Quantitative Metabolomik von Saccharomyces Cerevisiae mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung und Quantifizierung von Hauptklassen wasserlöslicher Metaboliten in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Die beschriebene Methode ist vielseitig, robust und sensibel. Es ermöglicht die Trennung von Strukturisomeren und stereoisomeren Formen wasserlöslicher Metaboliten voneinander.
Abstract
Metabolomik ist eine Methodik zur Identifizierung und Quantifizierung vieler niedermolekularer Zwischenprodukte und Stoffwechselprodukte innerhalb einer Zelle, eines Gewebes, eines Organs, einer biologischen Flüssigkeit oder eines Organismus. Die Metabolomik konzentriert sich traditionell auf wasserlösliche Metaboliten. Das wasserlösliche Metabolom ist das Endprodukt eines komplexen zellulären Netzwerks, das verschiedene genomische, epigenomische, transkriptomische, proteomische und Umweltfaktoren integriert. Daher bewertet die metabolomische Analyse direkt das Ergebnis der Wirkung für all diese Faktoren in einer Vielzahl von biologischen Prozessen innerhalb verschiedener Organismen. Einer dieser Organismen ist die knospende Hefe Saccharomyces cerevisiae, ein einzelliger Eukaryot mit dem vollständig sequenzierten Genom. Da S. cerevisiae für umfassende molekulare Analysen geeignet ist, wird es als Modell für die Sezierung von Mechanismen verwendet, die vielen biologischen Prozessen innerhalb der eukaryotischen Zelle zugrunde liegen. Eine vielseitige Analysemethode zur robusten, empfindlichen und genauen quantitativen Bewertung des wasserlöslichen Metaboloms würde die wesentliche Methodik zur Sezierung dieser Mechanismen liefern. Hier stellen wir ein Protokoll für die optimierten Bedingungen der Stoffwechselaktivitätsabschreckung und wasserlöslichen Metabolitenextraktion aus S. cerevisiae-Zellen vor. Das Protokoll beschreibt auch den Einsatz der Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) zur quantitativen Analyse der extrahierten wasserlöslichen Metaboliten. Die hier beschriebene LC-MS/MS-Methode der nicht-zielgerichteten Metabolomik ist vielseitig und robust. Es ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung von mehr als 370 wasserlöslichen Metaboliten mit verschiedenen strukturellen, physikalischen und chemischen Eigenschaften, einschließlich verschiedener Strukturisomere und stereoisomerer Formen dieser Metaboliten. Zu diesen Metaboliten gehören verschiedene Energieträgermoleküle, Nukleotide, Aminosäuren, Monosaccharide, Zwischenprodukte der Glykolyse und Zwischenprodukte des Tricarbonzyklus. Die LC-MS/MS-Methode der nicht-zielgerichteten Metabolomik ist sensibel und ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung einiger wasserlöslicher Metaboliten in Konzentrationen von nur 0,05 pmol/μL. Die Methode wurde erfolgreich zur Beurteilung wasserlöslicher Metabolome von Wildtyp- und mutierten Hefezellen eingesetzt, die unter verschiedenen Bedingungen kultiviert wurden.
Introduction
Wasserlösliche Metaboliten sind niedermolekulare Zwischenprodukte und Stoffwechselprodukte, die zu essentiellen zellulären Prozessen beitragen. Diese evolutionär konservierten Prozesse umfassen die Umwandlung von Nährstoffen in nutzbare Energie, die Synthese von Makromolekülen, Zellwachstum und -signalisierung, Zellzykluskontrolle, Regulierung der Genexpression, Stressreaktion, postkonlationale Regulierung des Stoffwechsels, Aufrechterhaltung der mitochondrialen Funktionalität, vesikulärer Zelltransport, Autophagie, Zellalterung und regulierter Zelltod1,2,3.
Viele dieser wesentlichen Rollen wasserlöslicher Metaboliten wurden durch Studien in der Knospenhefe S. cerevisiae1, 3,4,7,9,14,15 , 16,17,18,19,20,21,22entdeckt. Dieser einzellige Eukaryot ist ein nützlicher Modellorganismus zur Sezierung von Mechanismen, durch die wasserlösliche Metaboliten aufgrund seiner Zugänglichkeit zu fortgeschrittenen biochemischen, genetischen und molekularbiologischen Analysen zu zellulären Prozessen beitragen23,24,25,26. Obwohl die LC-MS/MS-Methoden der nicht-zielgerichteten Metabolomik zur Untersuchung der Rolle wasserlöslicher Metaboliten in knospenden Hefen3,18,22,27verwendetwurden,erfordert diese Art der Analyse die Verbesserung ihrer Vielseitigkeit, Robustheit, Empfindlichkeit und Fähigkeit, zwischen verschiedenen strukturellen Isomeren und stereoisomeren Formen dieser Metaboliten zu unterscheiden.
