Sammlung und Identifizierung von Pollen aus Honigbienenvölkern
Summary
Wir beschreiben Methoden zum Sammeln von Korbikularpollen von Honigbienen sowie Protokolle zur Farbsortierung, Acetolyse und Objektträgerpräparation von Pollen zur taxonomischen Identifizierung. Darüber hinaus präsentieren wir die Pelletfarbe und taxonomische Vielfalt von korbikulären Pollen, die aus fünf Anbausystemen mit Pollenfallen gesammelt wurden.
Abstract
Forscher sammeln und analysieren häufig korbikuläre Pollen von Honigbienen, um die Pflanzenquellen zu identifizieren, auf denen sie nach Pollen suchen, oder um die Pestizidbelastung von Bienen über Pollen abzuschätzen. Hierin wird ein wirksames Pollenfangverfahren zum Sammeln von Korbikularpollen von Honigbienen beschrieben, die zu ihren Bienenstöcken zurückkehren. Diese Sammelmethode führt zu großen Mengen an Korbikularpollen, die für Forschungszwecke verwendet werden können. Honigbienen sammeln Pollen von vielen Pflanzenarten, besuchen aber normalerweise eine Art während jeder Sammelreise. Daher repräsentiert jedes korbikuläre Pollenpellet überwiegend eine Pflanzenart, und jedes Pollenpellet kann durch Farbe beschrieben werden. Dies ermöglicht die Sortierung von Proben von korbikulären Pollen nach Farbe, um Pflanzenquellen zu trennen. Forscher können korbikuläre Pollen weiter klassifizieren, indem sie die Morphologie von acetolysierten Pollenkörnern zur taxonomischen Identifizierung analysieren. Diese Methoden werden häufig in Studien verwendet, die sich auf Bestäuber beziehen, wie Bestäubungseffizienz, Bestäuber-Nahrungsdynamik, Ernährungsqualität und Vielfalt. Es werden detaillierte Methoden zum Sammeln von Korbikularpollen mit Pollenfallen, zum Sortieren von Pollen nach Farbe und zum Acetolysieren von Pollenkörnern vorgestellt. Ebenfalls vorgestellt werden Ergebnisse zur Häufigkeit von Pelletfarben und Taxa von Rabenpollen, die von Honigbienen in fünf verschiedenen Anbausystemen gesammelt wurden.
Introduction
Die Westliche Honigbiene (Apis mellifera L.) ist ein wichtiger Bestäuber vieler landwirtschaftlicher Kulturen, die auf Bienenbestäubung angewiesen sind1. Seit mehr als einem Jahrzehnt werden signifikante Verluste von Honigbienenvölkern gemeldet 2,3,4,5,6,7,8,9. Mehrere Faktoren – einschließlich Parasiten und Krankheiten, schlechte Ernährung und Pestizide – wurden mit dem Rückgang dieser Kolonien in Verbindung gebracht10. Schlechte Ernährung kann auf die landwirtschaftliche Intensivierung und den Verlust von Nahrungshabitat zurückgeführtwerden 11. Es ist unerlässlich, die Blumenressourcen zu verstehen, die von Bienen in verschiedenen Landschaften genutzt werden, um die Bienenernährung zu verbessern und die Bemühungen zum Schutz der Bienen zu unterstützen. Pollen ist die Hauptquelle für Proteine, Lipide, Vitamine und Mineralien für Bienen und wurde in vielen landwirtschaftlichen und ökologischen Studien verwendet, um die Präferenzen von Honigbienen auf Kolonieebene zu verstehen, die Auswirkungen des Pollenfangs auf Honigbienenvölker zu bewerten und die Pestizidbelastung gegenüber Bienen zu bestimmen12,13,14.
Honigbienen sammeln Pollen von Blüten, verpacken Pollen in Pellets auf ihrer Corbicula – einem Tibiapollenkorb an ihrem Hinterbein – und kehren zur Lagerung in die Kolonie zurück. Korbikularpollen können von Sammlern entfernt werden, indem sie am Bienenstockeingang oder an Blüten gefangen, kurz gekühlt werden, um sie zu immobilisieren, und dann die Pollenpellets mit einer Pinzette von ihren Hinterbeinen entfernt werden. Der mühsame Prozess des manuellen Sammelns von Korbikularpollen von einzeln gefangenen Sammlern ist langsam und ineffizient, wenn man eine beträchtliche Menge an Pollen benötigt. Eine einfachere und effizientere Methode zum Sammeln großer Pollenmengen besteht darin, korbikuläre Pollenpellets von Honigbienen an Bienenstockeingängen einzufangen. Pollenfallen sind so konzipiert, dass sie korbikulare Pollen von den Beinen der zurückkehrenden Pollensammler entfernen, wenn sie in den Bienenstockgelangen 15. Die Sammler müssen sich durch Maschenlöcher quetschen, die so dimensioniert sind, dass sie den Durchgang eines Honigbienenarbeiterkörpers ermöglichen.
