JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bio-ingénierie

Open-Source miniatuurfluorimeter om real-time isotherme nucleïnezuurversterkingsreacties te monitoren in resource-beperkte instellingen

Published: February 03, 2021
doi:
10.3791/62148
, , , , , , ,
1Department of Bioengineering,Rice University

Summary

Gedetailleerde instructies worden gegeven om een open-source, modulaire fluorimeter te bouwen die compatibel is met veel goedkope kachels om real-time, kwantitatieve isotherme nucleïnezuurversterking uit te voeren.

Abstract

Traditionele methoden om nucleïnezuren te detecteren en te kwantificeren zijn afhankelijk van polymerasekettingreactie (PCR) en vereisen het gebruik van dure thermocyclers met geïntegreerde fluorescentiedetectie van amplicons. Isotherme nucleïnezuurversterkingstechnologieën elimineren de noodzaak van thermische cycli; fluorescentiegebaseerde detectie van producten is echter nog steeds vereist voor realtime, kwantitatieve resultaten. Verschillende draagbare isotherme kachels met geïntegreerde fluorescentiedetectie zijn nu in de handel verkrijgbaar; de kosten van deze apparaten blijven echter een belangrijke belemmering voor wijdverbreide acceptatie in omgevingen met beperkte middelen. Hier wordt een protocol beschreven voor het ontwerp en de assemblage van een modulaire, goedkope fluorimeter gemaakt van kant-en-klare componenten. De fluorimeter is ingesloten in een compacte 3D-geprinte behuizing en is ontworpen om bovenop een in de handel verkrijgbaar warmteblok met een PCR-buis te worden geplaatst. De hier beschreven fluorimeter is geoptimaliseerd om fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) kleurstof te detecteren, maar het systeem kan worden aangepast voor gebruik met kleurstoffen die vaak worden gebruikt als verslaggevers in realtime nucleïnezuurversterkingsreacties. De klinische toepasbaarheid van het systeem wordt aangetoond door real-time nucleïnezuurdetectie uit te voeren met twee isotherme versterkingstechnologieën: recombinasepolymeraseversterking (RPA) voor detectie van positief controle-DNA in een commerciële kit en omgekeerde transcriptielusgemedieerde isotherme versterking (RT-LAMP) voor detectie van klinisch betekenisvolle niveaus van SARS-CoV-2 RNA.

Introduction

Isotherme versterkingstechnologieën worden veel gebruikt voor de detectie van nucleïnezuren. In vergelijking met traditionele PCR-benaderingen die thermocycling vereisen, maakt isotherme versterking het mogelijk om nucleïnezuurversterking bij één temperatuur te laten plaatsvinden, waardoor snellere time-to-results en een betere tolerantie van remmers1,2mogelijk zijn . Een ander belangrijk voordeel vanotherme versterking is de verminderde instrumentatiecomplexiteit. De meeste isotherme versterkingsreacties vereisen alleen een warmteblok en een detectiemodaliteit – ofwel real-time detectie via fluorescentiebewaking of eindpuntdetectie, bijvoorbeeld door laterale stroom of gelelektroforese3,4. Real-time fluorescentiedetectie wordt bereikt door de detectie van fluorescentie geproduceerd door intercalerende kleurstoffen die activeren in aanwezigheid van dubbelstrengs DNA of gedoofde fluorescentiesondes die activeren in aanwezigheid van specifieke dubbelstrengs DNA-sequenties.

Hoewel commercieel verkrijgbare benchtop isotherme fluorimeters bestaan, missen velen maatwerk voor assay implementatie. Veel apparaten vereisen bijvoorbeeld specifieke of door het bedrijf geleverde verbruiksartikelen, bevelen voorkeursleveranciers aan of gebruiken bedrijfseigen software om geadverteerde resultaten te verkrijgen. De meeste van deze systemen kosten meer dan $ 5.000 USD, wat een aanzienlijke barrière vormt voor wijdverspreid gebruik in omgevingen met beperkte middelen. Bovendien worden gebruikers in omgevingen met weinig middelen geconfronteerd met uitdagingen om apparatuur te onderhouden die is ontworpen voor omgevingsinstellingen met hoge hulpbronnen als gevolg van zware omgevingsomstandigheden, zwakke toeleveringsketens voor reserveonderdelen en gespecialiseerde gereedschappen die nodig zijn voor onderhoud en reparatie5. Om aan deze behoefte te voldoen, wordt hier het ontwerp en de assemblage beschreven van een modulaire en goedkope fluorimeter die is opgebouwd uit kant-en-klare componenten in een compacte 3D-geprinte behuizing (figuren 1A–C) met twee optionele configuraties. De eerste configuratie van dit apparaat maakt gebruik van in de handel verkrijgde glasfilters en een dichroïsche spiegel om overtollig achtergrondlicht te blokkeren en heeft een totale montagekosten van $ 830 USD. Hoewel deze filters vaak worden gebruikt in op fluorescentie gebaseerde beeldvormingssystemen, is eerder aangetoond dat het vervangen van dure hoogwaardige optische filterfolies nucleïnezuurdetectie mogelijk maakt6. De tweede configuratie van de fluorimeter bevat deze goedkope filters en vervangt de dichroïsche spiegels door φ1/2″ beam splitters, waardoor de totale kosten van het systeem van $ 830 tot $ 450 USD worden verminderd.

