Protokollen beskriver hvordan man oppnår stedsstyrte modifikasjoner i genomet til Anopheles malaria mygg ved hjelp av φC31-systemet . Modifikasjoner beskrevet inkluderer både integrasjon og utveksling av transgene kassetter i genomet av attP-bærende dokkinglinjer.
Funksjonell genomisk analyse og relaterte strategier for genetisk kontroll av malaria er avhengig av validerte og reproduserbare metoder for å nøyaktig modifisere genomet til Anopheles mygg. Blant disse metodene tillater φC31-systemet presis og stabil stedsstyrt integrasjon av transgenes, eller erstatning av integrerte transgene kassetter via rekombininasemediert kassettutveksling (RMCE). Denne metoden er avhengig av virkningen av Streptomyces φC31 bakteriofage integrase for å katalysere rekombinasjon mellom to spesifikke festesteder utpekt attP (avledet fra phage) og attB (avledet fra vertsbakterien). Systemet bruker ett eller to attP-anlegg som tidligere er integrert i mygggenomet og attB-stedet(e) i donormalen DNA. Her illustrerer vi hvordan man stabilt modifiserer genomet til attP-bærende Anopheles-dokkinglinjer ved hjelp av to plasmider: en attB-merket donor som bærer integrasjons- eller utvekslingsmalen og en hjelperplasmid som koder φC31-integrasen. Vi rapporterer to representative resultater av φC31-mediert stedsstyrt modifikasjon: den enkle integrasjonen av en transgen kassett i An. stephensi og RMCE i An. gambiae mygg. φC31-mediert genommanipulering gir fordelen av reproduserbart transgene uttrykk fra validerte, fitnessnøytrale genomiske steder, noe som muliggjør komparative kvalitative og kvantitative analyser av fenotyper. Integreringens stedsstyrte karakter forenkler også valideringen av enkeltinnsettingsstedet og paringsordningen betydelig for å oppnå en stabil transgen linje. Disse og andre egenskaper gjør φC31-systemet til en viktig komponent i det genetiske verktøysettet for transgenisk manipulering av malaria mygg og andre insektvektorer.
Evnen til å modifisere genomet av myggvektorer av sykdommer pålitelig og reprodusert har styrket in vivo funksjonell validering av gener og åpnet dørene for realiserbare genetiske vektorkontrollstrategier, for eksempel de som er rettet mot Anopheles mygg som overfører malaria1.
Tidlig mygggenomredigering stolte utelukkende på transponerbart element (TE)-mediert transformasjon, med piggyBac som den mest brukte transposonen i Anopheles2,3,4. Te-integrasjonens tilfeldige karakter kan imidlertid føre til uønskede modifikasjoner som genutslag (innsettingsmutagenese) og signifikante posisjonseffekter på transgene uttrykk5,6,7,8. Flere innsettinger er også en vanlig forekomst når du bruker piggyBac5,9, noe som gjør valideringen og isolasjonen av transgene linjer med enkle innsettinger arbeidskrevende. Andre ulemper inkluderer deres potensielle remobilisering, som observert i bakterien av Anopheles stephensi når de gir en kilde til piggyBac transposase10,11,12, og deres begrensede størrelse på DNA-last (10-15 kb i lengde) med transformasjonseffektivitet avtagende med økende størrelse på donor plasmid13,14.