Wenn die Honigbiene durch eines dieser Löcher geht, werden die größeren Pollenpellets von ihren Beinen abgekratzt und fallen in eine Auffangschale16. Studien haben gezeigt, dass Pollenfang Sammler dazu anregt, mehr Pollen zu sammeln, wodurch die Bestäubungseffizienz der umliegenden Pflanzen und Vegetation erhöhtwird 17,18,19,20. Pollensammelmethoden können auch verwendet werden, um das von Honigbienen in der Landschaft genutzte Futter als ersten Schritt zur Bestimmung der Quantität, Qualität und Taxa blühender Pflanzenarten zu verstehen. Effektive Pollenfangmethoden erleichtern somit sowohl die Bestäubung als auch die Ernährungsforschung von Honigbienen. Ein Vergleich dieser Pollensammelmethoden ist in Tabelle 1 dargestellt. Das Verhalten der Pollensuche ändert sich basierend auf dem Bedarf der Kolonie an gelagertem Pollen im Verhältnis zu ihren Ei- und Larvenpopulationen21,22. Da diese Veränderungen unterschiedliche Sammelintensitäten beinhalten, ist oft eine hohe Variation der Pollenmenge zwischen Völkern am selben Standort und zwischen verschiedenen Standorten desselben Anbausystems oder Landschaftstyps zu erwarten23,24. Die Erhöhung der Anzahl der Kolonien und Orte, an denen Pollen gefangen werden, wird dazu beitragen, diese Variation auszugleichen.
Pollenfallen variieren in der Effizienz25,26. Die Größe der von Honigbienen gesammelten Pollenpellets variiert je nach Pflanzenart und kann sich je nach Höhe der Pollenspeicher in der Kolonie ändern27,28. Dies birgt das Potenzial, dass kleinere Pollenpellets unterrepräsentiert und größere Pellets in Proben, die über Pollenfallen gesammelt werden, überrepräsentiert sind. Erwachsene Bienen variieren in der Körpergröße, was auch die Darstellung von Pollen beeinflussen kann, die in Fallen gesammelt werden. Es gibt auch Pflanzenarten, die überwiegend Nektar produzieren, der unentdeckt bleibt, wenn nur gesammelte Pollen in einigen Landschaften ausgewertet werden. Die Fangeffizienz wird auch durch die Abdrift und Desorientierung der Sammler beeinflusst, die vom Pollenfallentyp und dem Zustand der Bienenstockausrüstung beeinflusst wird. Dieses Problem kann durch den Einsatz der in diesem Dokument beschriebenen Techniken entschärft werden. Die Forscher können zusätzliche Forschungstechniken in Betracht ziehen, z. B. die Zählung von Blumenbesuchen durch Sammler, um die Ergebnisse der Präferenzen für die Nahrungssuche auf Kolonieebene zu ergänzen. Eine nützliche Methode zur Beurteilung der Pollenvielfalt ist die Sortierung von Korbikularpollen nach Farbe. Obwohl Honigbienen generalistische Sammler sind, zeigen sie auch Blütentreue, wo sie Pollen von derselben Pflanzenart am selben Ort während einer bestimmten Sammelreise sammeln. Aufgrund dieses Futtersuchverhaltens wird angenommen, dass jedes gegebene korbikuläre Pollenpellet überwiegend durch eine einzelne Pflanzenart repräsentiert wird 27,29,30,31. Daher können Wissenschaftler die Pollenvielfalt beschreiben, indem sie korbikuläre Pollen nach Pelletfarbe sortieren und die Gesamtzahl der nachgewiesenen Farben oder den Anteil an der Gesamtmenge, der von jeder Farbgruppe repräsentiert wird, 12,32,33,34 angeben. Dies kann durch Messung der Massen- oder Pelletzahl jeder Farbgruppe erreicht werden. Die Messung der Pelletzahl jeder Farbgruppe wird empfohlen, wenn bekannte oder vermutete systematische Unterschiede im Gewicht von Pellets aus verschiedenen Taxa bestehen. Systematische Unterschiede können durch die Pelletgröße oder die Menge an Nektar verursacht werden, die Sammler dem Pollen bei der Bildung eines Pellets hinzufügen.