Representatieve afbeeldingen van de assemblage worden weergegeven voor de eerste configuratie in figuur 1 en figuur 2, maar analoge afbeeldingen voor de tweede configuratie zijn te vinden in Aanvullend bestand 6. Om de noodzaak van gespecialiseerde optische uitlijning te voorkomen, heeft het optische systeem gebieden aangewezen om elk optisch onderdeel te plaatsen en kan het worden gemaakt met een relatief low-end 3D-printer, waardoor het ontwerp op grote schaal kan worden gebruikt. De enige verschillen in constructie en assemblage voor de twee configuraties zijn de bestanden die worden gebruikt voor 3D-printen en de optische componenten die in de behuizing worden geplaatst. De externe afmetingen van de 3D-geprinte behuizing voor beide systemen zijn hetzelfde. Tabel 1geeft een kostenvergelijking van de twee systemen weer .

Zoals getoond in figuur 1A,om een kleine vormfactor te behouden, bestaat de fluorimeter uit Φ1/2″ (~ 12,5 mm) optica, gekoppeld aan compacte verlichting en detectie die worden geplaatst om het signaal door de bovenkant van de PCR-buis te meten. Het systeem in figuur 1 is ontworpen om kleurstoffen met piekopwekkering en emissiegolflengten in de buurt van respectievelijk 490 nm en 525 nm te detecteren, met inbegrip van FITC en nauw verwante kleurstoffen zoals SYBR en SYTO-9, die vaak worden gebruikt als verslaggevers in real-time nucleïnezuurversterkingsreacties7,8. De excitatiebron, optische filters en detector kunnen gemakkelijk worden vervangen door componenten die compatibel zijn met verschillende fluorescerende kleurstoffen naar wens. Nucleïnezuurversterkingsreacties worden meestal uitgevoerd in PCR-buizen en de fluorimeter is ontworpen om bovenop elk in de handel verkrijgbaar warmteblok te worden geplaatst dat PCR-buizen (figuur 1D) bevat, waardoor isotherme reacties in realtime kunnen worden gecontroleerd. Geschikte warmteblokken zijn beschikbaar in de meeste biomedische laboratoria en kunnen worden gekocht voor minder dan $ 500 USD.

Het gebruik van single-board computers om een goedkoop, point of care alternatief te bieden voor het besturen van beeldvormingstechnologieën is eerder aangetoond9. Voortbouwend op dat werk wordt in dit protocol een grafische gebruikersinterface met één bordcomputer (figuur 1D) gebruikt om realtime gegevensregistratie en weergave van resultaten op het punt van zorg te vergemakkelijken, waardoor een laptopcomputer geen gegevens hoeft te verwerken of visualiseren. Fluorescentiemetingen werden via het I2C-protocol overgebracht van de lichtsensoren naar een microcontroller en vervolgens via seriële communicatie beschikbaar gesteld aan de single-board computer. Elektrische aansluitingen voor verlichting en gegevensoverdracht werden geleverd door vereenvoudigde bedrading en solderen op geminiaturiseerde breadboards, waardoor de noodzaak van gespecialiseerde printplaten (PCB’s) werd ontkend. De software die nodig is om de fluorimeter uit te voeren, is beschikbaar via open-source softwareframeworks en de code die nodig is om het apparaat uit te voeren, wordt geleverd in de aanvullende coderingsbestanden. De complete fluorimeter kan worden geassembleerd voor tussen de $ 450 en $ 830 USD, en de resultaten laten zien dat het nauwkeurige en betrouwbare fluorescentiemetingen biedt om real-time isotherme versterking van nucleïnezuren te controleren.

