염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

인간 간 키메라 마우스(21 )로부터의 조직 샘플링은 유럽 연합 지침 86/609/EEC에 따라 수행되었고, 헬싱키 선언의 원칙에 따라 함부르크 시 및 주의 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 1. 시약 준비 탈이온수에 1.25M 글리신 용액을 준비합니다. 0.22μm 기공 크기 필터가 있는 제균 필터. 4 °C에서 보관하십시오. 5M 염화나트륨(NaCl) 용액을 준비합니다. 실온에서 보관하십시오. CaCl2 용액 준비 : 탈 이온수에서 300 mM CaCl2 및 10 mM Tris-HCl pH 8. 0.22μm 기공 크기의 필터가 있는 멸균 필터로 RT에 보관합니다. 탈이온수에 10% Triton X-100 희석액을 준비합니다. RT에 보관하십시오. Tris-EDTA 완충액을 준비하십시오 : 탈 이온수에서 1 mM EDTA 및 10 mM Tris pH 8. 4 °C에서 보관하십시오. 필요한 양에 따라 다음 버퍼를 준비합니다.완충액 A를 준비하십시오 : 50 mM Hepes-KOH pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 10 % 글리세롤, 0.5 % NP-40 및 0.25 % 트리톤 X-100 탈 이온수. 0.22μm 기공 크기 필터가 있는 제균 필터. 4 °C에서 보관하십시오. 완충액 B를 준비합니다: 10mM Tris-HCl pH 8, 200mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5mM egtazic acid(EGTA). 0.22μm 기공 크기 필터가 있는 제균 필터. 4 °C에서 보관하십시오. 완충액 C를 준비한다: 탈이온수에서 1% SDS, 10 mM EDTA 및 50 mM Tris-HCl pH 8. 0.22μm 기공 크기 필터가 있는 제균 필터. RT에 보관하십시오. 염색질 희석 완충액을 준비합니다 : 0.01 % SDS, 1.1 % Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.6 mM Tris-HCl pH 8 및 166 mM NaCl 탈 이온수. 0.22μm 기공 크기 필터가 있는 제균 필터. 4 °C에서 보관하십시오. 2. 재료 준비 드라이 아이스, 얼음 및 액체 질소를 수집하십시오.주의 : 드라이아이스와 액체 질소는 화상을 입지 않도록 주의하여 다루십시오. 원심분리기를 4°C에서 사전 냉각합니다.참고: 이 단계는 염색질의 품질을 저하시키므로 세척 단계 동안 단백질 분해 및 가교 해제를 방지하는 데 중요합니다. 드라이 아이스에 멸균 접시를 넣고 식히십시오.알림: 플레이트가 절단 과정을 용이하게 할 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인하십시오. 100mm 페트리 플레이트/세포 배양 접시를 사용하는 것이 좋습니다. 글리신 1.25M의 필요한 부분 표본을 꺼내 RT에 도달하게하십시오. 완충액 A, B 및 PBS의 필요한 분취량을 꺼냅니다. 프로테아제 및/또는 탈아세틸화효소 및 포스파타제 억제제를 첨가하여 1배 농도에 도달하고 얼음 위에 둡니다. 버퍼 C의 필요한 부분 표본을 꺼내 RT에 남겨 둡니다. 지정될 때까지 프로테아제 및/또는 탈아세틸화효소 및 포스파타제 억제제를 추가하지 마십시오. RT PBS의 필요한 부분 표본을 꺼냅니다.주의: 버퍼 C에는 도데실황산나트륨(SDS)이 포함되어 있습니다. 버퍼를 준비할 때 적절한 안전 조치를 취하십시오.참고: SDS는 얼음에 침전되며 프로테아제와 탈아세틸라제 억제제는 RT에서 안정적이지 않습니다. 액체 질소를 챔버에 붓는 모르타르를 사전 냉각하고 공급 업체 지침을 엄격히 준수하십시오. 금속 유봉을 드라이아이스로 최소 5분 동안 식힙니다.참고 : 제안 된 모르타르에 대한 대체 모르타르를 사용할 수 있습니다. 그러나,이 프로토콜에 사용 된 장치는 독특한 구조로 인해 분쇄 과정에서 상당한 손실없이 소량의 조직으로 작업 할 수 있습니다. Dounce 균질화기를 관련 유봉 A와 함께 얼음 위에서 미리 식힙니다.알림: Pestle A는 균질화기와 헐렁하게 맞습니다. 