Stedsstyrte integrasjonsmetoder ble introdusert for å omgå disse problemene. Den vanligste stedsstyrte genommodifiseringen i mygg er den mediert av φC31-systemet (figur 1a). Dette er drevet av en viral integrase som katalyserer rekombinasjonen mellom to heterospesifikke festesteder (att) som forekommer naturlig i genomet til bakteriofage φC31 (attP) og i Streptomyces bakterievert (attB)15. Rekombinasjon av de to anleggene er enveis og resulterer i dannelse av hybridsteder (attL og attR). Rekombinasjonen av slike hybridsteder (som fører til DNA-eksisjon) ville kreve ikke bare tilstedeværelsen av en aktiv viral integrase, men også en annen phage-kodet rekombinasjonsfaktor16,17. Et stabilt integrasjonssted genereres dermed som avlaster spørsmålet om potensiell uønsket remobilisering15. Videre tillater systemet integrering av store last (f.eks. integrering av > 100 kb konstruksjoner ble rapportert i D. melanogaster18), noe som øker bæreevnen betydelig. Integrasjon skjer i et enkelt forhåndsdefinert genomisk locus som i stor grad forenkler valideringen av innsetting og parringsplanen for å oppnå en stabil transgen linje. Til slutt tillater integreringens stedsstyrte natur normalisering av uttrykk ettersom alternative transgenes ligger i samme locus og derfor reguleres innenfor samme nærliggende genomiske kontekst. Faktisk er en av de viktigste anvendelsene av teknikken den direkte sammenligningen av fenotyper som er gitt av forskjellige transgenes etter innsetting i et identisk locus.
Å oppnå φC31-mediert integrasjon innebærer to faser: fase I er opprettelsen av transgene dokkinglinjer som bærer attP-anlegg(er), og fase II er den stedsstyrte integrasjonen av en attB-flankert last i genomet til dokkinglinjen19. Opprettelsen av fase I-dokkinglinjer har stolt på TE-mediert tilfeldig integrasjon av attP-taggede konstruksjoner og involverte dermed en innledende arbeidskrevende prosess (inkludert sørlige flekker og omvendte PCR-analyser på en-kvinnelig avkom) for å isolere og validere transgene linjer som bærer en enkelt integrasjonshendelse i unike, transkripsjonelt aktive og fitness nøytrale genomiske steder. Likevel er flere dokkinglinjer for φC31-mediert enkeltintegrasjon utviklet og validert i An. gambiae19,20,21,22 og i An. stephensi23,24,25 (Tabell 1). Hver av disse linjene varierer når det gjelder den genomiske plasseringen av dokkingstedet og den belastningsspesifikke genetiske bakgrunnen, og fra dem kan et stort utvalg av nye transgene linjer opprettes. Den komplekse valideringen av TE-medierte integrasjoner for produksjon av forankringslinjer kan nå omgås av CRISPR/Cas9-teknologien26. Dette er imidlertid avhengig av at forkunnskapene om nøytral loci målrettes og deres omkringliggende sekvenser.
φC31-mediert integrasjon har blitt brukt mye på insektgenomredigering fra modellorganismen D. melanogaster27, til myggene Aedes aegypti13,28, Ae. albopictus29, An. gambiae19 og An. stephensi24, samt andre insekter, inkludert Ceratitis capitata30 og Bombyx mori31.
En begrensning av φC31-mediert integrasjon, spesielt i lys av potensielle feltutgivelser for vektorstyring, er integrasjonen i mygggenomet til hele attB-bærende donorplasmid, inkludert uønskede sekvenser som antibiotikaresistensgenmarkører og plasmid ryggradskomponenter av bakteriell opprinnelse. For å løse dette ble det implementert en modifikasjon av standardsystemet, rekombininasemediert kassettutveksling (RMCE), som gjør det mulig å erstatte en tidligere integrert transgen kassett med et nytt donor-DNA (figur 1b). Dette oppnås ved å bruke to inverterte attsteder som flankerer donor- og mottakerkassettene i hver ende, noe som driver to uavhengige rekombinasjonshendelser til å finne sted samtidig som det resulterer i kassettutveksling uten integrering av den plasmide ryggraden. Denne forbedrede designen omgår integreringen av uønskede sekvenser og utvider bruken av φC31-systemer til å omfatte for eksempel integrering av umerkede DNA-last ved å screene for tap av en tidligere integrert fluorescerende markør32.
RMCE ble oppnådd først med D. melanogaster32 og senere brukt med hell på ikke-modell insekter, inkludert An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34 og B. mori35. Flere forankringslinjer for RMCE er utviklet og validert i An. gambiae5,9,26 (tabell 1). Så vidt vi vet, er RMCE ennå ikke utforsket i andre Anopheles vektorarter.