Protocol

1. Voorbereidingsstappen: 3D-printen en solderen OPMERKING: Het optische systeem dat in dit protocol wordt beschreven, is ontworpen voor een standaard droge blokverwarming. Om de eerste configuratie te maken, drukt 3D de CAD-bestanden af die respectievelijk als aanvullende bestanden 1, 2 en 3 worden geleverd: Als u de tweede configuratie wilt maken, drukt u de CAD-bestanden af die worden geleverd als respectievelijk aanvullende bestanden 3, 4 en 5:OPMERKING: Deze onderdelen zijn ontworpen om met steunen te worden afgedrukt. In deze gids wordt een zwart polycarbonaat filament gebruikt dat zijn vorm kan behouden na te zijn blootgesteld aan temperaturen tot 110 °C. Over het algemeen kan elk materiaal dat kan worden verwarmd tot de temperatuur van de gewenste isotherme reactie zonder significante vervorming worden gebruikt. Om het effect van interne reflecties en interferentie van omgevingslicht te minimaliseren, wordt een materiaal met een zwarte of een andere donkere kleur aanbevolen. Bereid de twee licht-naar-digitale sensorevaluatiemodules voor voor parallelle bewaking van twee monsters. Verwijder op een van de sensortestborden de R4-weerstand en soldeer een jumperdraad van de rechterschijf van het R4-gebied op de printplaat naar de bovenste pad in het R1-gebied op de printplaat. Hierdoor verandert het I2C-adres van de sensor, waardoor beide sensoren gelijktijdig kunnen worden meten.OPMERKING: De gebruikte sensor bestaat uit twee PCB’s: een USB-adapterkaart en een sensortestbord met de lichtsensor; alleen het sensortestbord is nodig voor dit apparaat. Soldeerdraden aan elk van de twee Light Emitting Diodes (LED’s). Sluit een rode draad (positief) aan op de pad met het label “1” op de LED en een zwarte draad (negatief) op de pad met het label “2” op de LED. Breng een dun laagje thermische lijm aan op de achterkant van de LED, plaats de LED op de bovenkant van een einddop en wacht tot de thermische lijm uithard. Voeg aan de andere kant van de eindkap een koellichaam toe.OPMERKING: Wanneer u de LED’s test voordat ze in de behuizing worden verzegeld, zorg er dan voor dat u een goede blauwlichtblokkering van de oogbescherming draagt. Om de tweede configuratie te maken, snijdt u twee cirkels met een diameter van 1/4 inch uit een blauw excitatiefolievel en vier cirkels met een diameter van 1/4 inch uit een gele emissiefolieplaat met een schaar of een scheermesje. Druk een M2,5-insteekstuk in elk van de vier gaten op het schuine gedeelte van het onderdeel ‘LCD_Screen_Holder.stl’. 2. Optische montage Plaats een 3/16-inch lange 4-40 schroefdraadinzetstuk in het gat aan de bovenkant van het ‘Optics_Enclosure_Bottom.stl’-onderdeel. Plaats een 1/4-inch lange 4-40 schroefdraadinzetstuk in alle andere gaten van het 3D-geprinte onderdeel zoals weergegeven in figuur 2A. Plaats de sensortestplaat in de bovenste holte van de behuizing, met de vijf pinnen naar boven gericht en het dichtst bij de middelste as van het apparaat. Bevestig met een 3/16-inch lange 4-40 schroef door het gat op de sensortestkaart (Afbeelding 2B). Plaats een van de lenzen met brandpuntsafstand van 20 mm in het gedeelte onder de sensortestkaart met de bolle zijde naar de onderkant van het apparaat en weg van het testbord (afbeelding 2C). Om de eerste configuratie te maken, plaatst u het long pass filter in het volgende gedeelte onder de 20 mm brandpuntsafstandslens (figuur 2D) die in de vorige stap is geplaatst. Om de tweede configuratie te maken, plaatst u twee gele emissiefilterfolies in het gedeelte onder de lens. Om de eerste configuratie te maken, plaatst u de dichroïsche spiegel in het diagonale gedeelte in de buurt van het midden van de omhulsel terwijl u de door de fabrikant opgegeven filterrichting in acht houdt (Afbeelding 2E). Als u de tweede configuratie wilt maken, plaatst u de bundelsplitser in de diagonale sectie. Er is geen specifieke oriëntatie nodig voor de bundelsplijter. Plaats een tweede lens met brandpuntsafstand van 20 mm in het gedeelte onder de dichroïsche spiegel (of straalsplijter, afhankelijk van de configuratie) met de bolle zijde naar de bovenkant van het apparaat gericht (afbeelding 2F). Om de eerste