이를 통해 현저한 세포 용해 없이 단일 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. 3. 조직 가교 메스와 핀셋을 사용하여 드라이 아이스에 접시에 직접 약 50mg의 냉동 조직을 자릅니다.알림: 메스를 RT에 두는 것이 절단 과정을 용이하게 하므로 권장됩니다. 메스에 너무 많은 압력을 가하면 조직 조각이 절단 영역 외부로 흩어질 위험이 증가하므로 피하십시오. 참고로 50mg의 조직(이 경우 간)은 약 500만 개의 세포를 생성해야 합니다. 따뜻한 칼날은 절삭날을 녹입니다. 그러나 조직 조각의 상대적으로 큰 크기를 고려할 때 이것은 제한된 효과를 가져야 합니다. 작은 조각을 자를 때 조직이 흩어지지 않도록 주의를 기울이면서 차가운 메스를 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 잘라낸 티슈를 드라이아이스로 식힌 1.5mL 튜브에 넣습니다. 조직 해동을 피하십시오. 조직이 들어있는 튜브를 박격포로 옮기고 5 분 동안 그대로 두십시오.알림: 샘플을 모르타르에 그대로 두면 온도가 낮아집니다(-80°C에서 -196°C로). 이것은 인성을 증가시키고 분쇄 단계를 더 쉽게 만듭니다. 더 이상 단단한 부스러기가 보이지 않을 때까지 미리 식힌 유봉을 사용하여 샘플에 압력을 가하십시오.알림: 과도한 회전력에 의한 유봉 가열은 샘플을 해동시키므로 피하는 것이 중요합니다. 모든 시료 분쇄 후 70% 에탄올(EtOH)로 유봉을 세척하고 드라이아이스에서 다시 식힙니다. 모르타르에서 샘플이 들어있는 튜브를 제거하고 필요한 억제제와 함께 얼음처럼 차가운 PBS 950 μL를 추가합니다. 샘플이 완전히 재현탁될 때까지 부드럽게 위아래로 피펫을 만듭니다. 즉시 3.6단계로 진행합니다. 조직 현탁액을 균질화기로 옮기고 유봉 A로 20-30회 도포하여 더 미세한 현탁액을 얻습니다. 거품을 피하십시오.참고: 스트로크 양은 조직 일관성에 따라 최적화되어야 합니다. 이 단계는 분쇄 후 얻어진 세포의 작은 클러스터를 추가로 해리시킨다. 부적절한 균질화는 전단 효율에 영향을 줄 수 있습니다. 균질액을 이미 얼음 위에서 미리 냉각된 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 4°C에서 1,300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거한다. 부드러운 피펫팅으로 950μL의 RT PBS에 펠릿을 완전히 재현탁하고 16% MeOH가 없는 FA 63.6μL를 추가하여 1% 최종 농도를 갖습니다. 즉시 3.10단계로 진행합니다.주의 : FA는 독성 화학 물질입니다. 적절한 안전 조치와 함께 흄 후드 아래에서 취급하십시오.참고: 불완전한 재현탁은 고정 단계에서 세포 응집을 유발할 수 있습니다. 이것은 용해와 전단 과정을 방해합니다. RT에서 10분 회전한 다음 즉시 3.11단계로 진행합니다.참고: 응집체를 피하기 위해 회전이 필요합니다. 고정에 필요한 시간은 관심 대상과 샘플 유형에 따라 최적화되어야 합니다. 과도한 고정 시간은 적절한 전단을 방해할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. RT에서 1.25M 글리신 113μL를 추가하여 125mM 최종 농도를 얻고 5분 동안 회전합니다.참고: 글리신은 과도한 가교를 피하면서 고정 반응을 완화합니다. 4 °C에서 3분 동안 1,300 x g 로 원심분리합니다. 상층액을 버리고 필요한 억제제와 함께 얼음처럼 차가운 PBS 950μL에 피펫팅하여 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다. 4 °C에서 3분 동안 1,300 x g 로 원심분리합니다. 3.13-3.14 단계를 반복하고 즉시 염색질 분리 단계로 진행합니다. 4. 염색질 분리 필요한 억제제와 함께 버퍼 A 950μL를 펠릿에 추가합니다. 펠릿이 완전히 재현탁될 때까지 피펫팅으로 부드럽게 혼합하고 4°C에서 10분 동안 회전합니다.참고: 이 단계는 핵 용해 없이 고정된 단일 세포 현탁액을 용해합니다. 이를 통해 세포질 단백질과 RNA 샘플을 제거 할 수 있습니다. 용해 시간을 연장하면 용해하기 어려운 세포에 도움이 될 수 있지만 조직의 처리 시간이 늘어납니다. 