件下安全转移它们。 将选定的网格加载到先前冷却的样品架中（图3B）;将支架装载到穿梭车上，并用盖子保护它们（图3C）。 将穿梭车以<100 K的速度加载到转移室中，并将其泵入低真空（图3D）。 将转移室连接到TXM（图4A），并按照屏幕上的真空程序将转移室的穿梭物装载到TXM中（图4B）。 一旦穿梭车与样品一起进入内部，TXM机器人手臂就可以一次将一个样品架带到样品台（图4C）。 3. 使用 TXM 软件进行成像 注意：首先使用在线可见光显微镜（VLM）对样品台的网格进行成像，以明场和/或荧光模式绘制网格，然后再用X射线成像。使用左上面板上“ 运动控制 ”选项卡对应的操纵杆图标打开运动控制。 使用联机 VLM 对网格进行成像。 明场镶嵌采集 选择VLM相机（放大镜>VLM）并打开VLM LED光源以进行明场成像（显微镜>采集>采集设置>光源设置“，然后选择”传输”）。 将样品旋转至-60度，以面对VLM物镜（运动控制>样品>样品θ），并将样品移动到预期的居中位置（运动控制>样品X，样品Y）。 首先以20至50μm的步长采集图像，使网格大致聚焦（显微镜 > 采集 > 采集设置 > 采集模式 > 连续 > 开始; 运动控制 > 采样 和更改 样本 Z）。 用小步骤细化聚焦，直到细胞和/或碳支撑膜的孔聚焦（显微镜 > 采集 > 采集设置 > 采集模式 > 连续 > 开始;运动控制 > 采样 并更改 样本 Z），并在明场模式下开始采集网格的完整镶嵌图。使用镶嵌的默认值。（显微镜 > 采集 > 采集设置 > 采集模式 > 马赛克 > 开始）。注意： 镶嵌地图由单个图像组成。应设置图像数（列数、行数以及 X 和 Y 中的步长）以可视化整个网格。步长大小取决于视场 （FoV） 的大小。此处使用默认值。如果网格相对于完整镶嵌 FoV 在 X-Y 平面上未很好地居中，请停止采集，校正样本 X 和 Y 坐标并重复采集。 荧光模式镶嵌采集 关闭用于明场成像的VLM led光源（显微镜 > 采集 > 采集设置 > 光源设置 并取消选择 透射），并在设置上手动选择与所需激发波长（红色，绿色或蓝色）相对应的LED光源和相应的光学滤光片。 细化荧光图像（显微镜 > 采集 > 采集设置 > 采集模式 > 连续 > 开始; 运动控制 > 采样 并更改 样本 Z），然后从明场马赛克中获取保留位置参数（X 和 Y）的镶嵌贴图（显微镜 > 采集 > 采集设置 > 采集模式 > Mosaic > Start）。 关闭 LED 光源 可选：基于明场和荧光镶嵌图，注释先前（步骤1.7.4）或新ROI（图像中的X-Y位置）确定的感兴趣区域（ROI）。 X射线马赛克采集 选择CCD X射线探测器（放大镜 >选择 Pixis），将样品旋转0度（运动控制 > 样品 并更改 样品θ），并将X射线光学元件（聚光镜和区域板）移动到对齐位置（运动控制 > 聚光镜 >改变 聚光镜z; 运动控制 > 区板 和更改 区板Z）。注意： 在成像前将CCD芯片冷却至-65°C（显微镜 > 相机温度 > Pixis ，并将 设定温度 更改为-65°C，然后单击 “应用”）。 将样本移动到所选 ROI 之一（运动控制 > 样本 “的网格正方形的中心，然后更改 ”样本 X“、” 样本 Y”。 在5μm处使用分档2和出口狭缝以最小化Mistral处的照射和1秒的曝光，并在B24处分档1和60μm，使用样品Z平移调整焦点（显微镜 > 采集 > 采集设置 > 相机设置 并更改 分档; XS>运动控制 并 改变 XS; 显微镜 > 采集 > 采集设置> 采集模式 > 连续 > 启动;运动控制 > 采样 和更改 样本 Z）。