configuratie te maken, plaatst u het excitatiefilter in de sectie rechts van de dichroïsche spiegel en zorgt u ervoor dat de pijl naar de dichroïsche spiegel wijst (Figuur 2G). Om de tweede configuratie te maken, plaatst u één blauwe excitatiefilterfolie in de sectie rechts van de bundelsplijter. Plaats de 15 mm brandpuntsafstandslens rechts van het excitatiefilter met de bolle zijde naar de dichroïsche spiegel gericht (Afbeelding 2H). Plaats een LED in het resterende gedeelte van de afdruk, met de LED naar de dichroïsche spiegel (of balksplijter, afhankelijk van de configuratie). Zorg ervoor dat de twee draden die van de LED leiden in de verzonken kanalen worden gestoken, zodat de afdruk goed sluit. Herhaal stap 2.3-2.9 voor de andere kant van het 3D-geprinte onderdeel (Afbeelding 2I). Sluit de lege zijde van de afdruk bovenop de afdruk met de optische componenten door de geëxtrudeerde delen van de bovenste helft van de omhulsel in de verzonken groeven van de onderste helft van de omhulsel te plaatsen. Bevestig de twee bedrukte delen samen met 3/8-inch lange 4-40 schroeven(afbeelding 2J).OPMERKING: Als de twee afgedrukte delen niet volledig gesloten zijn, kan verdwaald excitatielicht uit de optische behuizing ontsnappen. Zorg ervoor dat de juiste blauwlicht blokkerende oogbescherming wordt gedragen totdat een goede afdichting is bereikt. Herseal de behuizing totdat er geen overtollig licht ontsnapt. 3. Elektronica en touchscreen montage Verbind de twee mini breadboards met elkaar en plaats de microcontroller op een van de breadboards. Zorg ervoor dat de microUSB-poort van de microcontroller naar buiten gericht is. Om LED-modulatie aan te sluiten, sluit u de CTL-pin van de LED -driver (+) aan op een digitale pin van de microcontroller en de LED (-) pin van de LED-driver op een GND-pin van de microcontroller. Verwijder de plastic hoezen aan de achterkant van de breadboards. Druk de zelfklevende achterkant van de breadboards op het 3D-geprinte deel om de gecombineerde breadboards aan de binnenkant van het achterste gedeelte van het ‘LCD_Screen_Holder.stl’-geprinte deel te bevestigen. Bevestig de lcd-schermhouder (liquid crystal display) met de gemonteerde breadboards erin aan de optische behuizing die in sectie 2 is gemonteerd met 4-40 schroeven van 4-40 inch. Om de LED-voeding aan te sluiten, sluit u de LED-pin (+) van de LED-driver aan op de positieve draad van de eerste LED. Sluit de negatieve draad van de eerste LED aan op de positieve draad van de tweede LED op het breadboard. Sluit de negatieve draad van de tweede LED aan op de LED (-) pin van de LED driver.OPMERKING: De volgorde van de eerste of tweede LED is willekeurig. Om de LED driver voeding aan te sluiten, sluit u de positieve en negatieve draden van de 10 V voeding aan op respectievelijk de VIN+ en VIN-pinnen van de LED driver. (Er is een loopaansluiting naar een twee-pins adapter gebruikt.) Sluit de voeding en gegevensoverdracht van de sensortestkaart aan. Er worden slechts vier pinnen op het sensortestbord gebruikt: de SCK, SDA, VDUT en GND. Neem een 4-pins vrouwelijke naar mannelijke jumperdraad en sluit die pinnen op de licht-naar-digitale sensortestborden aan op het mini breadboard door de opening in de rechterbovenhoek van de LCD Holder print. Zorg er op het breadboard voor dat er verbindingen zijn tussen de volgende: de 3,3 V-pin van de microcontroller en de VDUT-pin van beide testborden; de GND-pen van de microcontroller en de GND-pen van beide testborden; de analoge 4 (A4) pin van de microcontroller en de SDA pin van beide test boards; en de analoge 5 (A5) pin van de microcontroller en de SCK pin van beide test boards.OPMERKING: Omdat I2C-communicatie wordt gebruikt voor de lichtsensoren, kunnen de SCK- en SDA-pinnen van beide sensoren beide naar dezelfde pinnen van de microcontroller worden gerouteerd. Bevestig de single-board computer met vier M2,5 schroeven op de LCD-schermhouder. Zorg ervoor dat de HDMI- en voedingsadapterpoorten van de single-board computer naar boven zijn gericht en dat de single-board computer is gecentreerd op het 3D-geprinte deel. Sluit het touchscreen-display aan op de single-board computer volgens de touchscreen-instructies en sluit vervolgens de HDMI-poort van de single-board computer aan op de HDMI-poort van het touchscreen. 