Til dags dato har φC31-systemet blitt brukt mye i Anopheles mygg for å introdusere og studere en rekke molekyler, inkludert antimalaria effektorer19,24,36, komponenter i GAL4 / UAS-systemet for å overekspressere og knockdown gener for insektmiddelresistensstudier9,33, regulatoriske elementer, reportergener5,21,37, og gen-drive elementer26 ,38.
Denne protokollen beskriver hvordan man utfører 1) stedsstyrt integrasjon av en attB-flankert last og 2) RMCE av en konstruksjon flankert av inverterte attB-steder i genomet til Anopheles docking linjer. Dette oppnås ved å bruke to plasmider: en donor attB-merket plasmid som bærer transgene av interesse, og en hjelper plasmid som uttrykker φC31 integrase. De store malariavektorene An. gambiae og An. stephensi brukes som spesifikke eksempler, men disse protokollene gjelder for andre Anopheles-arter .
Figur 1. Stedsstyrte genommodifikasjoner, enkel integrasjon og rekombininasemediert kassettutveksling (RMCE) , ved hjelp av φC31-systemet. φC31 integrase (INT, grå dobbeltpil) katalyserer rekombinasjonen mellom attB-stedet (lilla stripet) som er tilstede i en donorplasmid og attP-stedet (blå stripet) som er tilstede i en mottakende dokkinglinje, noe som resulterer i dannelse av hybridsteder attL og attR. A) Integrasjon oppnås når enkelt attB– og attP-anlegg rekombinerer og resulterer i tilstedeværelse av to integrerte markører (blå og rød). B) RMCE oppstår når to attB / P-anlegg rekombinerer samtidig og resulterer i utskifting av kassetten mellom attstedene på dokkinglinjen (blå markør) med det som bæres av donorplasmid (rød markør). C) Delvise nukleotidsekvenser av attP (blå) og attB (lilla) og hybridstedene attL/R. Rekombinasjon skjer mellom ‘TT’-kjernesekvensene uthevet i fet svart. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Den nøyaktige utformingen av attB-taggede plasmider som er kompatible med den valgte dokkinglinjen, er avgjørende for suksessen til eksperimentet. Det må tas nøye hensyn til valget av markøren som brukes til screening av transformanter, inkludert fluorescensfargen og uttrykksmønsteret, som vil være underlagt mønsteret som allerede finnes i dokkinglinjen. Det er nødvendig å bruke fluorescerende markører som lett kan skilles fra hverandre: gode markørkombinasjoner inkluderer RFP (rød)/CFP (cyan), RFP (rød)/GFP (grønn), RFP (rød)/YFP (gul) og YFP (gul)/CFP (cyan), mens kombinasjoner som skal unngås er YFP (gul)/GFP (grønn) og CFP (cyan)/GFP (grønn). 3xP3 promotør39, spesifikk for øynene og nerveledningen, er den mest brukte til å drive uttrykket av fluorescerende markører for myggtransgenese. Faktisk bruker alle Anopheles-dokkinglinjene som for øyeblikket er tilgjengelige denne promotoren. Alternative regulatoriske regioner er det av An. gambiae polyubiquitin gen (PUBc)5 eller viral promotør IE120, som driver uttrykk i flere vev. Når de brukes sammen med 3xP3, vil disse promotorene utvide de mulige fargekombinasjonene og til og med bruken av samme fluorofor. De angitte promotorene er aktive gjennom hele mygglivssyklusen, slik at screening og fluorescensovervåking i alle livsstadier. En ekstra vurdering under plasmiddesign er størrelsen på lasten som skal integreres eller byttes. Mens φC31-systemet har bemerkelsesverdig bæreevne18, bør det vurderes at størrelsen på donorplasmid generelt korrelerer negativt med transformasjonseffektivitet22.