Die Farbsortierung ist ein zeiteffizienter und einfacher Prozess, hat aber möglicherweise keine akzeptable Genauigkeit für einige Bestäubungsforschungsstudien, da verschiedene Pflanzentaxa ähnliche Pollenpelletfarben haben können35,36. Darüber hinaus gibt es eine logistische Begrenzung für die Anzahl der verschiedenen Farbgruppen, in die Pollenpellets getrennt werden können. Daher ist die Trennung jedes einzelnen Pflanzentaxonpollens in eine eigene Pelletfarbgruppe in Bestäubungsstudien möglicherweise nicht immer möglich. Die morphologische Charakterisierung von Pollenkörnern mittels Lichtmikroskopie ergänzt häufig die Farbtrennung von Pellets, indem die Pollen von zwei oder mehr Taxa in Pellets derselben Farbgruppe unterschieden werden. Obwohl es üblich ist, Pollenkörner mehrerer Taxa in einer bestimmten Pollenpellet-Farbgruppe zu finden, umfassen einzelne Pollenpellets, die von einer Honigbiene gesammelt werden, im Allgemeinen ein vorherrschendes Taxon, möglicherweise mit anderen Taxa in geringen Mengen. Daher ist es üblich, taxonomische Treue in korbikulären Pollenpellets von Honigbienen anzunehmen. Pollenpellets von anderen Bestäubern, die kein Blütentreueverhalten aufweisen, wie Hummeln, enthalten oft viele Pflanzenarten und besitzen möglicherweise kein vorherrschendes Taxon. In Fällen, in denen quantitative Schätzungen der Taxaanteile in polyfloralen Pollenpellets gewünscht werden, sind mikroskopische Methoden, die Acetolyse einschließen, zusätzlich für eine ordnungsgemäße Analyse erforderlich.
Die Beurteilung morphologischer Merkmale von acetolysierten Pollenkörnern ist die gebräuchlichste Methode zur taxonomischen Identifizierung16. Das Acetolyseverfahren entfernt das Protoplasma des Pollenkorns, um diagnostische Merkmale freizulegen, die unter Lichtmikroskopie beobachtet werden können37,38. Mit dieser Methode können Forscher verschiedene Taxa, die Häufigkeit von Taxa, die in bestimmten Anbausystemen gefunden werden, und vorherrschende Taxa von Pelletfarben33,36 melden. Die Acetolyse ist die beste Analysetechnik zur Aufdeckung der Pollenmorphologie28. Einige acetolysierte Pollenkörner, wie viele Rosaceae-Arten, können jedoch nicht allein durch Acetolyse und Lichtmikroskopie auf Gattungs- oder Artebene identifiziert werden. Forscher betrachten Rasterelektronenmikroskopie oder Metabarcoding als alternative Methoden, um eine Identifizierung auf Gattungs- oder Artebene zu erreichen. Diese alternativen Methoden liefern jedoch nur eine qualitative Taxonidentifikation und versäumen es, die Anteile verschiedener Pollenkorntaxa in polyfloralen Pollenpelletsabzuschätzen 36,39. Zudem ist der Aufwand und die notwendige Expertise für diese Methoden deutlich höher. Ein Vergleich dieser Identifizierungsmethoden ist in Tabelle 1 dargestellt.
| Methodik | Zeit | Kosten | Auflösung | Sachkenntnis |
| Pollensammlung | ||||
| Pollenfang | Niedrig | Mäßig | Variable | Mäßig |
| Pollensammelsammlung | Hoch | Mäßig | Hoch | Niedrig |
| Pollen-Identifizierung | ||||
| Visuell (nur Farbsortierung) | Mäßig | Niedrig | Niedrig | Niedrig |
| Acetolyse | Mäßig | Mäßig | Mäßig | Mäßig |
| Rasterelektronenmikroskopie | Hoch | Hoch | Hoch | Hoch |
| Metabarcoding | Variable | Hoch | Hoch | Hoch |
Tabelle 1: Vergleich verschiedener Methoden der Pollensammlung und -identifizierung basierend auf Zeit, Kosten, Auflösung und Fachwissen. Visuelle Methoden (nur Farbsortierung) melden die Gesamtzahl der erkannten Farben oder den Anteil an der Gesamtfarbe, der von jeder Farbgruppe repräsentiert wird, als Metrik zur Bestimmung der Pollenquellen, bieten jedoch keine Taxonidentifikation.