4. Software-installatie Installeer en gebruik de webredactie om de aangepaste schets “MiniFluorimeter_2Diode.ino” in Supplemental Coding File 1 op de microcontroller te uploaden. Zorg ervoor dat de “ClosedCube OPT3002”-bibliotheek is geïnstalleerd met behulp van Bibliotheekbeheer. Wijzig de variabele led_A_pin in het nummer van de digitale pin die wordt gebruikt in stap 3.3 (sectie Elektronica en touchscreen). Pas het aantal milliseconden aan dat de LED is ingeschakeld bij het verkrijgen van fluorescentiemetingen door de waarde van de variabele ExposureTime te wijzigen. Pas het aantal milliseconden tussen LED-belichtingen aan door de waarde van de variabele led_A_Interval te wijzigen. Verander de variabele led_Power in een getal tussen nul en één om de helderheid van de LED’s tijdens belichtingen aan te passen. Nul geeft de maximale hoeveelheid helderheid en één geeft de laagste hoeveelheid helderheid. Schakel de mogelijkheid in om het scherm via het touchscreen te bedienen door de instructies van de fabrikant op te volgen die bij het 3,5-inch scherm zijn geleverd.OPMERKING: Indien gewenst kan het 3,5-inch scherm worden gebruikt als een monitor zonder touchscreenmogelijkheden en kunnen een toetsenbord en muis worden aangesloten op de USB-poorten van de single-board computer voor de bediening van de single-board computer. Download het bestand “MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py” van Supplemental Coding File 2 naar een gewenste locatie op de single-board computer. Zorg ervoor dat een werkende versie van Python is geïnstalleerd op de single-board computer . Python 3.7 werd gebruikt in de meegeleverde Python-module, maar elke stabiele Python-versie kan worden gebruikt met de juiste wijzigingen in het opgegeven script. Installeer de bibliotheken die nodig zijn voor het Python-programma op de single-board computer. Wijzig de variabele measurement_time in de gewenste tijdsduur om metingen uit te voeren. De aanwinst wordt beëindigd en wordt gesloten nadat de gewenste tijd is verstreken. Met de GUI kan de acquisitie ook worden beëindigd via een knop op de gebruikersinterface. Wijzig de variabele serialPort in het seriële adres van de aangesloten microcontroller. 5. Real-time fluorescentiegegevens opnemen Schakel het commerciële warmteblok in en laat het de gewenste temperatuur bereiken. Voorziet de single-board computer van een standaard 5 V voeding voorzien van de meeste single-board computer aankopen. Sluit de single-board computer aan op de microcontroller met een microUSB naar USB kabel. Open met behulp van het aanraakscherm het meegeleverde Python-script. Wijzig de variabelen measurement_time en serialPort in de gewenste waarden. Wijzig de variabele outputFilepath in de naam van het gegevensbestand dat het programma genereert. Zorg ervoor dat de bestandsnaam eindigt op ‘.xlsx’. Plaats twee PCR-buizen met de te controleren reacties in het hitteblok. Zorg ervoor dat de plaatsing van de PCR-buizen in lijn is met de optische kanalen van de fluorimeter zodra deze op het warmteblok is geplaatst. Plaats de fluorimeter bovenop het warmteblok met de PCR-buizen gecentreerd tussen de vier pinnen die uit elk optisch kanaal van de fluorimeter extruderen. Voor optimale metingen moet u ervoor zorgen dat de 3D-geprinte fluorimeter stevig in de putten van het warmteblok wordt bevestigd. Bevestig de fluorimeter stevig, sluit de voedingsadapter voor de LED’s aan. Gebruik het aanraakscherm om het Python-programma te starten. Een grafische gebruikersinterface (GUI) verschijnt op het LCD-scherm en meet de realtime fluorescentie. Observeer de real-time fluorescentiemetingen in de loop van de tijd voor beide PCR-buizen die aan de gebruiker op de GUI worden getoond. Nadat de door de gebruiker bepaalde experimenteertijd is verstreken, stopt de acquisitie. De metingen weergeven in het uitvoergegevensbestand dat is opgeslagen op de door de gebruiker gedefinieerde locatie. Om de metingen vroegtijdig te beëindigen, klikt u op de knop met het label “Stop Acquisitie” in de gebruikersinterface.