I den beskrevne protokollen er kilden til integrase en hjelperplasmid som uttrykker enzymet allestedsnærværende40. Den allestedsnærværende tilstedeværelsen av integrasen kan føre til transformasjon av somatiske celler hvis mikroinjeksjoner ikke akkurat er rettet mot området der bakterien dannes. Mens slike transformasjonshendelser vil gå tapt, da de ikke er arvelige, kan somatiske effekter redusere kondisjonen til injiserte individer. For å unngå dette og øke transformasjonseffektiviteten, kan integraseuttrykk begrenses til bakterien, for eksempel ved å bruke vasapromotoren22,26. Andre protokoller beskriver bruken av in vitro transkribert messenger RNA (mRNA) som kilde til φC31 integrase19,24,43. Dette innebærer imidlertid den arbeidskrevende forberedelsen av mRNA og krever nøye håndtering av injeksjonsblandingen og bruk av RNase frie reagenser for å unngå nedbrytning. Plasmid kilder til integrase har blitt demonstrert i både An. gambiae9,21,22,26,33,37 og An. stephensi (A.A. personlig kommunikasjon) for å være pålitelig og føre til effektiv transformasjon, og er dermed vårt foretrukne alternativ. Et annet alternativ for integrase levering er dens in vivo produksjon i selv-docking hjelper linjer. Slike linjer ble opprettet i An. gambiae som uttrykker φC31 integrase under regulering av de germline-spesifikke promotor nanos og ble funnet å føre til en forbedret overlevelse og transformasjon effektivitet20. Imidlertid må potensielle treningsbelastninger pålagt av in vivo-produksjonen av integrase-enzymet på hjelpelinjen vurderes.
Som med andre transgene teknikker, må spesiell forsiktighet reserveres til oppdrett og kryssing av individer som stammer fra injiserte embryoer for å maksimere sjansene for å gjenopprette transformanter. Personer som har stabilt arvet transgene kan først gjenopprettes ved G1-avkom. Imidlertid kan tidlige tegn på potensiell transformasjon evalueres ved tilstedeværelse av forbigående episomalt uttrykk for fluorescerende markør i anal papillen og / eller nerveledningen til G0 første og andre instar larver når du bruker 3xP3 promotor43. Mens tilstedeværelsen av forbigående fluorescens antyder vellykket plasmid levering, garanterer det ikke arvelig bakterietransformasjon. På samme måte utelukker ikke mangelen på forbigående uttrykk vellykket transformasjon. Likevel har det blitt observert at forbigående positive individer er mer sannsynlig å gi forbigående avkom sammenlignet med forbigående negative 43,48. I eksperthender kan oppdrett og kryssing av bare positive individer være et alternativ for å redusere myggtall. Men gitt viktigheten og skjørheten til små G0 larver, er minst mulig manipulasjon fortsatt tilrådelig, og oppdrett av alle G0-individer anbefales alltid.
Paringsordningen som rapporteres i denne protokollen, er utformet for å maksimere sjansen for parring og isolere uavhengige transformasjonshendelser. Men hvis insektplass eller personelltilgjengelighet er et problem, kan G0 voksne samles etter kjønn i enkeltbur hvis nok motsatte kjønn blir gitt. Et slikt oppsett vil ikke tillate diskriminering mellom flere transformasjonshendelser som forekommer hos personer fra samme bur. Avhengig av det eksperimentelle oppsettet forventes tilstedeværelsen av en dobbel (enkel integrasjon) eller enkel (RMCE) markør under screeningprosessen. I enkeltintegrasjonseksperimenter er det viktig å verifisere tilstedeværelsen av den opprinnelige markøren fra forankringslinjen, mens i RMCE er viktig å verifisere tapet av den tidligere integrerte markøren. Faktisk er det ikke uvanlig i RMCE-design å gjenopprette transformanter der enkeltintegrasjon i stedet for utveksling skjedde på grunn av rekombinasjonen av et enkelt attP-nettsted9,33. I slike individer er både fluorescerende markører til stede, så vel som hele donorplasmid ryggraden som fremhever viktigheten av å gjennomføre en grundig screening for begge fluorescerende markører.
