Transplante de Macrófagos Cardíacos de Camundongos Neonatais em Camundongos Adultos

Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Guia de Uso e Cuidado de Animais de Laboratório. Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC), Hospital Fuwai, Academia Chinesa de Ciências Médicas. A técnica asséptica é necessária durante todo o procedimento para evitar a contaminação do local cirúrgico. 1. Operação de ressecção apical no mouse Cx3cr1 GFP/+ neonatal de 1 dia de idade(C57BL/6 de fundo) Anestesia Tire todos os filhotes de rato das gaiolas e coloque-os em uma caixa seca limpa. Incorpore cada rato no gelo por cerca de 2-3 minutos. Certifique-se de que há uma barreira fina, como látex ou gaze entre o gelo e o filhote de rato para evitar queimaduras de gelo. Identifique anestesia suficiente observando os seguintes sinais: pele pálida, falta de movimento dos membros e falta de reflexo do pedal. Toracotomia Pré-prepare a plataforma operacional bronze durante a noite a -20 °C para ajudar a manter a anestesia. Tire o rato anestesiado da caixa de gelo e coloque-o em uma plataforma operacional de bronze. Ancore o mouse na plataforma de operação em uma posição supina usando fita adesiva médica. Coloque a plataforma operacional com o mouse nele sob um estereoscópio. Desinfete o baú do rato usando uma almofada de preparação encharcada com betadina e 70% de álcool ou conforme consistente com a política institucional. Incisar a pele com um corte de 1 cm na quarta área intercostal da cavidade torácica e, em seguida, separar os músculos intercostais usando tesoura microcirúrgica até que o coração seja acessado. Pressione alternadamente o peito e o abdômen com a ajuda de dois fórceps até que o coração seja exteriorizado para fora do peito sem qualquer dano mecânico. Coloque as costelas abaixo e acima da pequena incisão como uma fixação natural para imobilizar o coração. Ressecção do ápice ventricular Localize o ápice do ventrículo esquerdo. Corte um diâmetro de 1 mm de tecido ápice ventricular usando uma tesoura de iridectomia sob um estereoscópio. Confirme se a câmara ventricular esquerda está exposta, e comece a escorrer. Pressione suavemente o coração de volta para a cavidade torácica usando um cotonete. Sutura os músculos, costelas e pele usando 8-0 Suturas de prolene. Limpe bem o mouse após a operação. Cuidados pós-operação Transfira o mouse da plataforma de operação para uma manta de aquecimento de 37 °C para aquecer o corpo imediatamente após a operação. Confirme a anabiose do camundongo observando os seguintes sinais: restauração espontânea da respiração, mudança de cor da pele de pálida para rosa e movimento dos membros. Leve o rato operado de volta para sua mãe assim que ele se recuperar. Misture o rato operado com os materiais de aninhamento de sua mãe, se necessário.NOTA: É importante remover todos os filhotes de 1 dia de idade da mãe de uma vez e depois devolvê-los todos de uma vez depois que todos os filhotes são recuperados. 2. Preparação da suspensão do macrófago cardíaco neonatal NOTA: Todos esses procedimentos experimentais devem ser realizados em local escuro e em condições estéreis. Colher o coração de um rato Cx3cr1GFP/+ neonatal 1 dia após a ressecção apical Eutanize o mouse Cx3cr1GFP/+ um dia após a ressecção apical. Use um excesso de dióxido de carbono e decapite o rato sequencialmente para aplicar eutanásia. Tire o coração do peito e mergulhe-o em um prato de 10 cm com PBS. Corte os vasos e o tecido conjuntivo restante longe dos ventrículos. Corte o apêndice auricular e o trato de saída do coração. Depois que o coração parar de bater, corte o coração em 1-2 mm3 pedaços em tampão PBS usando tesoura microcirúrgica(Figura 2A). Dissociação cardíaca do camundongo neonatal Transfira o tecido cardíaco colhido para um tubo contendo 2,5 mL de mistura de enzimas pré-aque(Tabela de Materiais),e feche firmemente o tubo. Inverta o tubo e coloque-o com a tampa para baixo(Figura 2B). Executar o programa de dissociação cardíaca neonatal (Tabela de Materiais). Retire o tubo do dissociador após a conclusão do programa. Adicione 7,5 mL de 1x DMEM com 10% de FBS ao tubo. Filtre e transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 15 mL(Figura 2C). Centrifugar a suspensão da célula a 300 x g por 5 minutos. Resuspende a pelota celular em 1 mL de solução de lise de células sanguíneas e incubar por 2 minutos em temperatura ambiente. Adicione 5-10 mL de tampão PBS à suspensão e centrífuga a 300 x g por 5 minutos. Resuspense a pelota celular em 1 mL de DMEM com 10% de FBS. Isolamento do macrófago cardíaco neonatal Classificar GFP+ macrófagos cardíacos neonatais por FACS. Receba os macrófagos classificados em um tubo estéril contendo 500 μL de DMEM com 10% de FBS. Conte o GFP+ macrófagos (Figura 2D). Resuspend o macrófago em DMEM com 10% de FBS na concentração de 1 x 106 macrófagos por 200 μL de DMEM para injeção posterior.NOTA: O número de macrófagos GFP+ é pequeno em um recém-nascido (aproximadamente 1 x 105); portanto, pelo menos 10 recém-nascidos devem ser usados para obter macrófagos suficientes para cada injeção de rato adulto. 3. Transplante de macrófago cardíaco neonatal Realize uma operação de infarto do miocárdio em um camundongo C57BL/6 masculino adulto (6-8 semanas) por ligadura da artéria coronária anterior esquerda8. Coloque o mouse operado em uma manta aquecida de 37 °C até que ele se recupere. Injete por via intravenosa 200 μL de DMEM com 1 x 106 GFP+ macrófagos cardíacos neonatais no camundongo adulto infartado após a operação (aproximadamente 6 horas depois) através da veia traseira. Mande o rato de volta para uma gaiola limpa. 4. Avaliação do resultado Validação de eficiência de injeção Anestesiar o rato operado e colher o coração 7 dias após a operação de infarto do miocárdio. Mergulhe o coração no buffer PBS pré-resfriado. Fixar o tecido cardíaco com 4% de poliformaldeído por 72 horas em temperatura ambiente com agitação. Desidratar o tecido cardíaco em dimetilbenzeno e etanol. Incorpore o tecido cardíaco em parafina e corte-o em seções com uma espessura de 5 μm. Realize o protocolo padrão de coloração de imunofluorescência1. Use α-actinina para marcar cardiomiócitos. Detecte os macrófagos GFP+ no coração que recebem transplante. Realize o protocolo padrão de coloração de imunofluorescência1. Use α-actinina e pH3 para marcar cardiomiócitos e proliferação celular, respectivamente (Figura 3A). Avaliação de reparação cardíaca após o transplante Use ecocardiografia no mouse operado um mês após a operação1. Analise a função cardíaca comparando a fração de ejeção ventricular esquerda e o encurtamento fracionado em diferentes grupos(Figura 3B). Anestesiar o rato operado e colher o coração. Repetição passos 4.1.2-4.1.5. Faça o protocolo de coloração do Masson. Analise a área infarto após a injeção de macrófago(Figura 3C).