从5μm的步骤开始，并将其细化到0.5μm的步骤，直到电池或碳箔孔很好地聚焦。 获取网格正方形的马赛克图（显微镜 > 采集 > 采集设置 > 采集模式 > 马赛克 > 开始）。注意： 马赛克采集参数的确定方式与 VLM 马赛克相同（第 3.1.1.4 节）。步长取决于光束线工作人员预先选择的放大倍率。 将样品移动到平场（FF）位置（网格内的空白区域，最好是碳支撑中的孔）（运动控制>样品X，样品Y的样品和更改）。 将Mistral的曝光时间设置为1秒，B24处的曝光时间为0.5秒（显微镜 > 采集 > 采集设置 > 相机设置 和更改 曝光时间），并采集单个图像（显微镜 > 采集 > 采集模式 > 单 > 开始）。 通过FF图像对采集的镶嵌进行归一化（除以）以获得传输（值介于0和1之间）并保存归一化镶嵌（单击图像右侧右上角的第一个图标打开菜单>选择参考选项卡>单击单个参考并浏览特定的FF）。 准备收集X射线倾斜系列注意： 查找要成像的每个感兴趣区域的旋转轴。选择镶嵌中的区域以执行断层扫描，即在X射线马赛克贴图中放置一个具有FoV大小的正方形（单击图像窗口左侧的 “工具 ”）。注意： 选择区域时，请考虑与边框的距离（≥10 μm）和其他像元，以避免在旋转过程中像元重叠。此外，检查细胞的状况（预期的细胞形状，冰厚度，玻璃化成功，基准扩散等）。 旋转轴上的样品对齐注意： 报告的过程是迭代的。使用± 60° 角作为最大旋转角 （θM).如果无法触及，请使用尽可能接近± 60° 的角度。将相机设置为像素合并2，曝光时间为1 s（显微镜>采集>采集设置>相机设置“并更改曝光时间;更改合并;显微镜>采集>采集模式>连续>开始），将出口狭缝设置为5 μm。注意： 通过使用最小的出口狭缝孔径来尽可能减少剂量。 旋转0°时，使用样本X和样本Y平移移动到先前选择的区域，并专注于使用样本Z平移将细胞的特征放入旋转轴（运动控制 > 采样 并更改 样本x; 样本 y; 样本 z）。 将样品旋转到 + θM （运动控制 > 采样 并更改 样品 θ），并在单元格的特征上绘制一条线 （L+）（单击图像窗口右侧的线条工具按钮）以放在旋转轴上。 旋转至 -θM （运动控制 > 采样 并更改 样本 θ），然后在要放置在旋转轴上的单元格的特征上绘制一条线 （L-）（单击图像窗口右侧的线条工具按钮）。 在 +θM 或 -θM 处，使用样本 Z 平移将所选特征移动到两条线之间的中心位置（运动控制 > 样本 并更改 样本 Z）。 迭代地重复步骤 3.3.2.3 中的过程，直到达到 L+ 到 L- 的最小距离。注意： 与上一次迭代相比，两条线 L+ 和 L- 之间的距离应该更小。 在样本 θ = 0（运动控制 > 采样 并更改 样本 θ）时，移动样本 X 两倍于将所选特征置于两条线中心所需的距离（运动控制 > 采样 并更改 样本 X）。移动区域板 （ZP） X 以将特征带回 FoV 的中心（运动控制 > ZP 并更改 ZP X）。每个网格仅执行一次此步骤。 通过记录ZP Z焦点系列（不同ZP Z位置的图像集合，通常以0.3μm为步长）（显微镜 > 采集 > 采集设置 > 采集模式 > 焦点系列 > 开始）来重新优化ZP Z位置，并将ZP Z移动到样品聚焦的位置（运动控制 > 区域板 并更改 区域板z）。 设置倾斜系列采集的参数。注意： 最大角度范围最终受ZP焦距的限制（对于40 nm或25 nm ZP，分别为±70或±65度，对于平面样品，分别为25 nm ZP）。优化信噪比 （S/N） 和辐射损伤，以定义曝光时间。