Die verfügbaren Informationen über das Einfangen und Sortieren von Pollen und das Acetolysieren von Pollenkörnern sind vielfältig und oft über mehrere Quellen verteilt, die für Forscher in verschiedenen Bereichen unterschiedlich sind. Dieses Papier bietet detaillierte Einblicke in verschiedene Arten von Pollenfallen, die sowohl von Forschern als auch von Imkern verwendet werden können, um große Mengen an korbikulären Pollen effektiv zu sammeln. Ebenfalls enthalten sind Protokolle zur Vorbereitung von Pollenproben – durch Acetolyse, Färbung und Objektträgermontage – zur Identifizierung von Pflanzentaxa. Die hier beschriebenen Methoden sind umfassend und dienen als einzigartige Ressource zur Identifizierung vorherrschender Pflanzenarten, auf denen Honigbienen in einer bestimmten Landschaft nach Nahrung suchen, insbesondere in Anbausystemen. Ergebnisse, die auf diesen Methoden aus einer früheren Studie basieren, wurden vorgestellt und dokumentieren die Vielfalt der Pollenpelletfarben und Pflanzentaxa aus korbikulären Pollen, die von Honigbienen in fünf Kultursystemen gesammelt wurden14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschiedene Pollenfallenstile haben ihre eigenen Vor- und Nachteile. Die Vorteile und Einschränkungen von vier häufig verwendeten Fallenarten, (1) Frontmontage, (2) Bodenmontage, (3) Schneckenloch und (4) Top-Mount Pollenfallen werden unten diskutiert. Traps an der Vorderseite sind die vielseitigste Ausführung (Abbildung 1B). Die Installation ist schnell und einfach; Es kann ohne Anheben von Bienenstockboxen durchgeführt werden, und diese Fallen passen auf jede Langstroth-Art von Bienenstockausrüstung. Da die Auffangschale vor der Kolonie sitzt, sammelt sie minimale Ablagerungen von der Kolonie. Die Auffangschale ist jedoch auch stärker äußeren Elementen ausgesetzt – Feuchtigkeit von Feldbewässerung, regnerischem oder feuchtem Wetter oder Tau kann durch die Auffangschale mit dem Pollen in Kontakt kommen, was den Pollen möglicherweise unbrauchbar macht, wenn die Pellets zu gesättigt werden, um sich zu trennen. Das Risiko einer Pollensättigung kann reduziert werden, indem das Einfangen bei vorhergesagten Regenfällen oder hoher Luftfeuchtigkeit vermieden wird. Das Platzieren einer Gummimatte unter der Falle und zusätzliches Abdeckmaterial (z. B. Dachpappe) auf dem Pollenfänger kann die Auffangwanne ebenfalls vor Witterungseinflüssen schützen.
Fallen, die unten montiert wurden, wurden verwendet, um Pollen für die Daten in diesem Papier zu sammeln (Abbildung 1A). Sie sind nicht so bequem zu installieren, da sie unter dem Brutnest der Kolonie platziert werden müssen. Die Installation ist zeitaufwendig und führt dazu, dass eine große Menge an Trümmern aus der Kolonie in die Falle fällt, wie Bienenteile und kleine Wachsstücke. Der Boden der Auffangwanne für die meisten hergestellten Bodenfallen besteht aus feinem Netz, das eine ordnungsgemäße Belüftung ermöglicht, um die gesammelten Pollen vor Feuchtigkeit zu schützen. Schneckenloch-Pollenfallen tragen dazu bei, die Desorientierung von Sammlern zu minimieren, wenn sie Schneckenlöcher hauptsächlich als Bienenstockeingänge anstelle des Eingangs durch das untere Brett des Bienenstocks verwenden (Abbildung 1C). Da die Auffangwanne für Schneckenloch-Pollenfallen sehr klein ist, muss sie häufig entleert werden, um ein Überlaufen der Auffangwanne zu vermeiden. Aufgrund seiner oberen Platzierung auf einem Bienenstock ist die Top-Mount-Pollenfalle am einfachsten zu installieren und zu entfernen, und die gesammelte Pollenprobe ist frei von Bienenstockablagerungen. Diese Fallenart ist jedoch besonders empfindlich gegenüber beschädigten Bienenstockgeräten, da die Auffangschale Feuchtigkeit ausgesetzt wäre, wenn der Deckel, die innere Abdeckung und die obere Bienenstockbox nicht ordnungsgemäß verschlossen sind.
Die hierin beschriebenen Protokolle erfordern die Auswahl von Kolonien mit großen adulten und Larvenpopulationen (Schritt 1.2). Diese Selektionsmethode soll sehr große Mengen an gefangenem Pollen aus diesen Kolonien produzieren. Kolonien mit beträchtlichen Nahrungspopulationen können bei der Installation der Fallen am Eingang stark überlastet sein. Die Auswahl eines großen Bienenstockeingangs verringert die Überlastung. Große Sammelpopulationen können auch sehr große Mengen an Pollen sammeln, die die Grenzen der Auffangschale überschreiten können. Verwenden Sie voluminöse Auffangschalen, wie sie bei den meisten Fallenarten unten oder oben zu sehen sind, und häufig leere Schalen, um große Mengen eingeschlossener Pollen aufzunehmen. Wenn das angestrebte Forschungsziel darin besteht, die von Kolonien in einem Bienenhaus gesammelten Pollenmengen zu bewerten, wählen Sie repräsentative Kolonien aus, anstatt die adulten und larvenen Populationen für die Selektion zu optimieren. Alle Arten von Pollenfallen blockieren den Bienenstockeingang und schaffen einen neuen Eingang, der sich räumlich vom ursprünglichen Eingang16 unterscheidet. Pollenfallen sammeln in der Regel keine Pollen, wenn Sammler bei der Installation nicht in der Lage sind, sich auf den neuen Eingang der Pollenfalle auszurichten. Diese Sammler treiben leicht zu benachbarten Bienenstöcken und kontaminieren möglicherweise andere Pollensammelproben, wenn sie mit einer Pollenfalle in einen anderen Bienenstock gelangen. Daher sollte den Sammlern mindestens 24 Stunden Zeit gegeben werden, sich an den neuen Eingang zu gewöhnen, indem der Fangmechanismus nach der Installation deaktiviert bleibt. Die Auswahl von Kolonien mit wenigen oder keinen zusätzlichen Bienenstockeingängen reduziert auch die Verwirrung bei der Orientierung am neuen Pollenfalleneingang.
