표준화된 장 루프 모델을 사용하여 마우스에서 장 투과성 및 호중구 환전 이동의 기능 평가
Summary
Dysregulated 장 상피 장벽 기능 및 면역 반응은 생리적인 모형의 부족 때문에 제대로 조사되지 않는 선동적인 장 질병의 특징입니다. 여기서는 생체 내 점막 투과성 및 백혈구 모집을 연구하기 위해 잘 혈관화되고 외부화된 장 세그먼트를 사용하는 마우스 장 루프 모델을 설명합니다.
Abstract
장 점막은 발광 박테리아와 외인성 물질의 통행을 방지하면서 영양분과 물의 파라세포 수송을 허용하는 동적 장벽을 형성하는 상피 세포의 단일 층에 의해 줄지어 있습니다. 이 층의 위반은 발광 내용및 면역 세포의 모집에 증가 투과성 귀착됩니다, 둘 다 염증성 장 질환 (IBD)을 포함하여 창자에 있는 병리학 상태의 특징입니다.
다형성 핵 호중구(PMN)의 상피 장벽 기능 및 환피상전환(TEpM)을 조절하는 메커니즘은 정량적 분석을 허용하는 생체 내 실험 적 방법의 부족으로 인해 불완전하게 이해된다. 여기서, 우리는 ileum 또는 근위 결장의 외부화된 장 세그먼트를 채택하는 강력한 뮤린 실험 모형을 기술합니다. 외부장 루프(iLoop)는 완전히 혈관화되어 있으며 상피 세포 단층층을 통해 투과성 및 PMN 이동을 연구하는 데 일반적으로 사용되는 전 생체 내챔버 기반 접근 방식에 비해 생리적 이점을 제공합니다.
우리는 이 모델의 두 가지 적용을 자세하게 보여줍니다: (1) 내루피알 주사 후 혈청에서 형광 라벨덱스트랜스의 검출을 통한 장 투과성의 정량적 측정, (2) 장 내 상피로 이동된 PMN의 정량적 평가는 항문 내 항막내 도입 후 장 루멘으로. 우리는 이 모형의 타당성을 입증하고 대조군에 비해 상피 단단한 접합 관련 단백질 JAM-A가 결여된 마우스에 있는 iLoop를 이용한 결과를 제공합니다. JAM-A는 염증 반응 도중 PMN TEpM뿐만 아니라 상피 장벽 기능을 조절하기 위하여 보였습니다. iLoop를 사용하여 우리의 결과는 이전 연구 결과를 확인하고 항상성 및 질병 도중 생체내에 있는 장 투과성 및 PMN TEpM의 규칙에 있는 JAM-A의 중요성을 강조합니다.
iLoop 모델은 장 내 항상성 및 염증의 생체 내 연구에서 재현 가능한 고도로 표준화된 방법을 제공하며 IBD와 같은 질병의 장 장벽 기능 및 점막 염증에 대한 이해를 크게 향상시킵니다.
Introduction
장 점막은 기둥 장 상피 세포 (IeCs), 기본 라미나 프로프리아 면역 세포 및 근막 점막의 단일 층을 포괄합니다. 영양분의 흡수에 그것의 역할 이외에, 장 상피는 발광 장성 박테리아, 병원체 및 규정식 항원에서 바디 내부를 보호하는 물리적 장벽입니다. 또한, IeCs 및 lamina propria 면역 세포는 문맥과 자극에 따라 내성 또는 반응을 유도하는 면역 반응을 조정합니다. 상피 장벽의 붕괴는 병리학점막 염증의 발병을 선행하고 궤양성 대장염과 크론병1,2,3,4,5,6,7을모두 포괄하는 염증성 장질환(IBD)에 기여할 수 있다고 보고되었다. 궤양성 대장염을 가진 개인은 다형성 핵 호중구(PMN)의 과도한 환전성 이동(TEpM)을 존재하여 토굴 농양을 형성하고, 질병의 중증도와 연관된 발견8,9. 손상된 상피 장벽 기능및 과도한 면역 반응은 IBD의 특징이지만, 장 투과성 및 면역 세포 모집의 정량적 평가를 수행하기 위한 생체 내 분석의 부족이 장 점막으로.
