חיסון של רטינות הר שלם עם שיטת ניקוי רקמת בהירות
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להתאים את שיטת הבהירות של רקמות המוח עבור רטינות הר שלם כדי לשפר את האיכות של כתמים אימונוהיסטוכימיים סטנדרטיים הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים ברשתית ואת המבנים התת תאיים שלהם.
Abstract
שיטת ההזיה הידרוג’ל רקמה (CLARITY), שפותחה במקור על ידי מעבדת Deisseroth, שונתה בשימוש נרחב עבור immunostaining והדמיה של דגימות מוח עבות. עם זאת, טכנולוגיה מתקדמת זו עדיין לא שימשה עבור רטינות הר שלם. למרות הרשתית היא שקופה חלקית, עובי של כ 200 מיקרומטר (בעכברים) עדיין מגביל את החדירה של נוגדנים לתוך הרקמה העמוקה, כמו גם הפחתת חדירת אור להדמיה ברזולוציה גבוהה. כאן, התאמנו את שיטת הבהירות עבור רשתית עכבר הר שלם על ידי פילמור אותם עם מונומר אקרילאמיד כדי ליצור הידרוג’ל nanoporous ולאחר מכן לנקות אותם נתרן דודקיל סולפט כדי למזער את אובדן החלבון ולמנוע נזק לרקמות. רשתיות מעובדות בהירות היו immunostained עם נוגדנים עבור נוירונים ברשתית, תאי גליה, וחלבונים סינפטיים, רכוב בתמיסת התאמת אינדקס שבירה, ודימוי. הנתונים שלנו מראים כי CLARITY יכול לשפר את האיכות של כתמים אימונוהיסטוכימיים סטנדרטיים והדמיה עבור נוירונים ברשתית ותאי גליה בהכנה לכל ההר. לדוגמה, רזולוציה תלת-ממדית של מבנים דקים דמויי אקסון ודנדריטי של תאי אמקרין דופאמין השתפרה בהרבה על ידי CLARITY. בהשוואה לרטינות לא מעובדות של הרכבה שלמה, CLARITY יכולה לחשוף חיסונים לחלבונים סינפטיים כגון חלבון בצפיפות פוסט-סינפטית 95. התוצאות שלנו מראות כי CLARITY הופך את הרשתית לשקופה יותר מבחינה אופטית לאחר הסרת השומנים ומשמר מבנים עדינים של נוירונים ברשתית וחלבונים שלהם, אשר ניתן להשתמש בהם באופן שגרתי להשגת הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים ברשתית ומבנים תת-תאיים שלהם בהכנה לכל ההר.
Introduction
הרשתית החולייתנית היא אולי החלק הנגיש ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS), והיא משמשת מודל מצוין לחקר ההתפתחות, המבנה והתפקוד של המוח. חמישה סוגים של נוירונים ברשתית מופצים בשלוש שכבות גרעיניות המופרדות על ידי שתי שכבות plexiform. השכבה הגרעינית החיצונית (ONL) מורכבת מצלמי פוטורצפטורים קלאסיים (מוטות וקונוסים) הממירים אור לאותות חשמליים. אותות חשמליים מעובדים על ידי נוירונים בשכבה הגרעינית הפנימית (INL), כולל תאים דו קוטביים, אופקיים ואמקרין, ולאחר מכן מועברים לתאי גנגליון ברשתית (RGCs) בשכבת תא הגנגליון (GCL). RGCs הם נוירוני הפלט של הרשתית, כאשר האקסונים מקרינים למוח לתרום לתפקוד חזותי יוצר תמונה ולא יוצר תמונה. בנוסף, שלושה סוגים של תאי גליה (תאי מולר, אסטרגליה ומיקרוגליה) מספקים חומרים מזינים לנוירונים ומגנים על נוירונים מפני שינויים מזיקים בסביבה החוץ-תאית שלהם.