Zusätzliche Bienenstockeingänge (z. B. Löcher und verzogene Deckel) sollten versiegelt werden, aber das Risiko, dass Sammler zu benachbarten Bienenstöcken abdriften, steigt, wenn diese Eingänge zu Beginn der Falleninstallation vorhanden sind. Sammler treiben auch leicht in andere Bienenstockeingänge, wenn eine Pollenfalle nur auf einem einzigen Bienenstock in einer Gruppe von palettierten Bienenstöcken installiert ist. Sammler driften seltener, wenn alle Bienenstöcke, die auf der Palette in die gleiche Richtung zeigen, Fallen installiert haben. Top-Mount Pollenfallen können aufgrund der erheblichen Entfernung zwischen dem Pollenfalleneingang und dem ursprünglichen Eingang des Bienenstocks ein höheres Risiko für Bienendrift darstellen. Für diese Studie wurden Pollenfallen an mehreren Honigbienenvölkern an jedem Versuchsstandort installiert, um die Variation der Pollenmenge und der Taxazusammensetzung zwischen jeder Honigbienenkolonie zu berücksichtigen. Daher sollten Pollenfallen auf mehreren Kolonien installiert werden, um robuste Pollensammlungen aus der Landschaft zu erzielen, da die Pollensammlung zwischen den Kolonien je nach Pflanzenart und Gesamtsammelmenge12,13 stark variieren kann. Jede Pollenprobe hatte eine Sammelzeit von 7 Tagen. In zukünftigen Studien wird das Sammeln von Pollen in zwei oder drei aufeinanderfolgenden 72-Stunden-Intervallen die Genauigkeit der Pollenfutterschätzung erhöhen40.
Da es eine hohe zeitliche Fluktuation in der Pollensammlung gibt, könnte die Pollenschätzungsgenauigkeit erhöht werden, indem der Pollensammelprozess in frühen, Spitzen- und späten Blütezeiten der anvisierten Anbausysteme wiederholt wird24,27,39. Pollen sollten von mehreren Standorten gesammelt werden, wenn auch vom gleichen Anbausystem oder Landschaftstyp, wegen der erwarteten Unterschiede in der Menge und Pflanzenartenart zwischen den Imkereistandorten 14,27,33,43. Langfristiges Pollenfangen kann für Honigbienenvölker schädlich sein. Mögliche Auswirkungen sind eine reduzierte Brutaufzucht, eine Verkürzung der Larvenwachstumsperiode und Kannibalismus von Eiern und jungen Larven in den Bienenstöcken 19,44,45,46. Längere Zeiträume des Pollenfangs, wie die gesamte Vegetationsperiode, können die schädlichen Auswirkungen auf die Brutaufzucht in Kolonien verschlimmern. Pollenfang kann auch zu einer Verringerung der Honigproduktion und einer Erhöhung des Feuchtigkeitsgehalts von gelagertem Honig führen13. Rotierende Pollenfallen zwischen Kolonien in einem Bienenhaus bei der kontinuierlichen Überwachung einer Landschaft oder eines Anbausystems könnten den Schaden für Kolonien, die für den Pollenfang verwendet werden, mildern. Das Einschalten von Pollenfallen alle zwei Wochen verringert schädliche Auswirkungen, insbesondere den Verlust der Honigproduktion, wenn Pollen in denselben Kolonien über einen bestimmten Zeitraum gefangen werden13.