이 시점에서 트리판 블루/DAPI 염색 후 현미경으로 제제를 확인하여 클러스터의 크기와 단일 세포의 존재를 확인할 수 있습니다. 그러나 단일 핵은 고정된 조직 물질로 인해 인식하기가 쉽지 않을 수 있습니다. 4°C에서 5분 동안 2,000 x g 로 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 필요한 억제제와 함께 950 μL의 완충액 B를 펠릿에 첨가합니다. 펠릿이 완전히 재현탁될 때까지 피펫팅으로 부드럽게 혼합하고 4°C에서 10분 동안 회전합니다.참고: 이 단계는 더 이상의 바람직하지 않은 용해를 피하기 위해 핵 준비에서 용해 완충액을 씻어냅니다. 4 °C에서 5분 동안 2000 x g 에서 원심분리합니다. 한편, 완충액 C에 필요한 억제제(단계 2.5와 동일)를 추가합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 300 μL의 RT 버퍼 C를 펠릿에 넣고 세게 피펫팅합니다. 샘플을 15-30초 동안 소용돌이치고 튜브를 짧게 돌려 뚜껑에 방울을 모읍니다.알림: 이 단계는 고정된 핵을 유리하고 용해하는 데 중요합니다. 샘플 무결성을 보존하고 동시에 SDS 침전을 피하기 위해, 초음파 처리 전에 샘플을 9-11°C의 온도를 유지하기 위해 얼음 위에 보관된 플라스틱 랙에 보관한다. 5. 염색질 단편화 샘플을 3 개의 깨끗한 0.65 mL 초음파 인증 튜브로 옮겨 튜브 당 100 μL의 용해 된 핵 현탁액을 보장합니다.참고: 최대 부피가 300μL인 1.5mL 초음파 인증 튜브를 사용할 수 있습니다. 해당 튜브를 위한 특정 홀더가 필요합니다. 0.65mL는 튜브당 시료의 부피가 더 작기 때문에 더 균일한 전단을 제공해야 합니다. 30초 ON 및 30초 OFF 설정으로 고강도로 28주기 동안 염색질을 초음파 처리합니다. 초음파 처리기 수조가 제대로 냉각되었는지 확인하십시오 (얼음 또는 냉각 장치).참고: 이 단계는 거의 모든 경우에 최적화가 필요합니다. 사용자는 전단 시간을 늘리면 더 작고 균일한 조각이 제공된다는 점을 명심해야 합니다. 그러나 이것은 염색질 품질을 낮출 가능성을 증가시킬 수 있습니다. 필요한 조각 크기를 제공하는 가장 낮은 주기 수를 선택합니다. 이 단계를 최적화하는 동안 사이클 수가 대부분의 핵을 용해하기에 충분한지 확인하기 위해 핵 염색을 수행하는 것이 유용합니다. 초음파 처리 된 염색질을 이전에 얼음 위에서 식힌 새로운 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 30 μL의 Triton X-100 10 % 용액을 넣고 5-10 초 동안 와동합니다.참고: Triton X-100은 SDS에 결합하여 4°C에서 추가 침전을 방지합니다. Triton X-100의 최종 양은 항상 1 % 여야합니다. 4°C에서 15분 동안 16,000 x g 로 원심분리합니다. 상층액을 얼음 위에서 미리 식힌 깨끗한 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 알림: 상층액에는 전단된 염색질이 포함되어 있으며 투명하게 보여야 합니다. 펠릿에는 “전단할 수 없는” 받침대가 포함되어 있으며 매우 작게 유지되어야 합니다(간 조직의 경우 대부분 갈색). 전단 실패의 징후를 찾으십시오: 더 명확해지지 않은 염색질 용액과 4.5단계의 펠릿 치수와 유사합니다. 6. DNA 정제 전단된 염색질 10-25μL를 새 튜브로 옮기고 완충액 C를 추가하여 최종 부피 200μL에 도달합니다. 나머지 염색질은 나중에 사용할 때까지 -80°C에서 보관합니다. 필요한 경우 이 단계에서 절차를 중단하고 샘플을 -20°C에서 보관할 수 있습니다. 8 μL의 5 M NaCl을 첨가하고, 1000 rpm에서 진탕 하에 가열 블록에서 65 °C에서 적어도 6 시간 동안 인큐베이션한다.알림: 이 단계는 염색질을 가교 해제합니다. 가능하면 하룻밤 동안 가교 해제를 연장하는 것이 더 안전합니다. NaCl의 존재는 공정을 보다 효율적으로 만듭니다. 샘플을 RT에서 5분 동안 식히고 2μL의 RNase A를 추가합니다. 1000 rpm에서 진탕 하에 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 가열 블록에서 샘플을 제거하고 7μL의 300mMCaCl2 와 2μL의 Proteinase K를 추가합니다. 