Representative Results

Eenmaal geassembleerd, kunnen de prestaties van de fluorimeter worden gevalideerd door fluorescentie te meten uit een verdunningsreeks FITC-kleurstof. In figuur 3Aworden metingen van FITC-kleurstof bij concentraties van 0, 20, 40, 60 en 80 pg/μL, bereid in 1x PBS, op beide kanalen van de eerste configuratie van de fluorimeter weergegeven. Elk monster werd driemaal gemeten met een LED-blootstelling van 1,5 s met tussenpozen van 20 s. Beide kanalen van de fluorimeter vertonen een lineaire respons over het gewenste bereik. De klinische toepasbaarheid van de fluorimeter werd verder aangetoond door het systeem samen met een in de handel verkrijgbaar droog warmteblok te gebruiken om versterking uit te voeren met twee isotherme versterkingstechnologieën: RPA en RT-LAMP. Figuur 3B toont de tijdsverloop van fluorescentie bij aanvang, gemeten tijdens een versterking van 39 °C, van 50 μL real-time RPA-positieve en negatieve controlereacties voor kitpositief controle-DNA, geleverd in een standaard commerciële kit en bereid volgens de instructies van de fabrikant. RPA-reacties, die een relatief laag niveau van fluorescentie produceren, werden gemeten met behulp van de eerste configuratie van de fluorimeter die een betere onderdrukking van excitatielicht bereikt. Figuur 3C toont de tijdsverloopmeting van een aangepaste RT-LAMP-test bij 65 °C met behulp van de N2-, E1- en As1e-primersets beschreven door Zhang et al10, en Rabe en Cepko11. RT-LAMP-reacties produceren een grotere hoeveelheid fluorescentie en werden gemeten met behulp van de tweede, goedkopere fluorimeterconfiguratie. Oligonucleotiden werden gekocht en geresuspendeerd in 2x TE-buffer bij een concentratie van 1 mM. Forward inner primer (FIP) en backward inner primer (BIP) oligo’s werden besteld met high performance vloeistofchromatografie zuivering. Elke primerset (N2, E1 en As1e) werd gecombineerd tot 1000 μL van een 25x mix als volgt: 40 μL FIP, 40 μL BIP, 5 μL F3, 5 μL B3, 10 μL LF, 10 μL LB en 890 μL 1x TE buffer. Om elke RT-LAMP-reactie te monteren, werd 1 μL van elke primerset toegevoegd aan 0,5 μL 50x fluorescerende kleurstof en 12,5 μL 2x mastermix en werd het reactievolume volgens de instructies van de fabrikant tot 20 μL met nucleasevrij water gebracht. De SARS-CoV-2 RNA Control werd serieel verdund in nucleasevrij water tot concentraties van 10, 100 of 1.000 kopieën per μL, en 5 μL werden toegevoegd voor een totaal reactievolume van 25 μL. De no target control (NTC) die in alle experimenten werd gebruikt, was nucleasevrij water. RT-LAMP-reacties werden overseld met 25 μL minerale olie van moleculaire biologiekwaliteit. RPA- en RT-LAMP-reacties werden geassembleerd in twee putten van een 0,2 ml low-profile 8-tube PCR-strip en afgetopt met ultracleaire platte doppen. Elke RPA- en RT-LAMP-reactie werd in drievoud uitgevoerd. In alle tests kwantificeerde de minifluorimeter met succes de temporele toename van fluorescentieniveaus geassocieerd met DNA-versterking. Figuur 1: Optische behuizing en gemonteerde miniatuurfluorimeter bovenop het warmteblok. (A) Diagram van optische behuizing met optische componenten geplaatst in één detectiekanaal. (B) Schema van de eerste configuratie van de miniatuurfluorimeter na montage. (C) Foto van de optische behuizing met optische componenten in één detectiekanaal geplaatst. (D) Foto van geassembleerde miniatuurfluorimeter geplaatst bovenop een in de handel verkrijgbaar warmteblok. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 2: Montage- en elektrisch bedieningsschema van de miniatuurfluorimeter. A-J) Stapsgewijze plaatsing van de optische componenten in de 3D-geprinte optische behuizing voor de eerste systeemconfiguratie. (K) Elektrisch schema van de miniatuurfluorimeter voor beide configuraties. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 3: Representatieve metingen verkregen met de miniatuurfluorimeter. (A) Gemeten fluorescentie versus FITC-kleurstofconcentratie in beide kanalen toont lineaire respons over het gewenste dynamische bereik. (B) Real-time fluorescentie versus tijd voor isotherme versterking van positieve en negatieve controles van een in de handel verkrijgbaar pakket. Versterking vindt plaats zoals verwacht voor de positieve controle. (C) Real-time fluorescentie versus tijd voor isotherme versterking van 50, 500 en 5000 kopieën van SARS-CoV-2 RNA en een NTC-monster van een aangepaste RT-LAMP-test. Versterking vindt plaats zoals verwacht in de buurt van de detectiegrens van de test. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Systeem 1 Systeem 2 item hoeveelheid Totale prijs (USD) hoeveelheid Totale prijs (USD) Optische componenten Lenzen 6 158.14 6 158.14 Spiegels 2 244.56 2 60 Optische filters 4 200 6 5 Subtotaal 602.7 Subtotaal 223.14 Verlichting en detectie Leds 2 72.62 2 72.62 LED-stuurprogramma 1 11.49 1 11.49 Fotodiode 2 50 2 50 Subtotaal 134.11 Subtotaal 134.11 Elektronica en display Arduino Nano 1 20.7 1 20.7 Framboos Pi 1 35 1 35 LCD-scherm 1 25 1 25 Mini Breadboard 1 4 1 4 10V voeding 1 8.6 1 8.6 Subtotaal 93.3 Subtotaal 93.3 Totale kosten (USD) 830.11 450.55 Tabel 1: Kostenvergelijking van de twee configuraties van de miniatuurfluorimeter. Aanvullend bestand 1: System1_Optics_Enclosure_Top.stl Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 2: System1_Optics_Enclosure_Bottom.stl, en klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 3: LCD_Screen_Holder.stl Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 4: System2_Optics_Enclosure_Top.stl Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 5: System2_Optics_Enclosure_Bottom.stl, en klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend dossier 6: System2_BuildInstructions.pdf Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend coderingsbestand 1: MiniFluorimeter_2Diode.ino Klik hier om dit coderingsbestand te downloaden. Aanvullend coderingsbestand 2: MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py Klik hier om dit coderingsbestand te downloaden.

Discussion

Hier beschreven is een open-source, goedkope, modulaire, draagbare fluorimeter voor kwantitatieve fluorescentiedetectie van isotherme versterkingsreacties. Open-source projecten vergemakkelijken snel en goedkoop onderhoud met direct beschikbare vervangingsonderdelen en bieden gebruikers de flexibiliteit om het systeem aan te passen aan hun behoeften op basis van modulair ontwerp. Dit protocol beschrijft het proces van het assembleren van mechanische, optische en elektrische componenten en het valideren van optische prestaties. Bovendien werd de flexibiliteit van de fluorimeter aangetoond om twee verschillende soorten isotherme versterkingstesten met aanzienlijk verschillende temperatuur-, volume- en fluorescentievereisten, RPA exo en RT-LAMP, te controleren. RPA wordt uitgevoerd bij 39 °C in 50 μL-reacties die gebruikmaken van een sequentiespecifieke FAM-gelabelde sonde voor fluorescentiegeneratie, terwijl RT-LAMP wordt uitgevoerd bij 65 °C in een reactievolume van 25 μL en een intercalerende kleurstof gebruikt om de aanwezigheid van het versterkte DNA te melden. Omdat fluorescentiemetingen worden uitgevoerd via de bovenkant van PCR-buizen met platte doppen, kan de fluorimeter fluorescentie detecteren van beide testvolumes en worden de warmtevereisten alleen beperkt door het gekozen commerciële warmteblok. Bovendien is de fluorescentie-intensiteit geproduceerd in RT-LAMP bijna in de orde van grootte groter dan die geproduceerd in RPA, als gevolg van de op kleurstof versus sonde gebaseerde methoden voor het genereren van fluorescentiesignaal. Het dynamische bereik van de gekozen optische sensor kan echter zowel de signalen detecteren als kwantificeren, en basislijnaftrekkingsalgoritmen houden rekening met deze verschillen om betrouwbare fluorescentiemetingen te produceren.