Darüber hinaus werden die Pollenfallen bevorzugt auf starke Völker gesetzt. Gelegentlich können die Pollenfallen unbeabsichtigt eingreifen. Dies könnte vermieden werden, indem der Pollenfallenmechanismus gesperrt wird, wenn das Sammeln von Pollenfallen nicht erwünscht ist. Pollenfallen entfernen nicht alle korbikulären Pollen von Honigbienensammlern. Die Fangeffizienz hängt vom Fallentyp, der Pollenpelletgröße, der Größe des Bienenkörpers, der Tageszeit und den Wetterbedingungen ab. Daher ist die korbikuläre Pollensammlung nicht konsistent, wenn Pollenfallen für verschiedene Pflanzenarten und Sammelzeiträume25,26 verwendet werden. Kleinere Pollenpellets von Pflanzen wie Eucalyptus spp. und Tamarix spp. werden seltener von Pollenfallen gefangen27. Bemerkenswerterweise wurde in dieser Studie kein Hochbusch-Heidelbeerpollen (Vaccinium corymbosum L.) von den Hochbusch-Blaubeersammelstellen gefunden, was frühere Beweise dafür unterstützt, dass Hochbusch-Blaubeer-Blaubeerpollenpellets zu klein für die Pollenfallensammlungsind 47. Im Gegensatz dazu wurde Pollen aus Löwenzahn (Taraxacum officinale F.H. Wigg) in jedem Anbausystem in dieser Studie gefunden. Pollenpellets einiger Pflanzenarten können auch viel größer sein als andere, wie Taraxacum spp., und könnten möglicherweise bei der Analyse von Pollensammlungen aus Pollenfallen überrepräsentiert sein27. Das Fangen einzelner Pollensammler und das manuelle Entfernen ihres korbikulären Pollens erhöht die Genauigkeit einer Pollenquellenbewertung, ist jedoch im Vergleich zur Verwendung von Pollenfallen sehr zeit- und ressourcenintensiv (Tabelle 1). Das Sortieren von Pollenpellets in Farbgruppen ist relativ einfach, obwohl es zeitaufwendig ist. Sofern es kein spezifisches Forschungsziel gibt, sollte die Menge an Pollenpellets auf 10 g oder weniger (für eine bestimmte Probe) begrenzt werden, um sie in Farbgruppen zu sortieren. Das Sortieren ganzer Proben, die größere Mengen als diese Menge enthalten, verlängert die für den Abschluss der Analyse erforderliche Zeit drastisch. Entscheidend ist jedoch, dass eine Pollenprobe sehr gut durchmischt ist, bevor ihr eine Teilprobe zur Farbsortierung entnommen wird. Wenn die ursprüngliche Probe nicht gemischt wird, kann dies zu einer Teilprobe führen, die nicht repräsentativ für das Ganze ist, was vermieden werden sollte.
Wenn der ursprüngliche Probenbehälter nicht genügend freien Platz enthält, um eine gründliche Mischung der Pollenpellets zu ermöglichen, sollte es ausreichen, die gesamte Probe in einen großen Plastikbeutel oder eine kleine Papiertüte zu legen, auch bei großen Proben. Hartplastikbehälter mit Deckel funktionieren ebenfalls. Das Mischen der Probe sollte vorsichtig erfolgen, damit Pollenpellets nicht zerquetscht oder anderweitig zerstört werden. Unbeabsichtigte Verzerrungen könnten unbewusst dazu überreden, “die hübschen violetten Pellets” herauszuschöpfen, wenn beispielsweise eine Teilprobe aus dem Ganzen entfernt wird. Daher sollte die Farbzusammensetzung der Probe beim Herausnehmen einer Teilprobe verdeckt werden. Auf diese Weise ist es wahrscheinlicher, eine Teilstichprobe zu erhalten, die wirklich repräsentativ für das Ganze ist. Diese Subsampling-Methode könnte jedoch nicht dazu führen, Pollenpellets auszuwählen, die in geringer Häufigkeit in der Probe vorhanden sind. Wenn also die Identifizierung jedes einzelnen Pflanzentaxons, das in der Stichprobe vertreten ist, ein Forschungsziel ist, ist die Erhebung einer Teilstichprobe nicht angemessen. Die gesamte Probe muss analysiert werden. Daher sollten Pellets in einer Glas-Petrischale sortiert werden. Sobald die Sortierung abgeschlossen ist, können entsprechende Seiten des Pantone-Farbführers unter der Schale platziert werden, um die Farbabstimmung zwischen der Anleitung und den sortierten Pollen zu erleichtern. Ein Beispiel hierfür ist in Abbildung 5 dargestellt.
Beim Einfangen von Pollen von Honigbienenvölkern, die zur Bestäubung in Kulturen platziert werden, sollten nicht mehr als zehn Gesamtfarbgruppen verwendet werden: neun Einzelfarben und eine “verschiedene” Farbgruppe, die sich aus den Minderheitenfarben in der Probe zusammensetzt. Eine vernünftige Begrenzung der maximalen Anzahl von Farbgruppen, in die eine Probe unterteilt werden kann, verhindert, dass sich der Forscher verzettelt, indem er Pellets endlos in immer mehr extrem spezifische Gruppen trennt, die nach Abschluss der Sortierung möglicherweise nicht genügend Mengen für die Acetolyse enthalten. Wenn Kolonien gefangen werden, die wahrscheinlich aus einem sehr vielfältigen Sortiment von Pflanzenarten suchen, können mehr Farbgruppen erforderlich sein, und die Protokolle sollten optimiert werden, um diese Anforderung widerzuspiegeln. Die vorliegende Studie konzentrierte sich auf die Pollenproben, die von Honigbienenvölkern gesammelt wurden, die Pflanzen bestäubten, und mehrere Taxa wurden häufig in einer Farbgruppe gefunden, ähnlich wie frühere Studien 29,30,31.