Mens tilstedeværelsen av forventede fluorescensmønstre indikerer vellykket transformasjon, må molekylær karakterisering av innsettingsstedet utføres. For å gjøre dette er utarbeidelsen av nøyaktige kart over det predikerte innsettingsbrødet, inkludert de flankende genomiske områdene i dokkinglinjen, avgjørende for utformingen av tilstrekkelige diagnostiske oligonukleotidprimere for genforsterkningsanalyser. Enkeltintegrasjonshendelser resulterer i dannelse av attR – og attL-hybridsteder i krysset mellom det nylig integrerte DNA-et og den tidligere innsatte kassetten. Disse områdene kan målrettes mot validering av innsettingsområde. I RMCE-design kan innsetting av donorkassetten forekomme i to alternative orienteringer med hensyn til det genomiske locus, og dermed kan fire primere brukes i alternative PCR-kombinasjoner for å oppdage hvilken orientering linjen bærer. Ettersom orienteringen av kassettinnsetting kan påvirke transgene uttrykk, er det i komparativ genuttrykksanalyse viktig å bruke linjer som har samme innsettingsretning.
Når du arbeider med lavt antall transformanter, kan det ikke være ønskelig å ofre hele individer for molekylær analyse. Et alternativ til dette er å gjennomføre molekylær analyse på DNA ekstrahert fra single voksen ben46 som bentap påvirker ikke en voksen kvinnelig evne til å mate og oviposit49. Det er imidlertid fare for å skade individet i prosessen med fjerning av ben. Suksess har blitt oppnådd ved hjelp av kasserte pupal tilfeller (L. Grigoraki personlig kommunikasjon), men den sikreste tilnærmingen er å utføre molekylær analyse på G2 foreldre etter å ha fått levedyktig G3 avkom.
De siste årene har CRISPR/Cas9 revolusjonert måten å utføre stedsspesifikk genomredigering på26,41,50,51. I motsetning til stedsstyrt RMCE, er CRISPR/Cas9-medierte genintegrasjoner (knock-ins) uavhengige av tilstedeværelsen av forhåndsinnsatt rekombinasjonssteder med bare en ett-trinns transformasjonshendelse som trengs. Crispr/Cas9-systemet er likevel avhengig av tilstedeværelsen av store kjente genomsekvenser som flankerer ønsket innsettingssted for vellykket homologistyrt reparasjon, så vel som på den effektive nettstedgjenkjenningen formidlet av guide RNAer. Disse betingelsene kan ikke alltid oppfylles eller kan være arbeidskrevende å feilsøke, og gitt tilgjengeligheten av flere dokkinglinjer i An. gambiae og An. stephensi og linjer avledet fra dem, forblir φC31-systemet et svært verdifullt verktøy for å utføre direkte fenotypiske sammenligninger mellom transgenes på de samme genomiske stedene.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til Kiona Parker (UCI) for å gi bilder av transgene An. stephensi larver, og til Fraser Colman (LSTM) og Beth Poulton (LSTM) for å gi transgene An. gambiae larver. Beth Poulton (LSTM) ga også dyrebar hjelp under avbildningen av An. gambiae larver. Dette arbeidet ble finansiert av Tata Institute for Genetics and Society (TIGS) og LSTMs Director Catalyst Fund tildelt A.A. (DCF2014AA). A.A.J. er professor Donald Bren ved University of California, Irvine.
1.5 mL eppendorf tubes | |||
8-well microslides | VWR | MARI1216690 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | |
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | |||
Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm | Leica | 10446363 | |
Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm | Leica | 10447079 | |
Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII | Omega Optical | 500QM25, 500QM35 | |
Halocarbon oil 27 | Sigma | H8773 | |
Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
Petri dishes | |||
Potassium chloride | |||
Sodium Chloride | |||
Sodium phosphate dibasic | |||
Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 | Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) | R1181 | |
Stable brush Size 0 |