장 상피 투과성을 연구하는 데 사용되는 가장 일반적인 방법은 반투과성 다공성 멤브레인삽입물 10,11,12에배양된 IEC 단층제를 사용하여 전 생체 챔버 기반 접근법을 채용한다. 상피 장벽 무결성은 형광전기 저항(TEER) 또는 플루오레세인 이소티오카네이트(FITC)의 파라세포 플럭스의 측정에 의해 모니터링되며,기저구(13,14,15)에대한 대피에서 표기된 dextran을 표기한다. 유사하게, PMN TEpM은 전형적으로 하부챔버(16)에첨가되는 화학요법제에 대한 응답으로 연구된다. PMN은 상부 챔버에 배치되고 인큐베이션 기간 이후에, 기저 구획으로 마이그레이션된 PMN은 수집및 정량화된다. 이러한 방법은 유용하고, 수행하기 쉽고, 매우 재현가능하지만, 분명히 감소주의적 접근 방식이며 반드시 생체 내 조건의 정확한 반사를 나타내는 것은 아닙니다.
마우스에서, 장 내 세포 투과성을 연구하는 일반적인 분석은 FITC-dextran의 경구 영역및 혈액혈청(13,17)에서FITC-dextran 외관의 후속 측정에 의한 것이다. 이 분석의 단점은 지역 장 기여보다는 위장관의 전반적인 장벽 무결성에 대한 평가를 나타낸다는 것입니다. 또한, 에반스 블루는 일반적으로 생체 내 혈관 누설을 평가하는 데사용되며 마우스 및쥐(19, 20,21)에서장점 막투도를 평가하기 위해 사용되어 왔다. 장 점막에서 에반스 블루의 정량화는 하룻밤 포르마이드에서 배양을 사용하는 조직에서 추출이 필요합니다. 따라서 동일한 조직을 사용하여 장상피성 투과성 및 호중구 침투를 연구할 수 없습니다.
여기서 우리는 생체 내에서 대장 점막 투과성 및 백혈구 환전 이동에 재현 가능한 데이터를 수집하는 데 필요한 동물의 수를 줄이는 간단한 프로토콜을 강조합니다. 따라서 추가 분석을 위해 수확할 수 있는 장 루프의 무결성을 손상시키지 않으면서 혈액 혈청에서 쉽게 감지할 수 있는 FITC-덱스트랜스를 사용하는 것이 좋습니다. 참고, 장 계측 루프는 세균 감염(예: 살모넬라, 리스테리아 단세포유전자 및 대장균)22,23,24,25뿐만 아니라 장 투과성(26)을 연구하기 위해 다양한 종(마우스, 쥐,토끼,송아지 포함)에서 사용되어 왔다. 그러나, 우리의 지식의 최고에 IBD에 일반적으로 관련 되 고 ileum 또는 결장 과 같은 창 자에 있는 특정 지역에서 PMN TEpM의 메커니즘을 조사 하는 연구.
여기서 우리는 장 내 루프 (iLoop) 모델을 설명하며, 이는 ileum 또는 근위 결장의 잘 혈관화되고 외부화 된 장 세그먼트를 사용하는 생체 내의 견고하고 신뢰할 수있는 미세 수술 방법입니다. iLoop 모형은 생리적으로 관련있고 마취의 밑에 살아있는 마우스에 장 장벽 무결성 및 PMN TEpM의 평가를 허용합니다. 우리는 두 가지 응용 프로그램을 시연 : 1) iLoop 2) 강력한 chemottractant Leukotriene B4 (LTB4) 27의인트라피컬 주입 후 iLoop 루멘에서 전환 PMN의 정량화 후 4kDa FITC-dextran의 혈청 수준의 정량화 . 더욱이, ILOOP 모델을 활용하여 잼-a-null마우스 또는 마우스가 IC에 JAM-A의 선택적 손실을 품고있다(빌린-크레크; Jam-a fl/fl)대조마우스에 비해, 우리는 장 투과성 및 호중구 환전에 단단한 접합 관련 단백질 JAM-A에 대한 주요 기여를 보고한 이전 연구를 확증할 수 있다15,28,29,30,31.