Die Acetolyse löst die Lipide, Proteine und organischen Ablagerungen von der Oberfläche der Pollenkörner auf und enthüllt die Unterscheidungsmerkmale des Exins, so dass die Körner leichter gefärbt und identifiziert werden können. Es ist eine alte und gebräuchliche Methodik, die in vielen Arten der Pollenforschung verwendetwird 37. Die allgemeinen Schritte sind standardisiert; Sie unterscheiden sich wenig von Protokoll zu Protokoll. Die Besonderheiten der Zentrifugationsgeschwindigkeiten und -zeiten, der Inkubationstemperatur und -dauer, der pollenmengengesteuerten Reagenzienvolumina und sogar der Methode zur Entfernung von Überständen (Dekantieren vs. Pipettieren) müssen jedoch möglicherweise experimentell entsprechend den Forschungszielen und bis zu einem gewissen Grad der wahrscheinlich anzutreffenden Pollenarten optimiert werden48. Tatsächlich kann die Acetolyse wichtige diagnostische Merkmale des Pollens von einigen Taxa wie Malvaceae und Orchidaceae entfernen38. Daher sind nicht alle Pollen für Standardmethoden der Acetolyse geeignet. Wie bereits erwähnt, wurden diese Methoden in dieser Studie optimiert, um dominante Pflanzentaxonquellen von Pollen zu identifizieren, die von pflanzenbestäubenden Honigbienen gesammelt wurden. Details, die zu berücksichtigen sind, wenn die genaue Quantifizierung von Pollenkörnern Teil der Studie ist, wurden in diesem Papier nicht behandelt.
Der Einsatz von Lösungsmitteln und Säuren erfordert eine sorgfältige Planung, eine angemessene persönliche Schutzausrüstung (PSA) und eine verantwortungsvolle Abfallentsorgung (Abbildung 6). Es ist wichtig, dass Forscher den richtigen Weg zur Lagerung von Reagenzien und zur Entsorgung von Abfällen bestimmen, bevor sie mit einem Teil der Acetolyse beginnen. In diesem Labor werden Butylhandschuhe in jedem Teil des Prozesses verwendet, der Schwefelsäure und sogar Eisessig beinhaltet, da sie für beide Säuren weitaus bessere Abbau- und Permeationswerte aufweisen als Nitrilhandschuhe, ohne die Geschicklichkeit zu beeinträchtigen49. Es wäre ratsam, die Sicherheitsleitlinien der jeweiligen Institution zu konsultieren, um Empfehlungen zu geeigneten Handschuhen und anderen PSA49 zu erhalten. Die Zugabe von Eisessig vor dem Acetolyseschritt hilft, die Restfeuchte in der Probe zu entfernen und bereitet sie auf die wichtige Acetolysereaktion vor. Das Eisessigsäure-Schwefelsäure-Gemisch im Acetolyseschritt kann heftig mit Wasser reagieren, weshalb es wichtig ist, dass alle Glaswaren und Vorräte vollständig trocken sind und dass der Probe vor der Acetolyse jegliche Feuchtigkeit entzogen wird. Die Post-Acetolyse-Zugabe von Eisessig verdünnt und neutralisiert das Acetolysegemisch.
Insbesondere Ethanol und Eisessig können die Tinte von Mikrozentrifugenröhrchenetiketten auflösen, wenn diese Reagenzien auch mit lösemittelbeständigen Pens auf die Außenseite des Röhrchens tropfen. Überprüfen Sie die Tubenetiketten während des gesamten Prozesses häufig, um sicherzustellen, dass sie noch lesbar sind. Wenn es logistisch machbar ist, sollten Sie die Verwendung von LaserJet-gedruckten Etiketten als Schutz vor dieser Möglichkeit in Betracht ziehen. Die Art und Weise, wie Überstände dekantiert werden, beeinflusst, ob Reagenzien an der Außenseite der Mikrozentrifugenröhrchen heruntertropfen. Es ist wichtig, den Überstand mit einer selbstbewussten, glatten Hand zu dekantieren, was mit der Übung kommt. Es sollte darauf geachtet werden, dass Pollenproben aus dem Zentrifugenröhrchen während des Dekantierens nicht verloren gehen. Bei zu schnellem Dekantieren besteht die Gefahr, dass einige oder alle Pollenrückstände verloren gehen. Ein zu langsames Dekantieren kann dazu führen, dass der Überstand das Rohr hinunterläuft. Obwohl allgemein eine Inkubationstemperatur von 100 °C empfohlen wird, könnten Pollen bei dieser Temperatur in den in dieser Studie verwendeten Mengen (0,25 g) leicht “verkocht” werden, insbesondere wenn sie für etwas längere Zeiträume inkubiertwerden 29. Tatsächlich können Pollenkörner selbst bei 80 °C platzen oder anderweitig beschädigt werden, wenn sie zu lange in der Acetolysemischung verbleiben. Inkubationstemperatur und -dauer müssen sorgfältig bestimmt werden, um eine Zerstörung der Pollenkörner in der Probe zu vermeiden.