תת-אוכלוסין מיוחד אחד של תאי אמקרין מייצר ומשחרר דופמין, נוירומודולטור חשוב במערכת העצבים המרכזית, מגדיר מחדש מעגלים עצביים ברשתית במהלך הסתגלות אור1,2. לתאי אמקרין דופאמין (DACs) יש תכונה ייחודית של פרופילים מורפולוגיים. הסומטה שלהם ממוקמים INL proximal עם דנדריטים ramifying בחלק הדיסטלי ביותר של שכבת plexiform הפנימית (IPL). תהליכים דמויי אקסון של DACs הם unmyelinated, רזה וארוך, מסועף בדלילות, לשאת varicosities (האתרים של שחרור דופמין). הם יוצרים מקלעת צפופה עם דנדריטים ב- IPL, כולל מבנים דמויי טבעת סביב הסומטה של תאי אמקרין AII. האקסונים גם לרוץ דרך INL לכיוון OPL, יצירת מסלול צנטריפוגלי על פני הרשתית3. הוכחנו כי תהליכי DAC מבטאים קולטנים בתגובה לשחרור גלוטמט מתאי עצב פרה-קוטביים, כולל תאים דו קוטביים ותאי גנגליון רשתית רגישים באופן מהותי (ipRGCs)4,5,6. עם זאת, לא ברור אם קולטני גלוטמט מבטאים על האקסונים, הדנדריטים, או שניהם מכיוון שהם מנותקים בקטעי רשתית אנכיים ולא ניתן להבחין ביניהם5,6. חיסון צריך להתבצע ברשתיות הר שלם כדי לחשוף הסתעפות תלת מימדית של DACs ואת נוכחותם של קולטני גלוטמט על תאים תת תאיים. למרות הרשתית היא שקופה יחסית, עובי של רשתית הר עכבר כולו הוא כ 200 מיקרומטר, אשר מגביל את החדירה של נוגדנים לתוך הרקמה העמוקה, כמו גם מפחית חדירת אור להדמיה ברזולוציה גבוהה עקב פיזור אור רקמה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, התאמנו את שיטת ההידרוגל התואמת לרקמות (CLARITY) שפותחה לאחרונה עבור מקטעי מוח עבים לרטינות עכבר הר שלם7.
שיטת CLARITY פותחה במקור על ידי מעבדת Deisseroth עבור immunostaining והדמיה של דגימות מוחעבות 7. הוא משתמש בחומר ניקוי חזק, נתרן דודציל סולפט (SDS) ואלקטרופרזה כדי להסיר את רכיבי השומנים (הגורמים לפיזור אור רקמות), ומשאיר את החלבונים וחומצות הגרעין במקומם. השומנים שהוסרו מוחלפים בפיגום שקוף המורכב ממונומרים הידרוג’ל כגון אקרילאמיד לתמיכה במבנה החלבון הנותר. ניתן לתייג את הרקמה המנוקה באמצעות אימונוהיסטוכימיה ולצלם אותה עם עומק חדירת אור מוגבר באופן משמעותי דרך הרקמה (עד כמה מילימטרים מתחת לפני השטח של הרקמה). מאז, שיטת CLARITY עברה אופטימיזציה ופישוט על ידי מספר קבוצות מחקר8,9,10. פרוטוקול CLARITY שונה משתמש בטכניקת סליקה פסיבית כדי למנוע את הנזק האפשרי לרקמות המיוצר על ידי אלקטרופורזה לניקוי המוח כולו ואיברים שלמים אחרים11. עם זאת, שיטה זו עדיין לא הוחלה על רשתית הר שלם. כאן, התאמנו את טכניקת הבהירות הפסיבית עבור רטינות הר שלם כדי להפוך אותם שקופים יותר עבור אימונוהיסטוכימיה והדמיה. מצאנו כי רוב החלבונים ברשתית שנבדקו נשמרו במהלך תהליך זה עבור אימונוהיסטוכימיה. באמצעות פתרון התאמת אינדקס שבירה, הצלחנו לדמיין נוירונים ברשתית על פני עובי של כ 200 מיקרומטר מן ONL ל- GCL ברשתית הרכבה שלמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שינוי פרוטוקול CLARITY עבור רשתית הרכבה שלמה.
פישטנו את פרוטוקול CLARITY כדי להשיג פולמור הולם ללא צורך בפינוי ואקום או תא ייבוש, כפי שנעשה ברוב המחקריםהקודמים 7,9,11. תהליך הפולמליזציה מעוכב על ידי חמצן, הדורש כי המדגם להיות מבודד מהאוו…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לבינג יה, ניית’ן ספיקס והאו ליו על התמיכה הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי למענקי בריאות EY022640 (D.-Q.Z.) ופרס מחקר הסטודנטים של אוניברסיטת אוקלנד (E.J.A.).
Materials
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
- Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
- Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).
- Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
- Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332 (2013).
- Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
- Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).