iLoop 모델은 체외 학적 으로 확증하는 데 사용할 수있는 고기능적이고 생리적 인 방법입니다. 더욱이, 이것은 화학, 사이토카인, 세균병원균, 독소, 항체 및 치료제를 포함하여 루프 루멘에 주입될 수 있는 각종 시약을 연구할 수 있는 다목적 실험 모델입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
IBD와 같은 병리학 적 조건하에서 장 장벽 기능 및 면역 세포 모집의 장애 조절을 담당하는 메커니즘은 불완전하게 이해됩니다. 여기서, 우리는 ileum 또는 근위 결장의 잘 혈관화된 외부장 세그먼트를 채택하고 장 투과성, 호중구 이주 연구 및 그밖 응용의 평가를 허용하는 강력한 생체 내 murine 모형을 상세히 기술합니다.
iLoop는 살아있는 동물에서 수행되는 비 회복 수술입니다…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 근접 결장 루프 모델의 설립에 자신의 기여에 대한 우에르츠부르크 대학의 박사 스벤 플레밍, 마우스 식민지의 관리에 대한 숀 왓슨과 iLoop 모델의 사진의 수집을 돕는 치트라 K. Muraleedharan에 대한 감사. 이 작품은 독일 연구 재단/DFG(BO 5776/2-1)에서 KB, R01DK079392, R01DK072564, R01DK061379에서 C.A.P까지 지원했다.
Materials
| Equipment and Material | |||
| BD Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" | BD | 305122 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" | BD | 305106 | |
| BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle | BD | 309659 | |
| 15ml Centrifuge Tube | Corning | 14-959-53A | |
| Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate | FisherScientific | 07-200-592 | |
| Corning Non-treated Culture Dish, 10cm | MilliporeSigma | CLS430588 | |
| Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile | FisherScientific | 25806 2WC | |
| Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" | Medex | 3249-1 | |
| EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Falcon Centrifuge Tube 50ml | VWR | 21008-940 | |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | FisherScientific | 15-901-10R | |
| Halsey Needle Holder (needle holder) | FST | 12001-13 | |
| Kimwipes, small (tissue wipe) | FisherScientific | 06-666 | |
| 1.7ml Microcentrifuge Tubes | Thomas Scientific | c2170 | |
| Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) | Sarstedt | 41.1501.105 | |
| Moria Fine Scissors | FST | 14370-22 | |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) | Falcon | 352235 | |
| Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant | Dechra | 12920060 | |
| Ring Forceps (blunt tissue forceps) | FST | 11103-09 | |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD | FisherScientific | NC9452680 | |
| Semken Forceps (anatomical forceps) | FST | 1108-13 | |
| Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting | HenrySchein | SS694 | |
| Student Fine Forceps, Angled | FST | 91110-10 | |
| 10ml Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z248029 | |
| 96 Well Cell Culture Plate | Corning | 3799 | |
| Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm | Instech | FTP-20-30 | |
| Solutions and Buffers | |||
| Accugene 0.5M EDTA | Lonza | 51201 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Corning | 21-023-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) | BioLegend | 127610 | |
| CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) | ThermoFisher | 12-0112-81 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen | C36950 | |
| Dithiotreitol | FisherScientific | BP172-5 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | R&D Systems | 511550 | |
| Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 | Sigma | 60842-46-8 | |
| Isoflurane | Halocarbon | 12164-002-25 | |
| Leukotriene B4 | Millipore Sigma | 71160-24-2 | |
| PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) | BD Pharmingen | 557235 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) | BD Bioscience | 553142 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A |
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