Die Färbung von Pollen erhöht die Definition und den Kontrast der Exine-Merkmale und erleichtert das Fotografieren und Identifizieren (Abbildung 7). Fünf Tropfen (aus einer Kunststofftransferpipette) von 1% Safranin O färbten effektiv 0,25 g Pollen. Verschiedene Pollen färben sich jedoch unterschiedlich. Wenn Pollenkörner zu leicht oder zu stark gefärbt sind, kann die Identifizierung schwierig sein. Wenn möglich, sollte das Volumen der Färbelösung, das benötigt wird, um die in der Studie erwarteten Pollenarten angemessen zu färben, vor Beginn der Verarbeitung der experimentellen Proben validiert werden. Wenn jedoch eine der experimentellen Proben nicht richtig gefärbt ist, kann sie korrigiert werden. Um eine zu stark gefärbte Pollenprobe aufzuhellen, spülen Sie die Probe mit Wasser und dann Ethanol ab. Wenn der Pollen nicht gut genug gefärbt ist, um Unterscheidungsmerkmale zu sehen, können ein paar zusätzliche Tropfen Fleck hinzugefügt werden. Der Fleck dieser Proben sollte vor der Zugabe von Glycerin überprüft werden. Ebenso kann etwas Versuch und Irrtum erforderlich sein, um das ideale Volumen von Glycerin für die Pollenreste zu bestimmen. Fünfzehn Tropfen Glycerin schützten die Proben in dieser Studie in geeigneter Weise vor dem Austrocknen und verdünnten gleichzeitig den Pollenrest auf eine Konzentration, die ideal für die nachgeschaltete Identifizierung mittels Lichtmikroskopie ist. Andere Mengen an Pollenrückständen können mehr oder weniger Glycerin erfordern, um Austrocknung zu verhindern und die Montage zu erleichtern.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Gretchen Jones (USDA-ARS, APMRU, College Station, TX) für die Unterstützung bei der Farbsortierung und Acetolyseanalyse. Diese Forschung wurde durch Forschungsgelder unterstützt, die R.R.S. von der Oregon State Beekeepers Association zur Verfügung gestellt wurden.
Materials
| #8 hardware cloth | 2.7 mm aperture | ||
| 10 mL graduated cylinder | |||
| 1000 uL micropipette tips | |||
| 1250 mL filter micropipette tips | |||
| 15 x 75 mm glass slides | Thickness: 0.93 mm – 1.05 mm | ||
| 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| 250 mL graduated Borosilicate glass beakers (x3) | VWR | 10754-952 | |
| 50 mL graduated Borosilicate glass beakers (x6) | VWR | 10754-946 | |
| 95% EtOH | Pharmco AAPER | 111000200DM55 | ACS/USP/Kosher grade |
| Butyl vinyl gloves | |||
| Centrifuge | 1060 x g maximum speed; horizontal swing preferred | ||
| Chemical safety goggles | |||
| Color guide | Pantone | SKU: GP1601A | Solid coated |
| Coverslip of 1 or 1.5 | Thickness: 0.13 mm – 0.19 mm | ||
| Distilled water | |||
| Forceps | |||
| Fume hood | |||
| Glacial acetic acid | BDH Chemicals | BDH3092 | ACS grade |
| Glass funnel | |||
| Glycerin | Humco | 103196001_1 | USP grade, 99.5%, anhydrous |
| Hazardous waste containers | |||
| Hive tool | |||
| Hot block | Must reach 80 degree C | ||
| Lab coat with long sleeves | |||
| Latex or polyurethane foam | |||
| Microscope | |||
| Nailpolish, clear | |||
| Nitrile gloves | |||
| P1000 pipette | VWR | ||
| Petri dish | |||
| Plastic spoon | |||
| Safranin | Ward's Science | 470302-322 | Lab grade |
| Smoker | For pollen trap installation | ||
| Sodium bicarbonate | EMD Millipore | SX0320 | ACS grade, powder |
| Squirt bottles (x2) | |||
| Sulfuric acid | EMD Millipore | SX1244 | ACS grade |
| Sundance Bottom Mount Pollen Trap | Betterbee Beekeeping Supply | PTRAPB | |
| Tape | |||
| Wooden stir sticks | |||
| Wooden tooth picks |
References
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