Die letzten Jahre sind geprägt von signifikanten Fortschritten bei der Anwendung der LC-MS/MS-Methoden der nicht-zielgerichteten Metabolomik auf die Profilierung wasserlöslicher Metaboliten in vivo. Viele Herausforderungen bei der Verwendung dieser Methodik bleiben jedoch2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Zu diesen Herausforderungen gehören die folgenden. Erstens liegen die intrazellulären Konzentrationen vieler wasserlöslicher Metaboliten unter einer Empfindlichkeitsschwelle für die derzeit verwendeten Methoden. Zweitens ist die Effizienz des Abschreckens der Stoffwechselaktivität zu gering und das Ausmaß der abschreckenden Zellleckage von intrazellulären Metaboliten ist für aktuelle Methoden zu hoch; Daher unterschätzen die derzeit verwendeten Methoden die intrazellulären Konzentrationen wasserlöslicher Metaboliten. Drittens können die bestehenden Methoden die strukturellen Isomere (d. h. Moleküle mit der gleichen chemischen Formel, aber unterschiedlicher atomarer Konnektivität) oder Stereoisomere (d. h. Moleküle mit der gleichen chemischen Formel und atomaren Konnektivität, aber mit der unterschiedlichen atomaren Anordnung im Raum) spezifischer Metaboliten nicht unterscheiden; Dies verhindert die korrekte Annotation bestimmter Metaboliten durch die derzeit verwendeten Methoden. Viertens sind die vorhandenen massenspektralen Online-Datenbanken von Elternionen (MS1) und Sekundärionen (MS2) unvollständig; dies wirkt sich auf die korrekte Identifizierung und Quantifizierung spezifischer Metaboliten unter Verwendung der lc-MS/MS-Rohdaten aus, die mit Hilfe der aktuellen Methoden erzeugt wurden. Fünftens können die bestehenden Methoden keine einzige Art der Metabolitenextraktion verwenden, um alle oder die meisten Klassen von wasserlöslichen Metaboliten wiederherzustellen. Sechstens können die bestehenden Methoden nicht einen einzigen Typ der LC-Säule verwenden, um alle oder die meisten Klassen wasserlöslicher Metaboliten voneinander zu trennen.
Hier optimierten wir die Bedingungen für das Abschrecken der Stoffwechselaktivität in S. cerevisiae-Zellen, die Aufrechterhaltung der meisten wasserlöslichen Metaboliten in diesen Zellen vor der Extraktion und die Extraktion der meisten Klassen wasserlöslicher Metaboliten aus Hefezellen. Wir haben eine vielseitige, robuste und empfindliche Methode zur LC-MS/MS-basierten Identifizierung und Quantifizierung von mehr als 370 wasserlöslichen Metaboliten aus S. cerevisiae-Zellen entwickelt. Diese Methode der nicht zielgerichteten Metabolomik ermöglicht es, die intrazellulären Konzentrationen verschiedener Energieträgermoleküle, Nukleotide, Aminosäuren, Monosaccharide, Zwischenprodukte der Glykolyse und Tricarbonsäurezyklus-Zwischenprodukte zu beurteilen. Die entwickelte LC-MS/MS-Methode ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung verschiedener Strukturisomere und stereoisomerer Formen wasserlöslicher Metaboliten mit vielfältigen strukturellen, physikalischen und chemischen Eigenschaften.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um das hier beschriebene Protokoll erfolgreich zu verwenden, befolgen Sie die unten beschriebenen vorbeugenden Maßnahmen. Chloroform und Methanol extrahieren verschiedene Substanzen aus Laborkunststoffen. Behandeln Sie sie daher mit Vorsicht. Vermeiden Sie die Verwendung von Kunststoffen in Schritten, die Kontakt mit einem dieser beiden organischen Lösungsmittel beinhalten. Verwenden Sie für diese Schritte Borosilikatglaspipetten. Diese Pipetten vor Gebrauch mit Chloroform und Methanol aufsteigen lassen. Verwenden Sie…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Titorenko-Labors für Gespräche. Wir danken dem Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, dem Centre for Structural and Functional Genomics und dem Centre for Microscopy and Cellular Imaging (alle an der Concordia University) für herausragende Leistungen. Diese Studie wurde durch Zuschüsse des Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) von Kanada (RGPIN 2014-04482 und CRDPJ 515900 – 17) unterstützt. K.M. wurde durch das Concordia University Armand C. Archambault Fellowship und den Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence unterstützt.
Materials
| Chemicals | |||
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | R37108 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Hardware equipment | |||
| 500 ml centrifuge bottles | Beckman | 355664 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Beckman Coulter Centrifuge | Beckman | 6254249 | |
| Beckman Coulter Centrifuge Rotor | Beckman | JA-10 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Digital thermometer | Omega | HH509 | |
| Foam Tube Holder Kit with Retainer | Thermo Scientific | 02-215-388 | |
| SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) | Sigma Milipore | 150460 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm | Agilent Technologies | 883725-901 | |
| Laboratory materials | |||
| 2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| 15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| Software | |||
| Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
| Yeast strain | |||
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 | |
References
- Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
- Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
- Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
- López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
- Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
- Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
- Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
- Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
- Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive ‘hunger factor’ linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
- Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
- Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
- Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
- Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
- Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
- Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
- Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
- Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
- Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
- Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
- Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Génétique. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Génétique. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Génétique. 208 (3), 833-851 (2018).
- Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
- Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
- Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
- Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
- Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
- Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
- Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
- Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
- Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
- Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
- Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
- Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
- Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
- Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
- Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
- Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
- Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
- Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
- Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
- Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
- Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
- Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