Om de verspreiding van technologie te vergemakkelijken en potentiële onderhoudskosten te minimaliseren, werd een modulair ontwerp gebruikt dat compatibel is met kachels die op grote schaal beschikbaar zijn in verschillende omgevingen. In het huidige protocol werd een gewone droge blokverwarming gebruikt; hetzelfde optische en elektrische ontwerp kan gemakkelijk worden aangepast voor andere in de handel verkrijgde kachels. Als een andere droge blokverwarming moet worden gebruikt, zijn minimale wijzigingen in het ontwerp van de 3D-behuizing vereist. In het bijzonder moeten de onderste pinnen van de STL-bestanden van de optische behuizing worden gewijzigd om een goede uitlijning met de putten van andere commerciële warmteblokken te garanderen. Hoewel de behuizingen in de voorbeelden zijn afgedrukt op een relatief low-end 3D-printer (zie tabel met materialen),moet ervoor worden gezorgd dat de printerresolutie en/of afdruktoleranties voldoende zijn om de optische componenten en schroefdraadinzetstukken te huisvesten. In de meegeleverde STL-bestanden werd een tolerantie van 0,01-0,02 inch toegevoegd aan weerszijden van de optische componenten in de radiale en axiale richtingen op basis van de door de fabrikant opgegeven afmetingen. Dit zorgt ervoor dat alle optische componenten goed in de print passen en dat de behuizing overtollig licht volledig blokkeert om binnen te komen of te ontsnappen. Om een goede persmontage voor de schroefdraadinzetstukken te garanderen, werd een vergelijkbare tolerantie van 0,01-0,02 inch afgetrokken van de door de fabrikant geleverde diameter in het CAD-bestand.

RPA-reacties werden met succes gemonitord met behulp van de eerste fluorimeterconfiguratie, terwijl RT-LAMP-reacties met beide configuraties konden worden gemonitord. De verbeterde afstoting van het strooilicht van de eerste configuratie was noodzakelijk om de lage fluorescentieniveaus te controleren die door de fluorogene sonde in RPA-reacties werden geproduceerd. RT-LAMP maakt daarentegen gebruik van een intercalerende kleurstof voor signaalgeneratie, wat resulteert in een hogere fluorescentie-intensiteit die compatibel is met het lagere dynamische bereik van de tweede configuratie met behulp van fotografische filterfolies. Gebruikers moeten de fluorimeterconfiguratie selecteren die overeenkomt met het fluorescentiesignaal dat element-intercalerende kleurstof of fluorogene sonde van hun test genereert.

Een beperking van dit systeem is dat verwarming wordt geleverd door een in de handel verkrijgbaar warmteblok dat wordt aangedreven door een standaard stopcontact. Dit systeem zou verder kunnen worden ontwikkeld voor gebruik in gebieden zonder betrouwbare toegang tot elektriciteit door draagbare en oplaadbare accu’s op te nemen, zoals blijkt uit andere groepen12. Een andere beperking is de relatief lage doorvoer van het systeem, waardoor gelijktijdige fluorescentiemeting van slechts twee monsters tegelijk mogelijk is. Meerdere afdrukken van de behuizing kunnen bovenop hetzelfde warmteblok worden geplaatst om de doorvoer te verhogen; de gebruikte lichtsensor heeft echter slechts vier unieke I2C-adressen. Dit beperkt het maximum aantal monsters dat tegelijkertijd kan worden gemeten tot vier. Een andere lichtsensor met een groter aantal unieke I2C-adressen is nodig om de doorvoer verder te verhogen.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Speciale dank aan Chelsey Smith, Megan Chang, Emilie Newsham, Sai Paul en Christopher Goh voor hun hulp bij de monstervoorbereiding. De auteurs danken Caroline Noxon voor de herziening van het manuscript. De financiering van dit werk werd door USAID verstrekt door het Amerikaanse volk via een IAVI-onderzoeksbeurs CCID 9204 in het kader van de toekenning van AID-OAA-A16-00032 tussen IAVI en USAID.