对于断层扫描，在不同的角度范围内使用不同的曝光时间。 确定最高旋转角度范围，以防在达到最大旋转角度之前发生阴影。 将相机合并设置为1（显微镜 > 采集 > 采集设置 > 相机设置 并更改 合并），在Mistral处将退出狭缝打开至15μm（运动控制 > XS 并更改XS），并将旋转设置为0°（运动控制 > 采样 并更改 样品θ）。 获取曝光时间为1 s的单个图像（显微镜 > 采集 > 采集设置 > 采集模式 > 单 > 开始“），并估计断层扫描的每个倾斜角度所需的曝光时间。 断层扫描采集 移动到负最大角度 +0.1（例如，对于 ZP 25 nm，转到 -65.1°）（运动控制 > 采样 并更改 样品 θ）。 将图像数量设置为角度总数（考虑到角度为0的图像）和角度范围（显微镜 > 采集 > 采集设置 > 采集模式 > 断层扫描 并更改图像数量;然后，更改 角度开始 和 角度结束）。 设置定义的曝光时间并开始采集（显微镜 > 采集 > 采集设置 > 相机设置“ ，更改 曝光时间 ，然后单击” 开始”）。 移动到FF位置（运动控制 > 采样 并更改 样本X;然后，更改 样本Y）并获取10张FF图像（显微镜 > 采集 > 采集模式 > 平均值 并更改图像数量，然后单击 “开始”）。注意： 在Mistral，当通过感兴趣的吸收边缘扫描能量时，获取投影时，可以进行光谱显微镜或能量依赖性显微镜。最终输出是一堆2D投影，其中每个像素中将包含X射线吸收光谱（XAS），即具有化学信息的图像。原则上可以将光谱学与断层扫描相结合扩展到3D。所需的总剂量可能是一个限制，然后可能需要特定的策略，如差异吸收成像。 4. 数据分析 注意：所有数据分析都是使用可用的开放软件和使用自动化管道开发的脚本完成的。 在米斯特拉尔 Pipeline将层析成像堆栈从txrm扩展（TXM软件扩展）转换为hdf5（开源分层数据格式），具有所有需要的元数据，然后通过FF平均值和机器电流对堆栈进行归一化，最后通过光学系统的测量点扩散函数对堆栈进行解卷，用于特定的菲涅耳区板（ZP）透镜和能量23，24.对于反卷积，找到适当的k = 1 / SNR值（取决于样品厚度）。对于在Mistral开发的脚本，键入命令： txrm2deconv“input tomo”“input FF” -zp=“ZP used” – e= “energy” – dx= “pixel size” – k= “ 1/SNR” – t=-1。 对于在Mistral开发的用于自动对齐的脚本，键入命令： ctalignxcorr“规范化反卷积堆栈.mrc”“规范化堆栈.hdf5”。注：许多软件应用程序可用于使用Au NP基准点25，26将投影对齐到公共旋转轴。投影的对齐需要亚像素精度。只有当Au NP基准点足够（>7）并在视野中很好地分布时，自动对准才能令人满意。通常需要手动对准 ， 以纠正自动对准，以实现尽可能高的精度。 要重建对齐的规范化堆栈，请使用几种可用算法中的任何一种。注意：可以使用加权背投 （WBP） 或同步迭代重建技术 （SIRT） 在几分钟内重建对齐的堆栈。然而，为了保持线性吸收系数（LAC），代数重构技术（ART）优选27。ART需要更多的计算时间，因此首先完成SIRT28 以进行快速自动对齐的倾斜序列重建（在几分钟内进行30次迭代）。一旦对齐令人满意，将使用ART。 在 B24 自定义构建的管道将 txrm 数据文件转换为具有所有所需元数据的标准 Tiffs，然后将其发送到批处理 runtomo 工作流，该工作流以三种方式处理数据集：WBP、SIRT 和修补程序。