가열 블록을 56°C로 설정하고 1000rpm에서 진탕하면서 30분 동안 배양합니다. 한편, 4°C에서 1분 동안 16,000 x g 에서 원심분리하여 모든 샘플에 대해 하나의 상분리 튜브를 준비합니다.참고: 이 특수 튜브는 핵산 페놀-클로로포름 추출 중 상 분리를 더 쉽게 만듭니다. 가열 블록에서 튜브를 제거하고 RT에서 3분 동안 평형을 이루도록 합니다. 400 μL의 시료를 이전에 원심분리된 상분리 튜브로 옮깁니다. 400μL의 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올 용액(PCI)을 넣고 5초 동안 소용돌이칩니다.주의: PCI는 휘발성 및 독성이 강한 화합물입니다. 흄 후드 아래에서 필요한 안전 조치와 함께 취급하십시오. 4°C에서 5분 동안 16,000 x g 로 원심분리합니다. 400 μL의 클로로포름을 넣고 5 초 동안 와류합니다.주의 : 클로로포름은 휘발성이 높고 독성이 강한 화합물입니다. 흄 후드 아래에서 필요한 안전 조치와 함께 취급하십시오.참고: 이 단계는 다운스트림 PCR 응용 프로그램을 방해할 수 있는 페놀 잔류물을 씻어냅니다. 4°C에서 5분 동안 16,000 x g 로 원심분리합니다. 상부 상 400μL를 새로운 1.5mL 튜브로 옮기고 24μL의 5M NaCl과 0.75μL 글리코겐을 첨가했습니다. 잠깐 소용돌이. 1,055 μL의 100% EtOH를 첨가하고 완전히 소용돌이칩니다. 적절한 혼합을 확인하십시오. -80°C에서 1시간 동안 또는 -20°C에서 하룻밤 동안 배양합니다(ON).참고: 이 단계는 전단된 DNA를 침전시킵니다. 수율을 최대화하려면 ON 배양을 선택하는 것이 좋습니다. 4°C에서 30분 동안 16,000 x g 로 원심분리합니다. 펠릿이 탈구되지 않도록 주의하면서 상등액을 조심스럽게 제거합니다. 차가운 70% EtOH 500μL를 추가합니다. 펠릿이 씻겨지도록 튜브를 부드럽게 기울입니다.참고: 이 단계는 핵산과 함께 침전되었을 수 있는 염 잔류물을 제거하는 데 필수적입니다. 염은 다른 다운스트림 응용 프로그램을 방해할 수 있습니다. 4°C에서 15분 동안 16,000 x g 로 원심분리합니다. 전체 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 RT에서 건조시킵니다.알림: 37°C의 가열 블록에서 튜브를 배양하면 건조에 필요한 시간이 단축됩니다. 50 μL의 Tris-EDTA 용액(TE-Buffer)을 첨가하고, 300 rpm에서 진탕 하에 5-10분 동안 37°C에서 가열 블록에 튜브를 넣었다.알림: 이 단계는 펠릿 용해를 보장합니다. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있으며 샘플을 4°C에서 최대 1주일 동안 보관하거나 -20°C에서 장기간 보관할 수 있습니다. 1 % 아가로스 겔에서 DNA 분석을 수행하십시오. 7. DNA 크기 분석 실행 완충액 (즉, 트리스-아세테이트-EDTA (TAE) 또는 트리스-보레이트-EDTA (TBE)) 당 1 g의 아가로스를 혼합하여 1% 아가로스 겔을 제조한다. 아가로스가 완전히 용해 될 때까지 현탁액을 가열하십시오. 겔 용액을 붓기 전에 아가로스 용액 100mL마다 EtBr 10μL을 추가합니다.주의: EtBr은 발암성으로 알려진 DNA 삽입제입니다. 흄 후드 아래에서 필요한 안전 조치와 함께 취급하십시오.참고: EtBr 염색(젤에 직접 또는 실행 후)을 강력히 권장합니다. 다른 DNA 삽입 염료는 DNA 도말 작업을 할 때 우리 손에서 잘 작동하지 않았습니다. 좁은 로딩 웰은 넓은 로딩 웰과 비교할 때 더 나은 해상도를 제공합니다. 10 μL의 시료를 2 μL의 6x 로딩 염료와 혼합합니다. 다음으로, 겔에 10 μL의 샘플을 로드하고 로딩 염료의 마지막 밴드가 겔의 2/3에 대해 실행될 때까지 실행합니다. DNA 사다리를 추가해야 합니다. 젤을 이미지화하고 스미어 크기가 원하는 적용 범위에 속하는지 확인합니다.염색질이 품질 관리를 통과하면 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다.