Materials

1/4-inch-long 4-40 threaded insert McMaster-Carr 90742A116 Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together.
10v power supply GlobTek, Inc. WR9HU1800CCP-F(R6B) AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W
15 mm focal length lens Thorlabs LA 1074 Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination.
1-inch-long 4-40 screws McMaster-Carr
20 mm focal length lens Thorlabs LA 1540 Four total are used for the fluorimeter.
2x WarmStart LAMP Master Mix New England Biolabs, Inc E1700 Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C
3.5” Touch Screen Uctronics BO10601
3/16-inch-long 4-40 screw McMaster-Carr 90128A105
3/16-inch-long 4-40 threaded insert McMaster-Carr 90742A115 Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure
3/8-inch-long 4-40 screws McMaster-Carr 90128A108 Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together.
3D printer filament 3D Universe UMNFC-PC285-BLACK Black or another dark color preferred
3D printer used Ultimaker Ultimaker 2+
8-tube PCR strips BioRad #TLS0801
Advanced Mini Dry Block Heater VWR International 10153-320 The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU
barrel jack to two-pin adapter SparkFun Electronics 1568-1238-ND
Blue Excitation Filter Foil LEE LE071S Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different filters.
Blue LED – 460 nm Mouser LZ1-30DB00-0100 Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts
Dichroic Mirror Thorlabs DMLP505T Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts
Emission Filter Edmunds Optics OG-515 Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source.
Excitation Filter Omega Filters 490AESP Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts
LED Driver LEDdynamics 3021-D-I-700
M2.5 Hex Shaped insert McMaster-Carr 91292A009 Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder
Microcontroller Arduino Nano
Mini Breadboard Adafruit 65
Molecular biology-grade mineral oil Sigma Aldrich 69794
OPT3002EVM – Light-to-Digital Sensor Texas Instruments OPT3002EVM: Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device. 
Purchased oligonucleotides Integrated DNA Technologies
RPA kit positive control DNA TwistDx Limited CONTROL01DNAE
SARS-CoV-2 RNA Control Twist Biosciences MN908947.3
Single board computer Raspberry Pi Raspberry Pi 3
TwistAmp RPA exo kit TwistDx Limited TAEXO02KIT
Ultraclear flat caps BioRad #TCS0803
Yellow Emmission Filter Foil LEE LE767S Selected for use with FITC – other fluorescent dyes may require different parts
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications. Clinical Chemistry. 62 (7), 947-958 (2016).
  2. Yan, L., et al. Isothermal Amplified Detection of DNA and RNA. Molecular BioSystems. 10 (5), 970-1003 (2014).
  3. Giuffrida, M. C., Spoto, G. Integration of Isothermal Amplification Methods in Microfluidic Devices: Recent Advances. Biosensors and Bioelectronics. 90, 174-186 (2017).
  4. Gill, P., Ghaemi, A. Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-A Review. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 27 (3), 224-243 (2008).
  5. Richards-Kortum, R., Oden, M. Devices for Low-Resource Health Care. Science. 342 (6162), 1055-1057 (2013).
  6. Katzmeier, F., et al. A Low-Cost Fluorescence Reader for in vitro Transcription and Nucleic Acid Detection with Cas13a. PLOS One. 14 (12), e0220091 (2019).
  7. Safavieh, M., et al. Emerging Loop-Mediated Isothermal Amplification-Based Microchip and Microdevice Technologies for Nucleic Acid Detection. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (3), 278-294 (2016).
  8. Monis, P. T., Giglio, S., Saint, C. P. Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for Real-Time Polymerase Chain Reaction and Investigation of the Effect of Dye concentration on Amplifcation and DNA Melting Curve Analysis. Analytical Biochemistry. 340 (1), 24-34 (2005).
  9. Parra, S., et al. Development of Low-Cost Point-of-Care Technologies for Cervical Cancer Prevention Based on a Single-Board Computer. IEEE Journal of Translational Engineering in Health and Medicine. 8 (4300210), (2020).
  10. Zhang, Y., et al. Enhancing Colorimetric Loop-Mediated Isothermal Amplification Speed and Sensitivity with Guanidine Chloride. Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).
  11. Rabe, B. A., Cepko, C. SARS-CoV-2 Detection Using an Isothermal Amplification Reaction and a Rapid, Inexpensive Protocol for Sample Inactivation and Purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24450-24458 (2020).
  12. Snodgrass, R., et al. A Portable Device for Nucleic Acid Quantification Powered by Sunlight, a Flame or Electricity. Nature Biomedical Engineering. 2 (9), 657-665 (2018).

Tags

Keyword Extraction:Open-sourceMiniatureFluorimeterIsothermalNucleic Acid AmplificationResource-limited SettingsMolecular DiagnosticsIsothermal AmplificationOptics EnclosureTest BoardFocal Length LensLong Pass FilterEmission FilterDichroic MirrorBeam SplitterExcitation FilterLED

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Coole, J., Kortum, A., Tang, Y., Vohra, I., Maker, Y., Kundrod, K., Natoli, M., Richards-Kortum, R. Open-Source Miniature Fluorimeter to Monitor Real-Time Isothermal Nucleic Acid Amplification Reactions in Resource-Limited Settings. J. Vis. Exp. (168), e62148, doi:10.3791/62148 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image