应用小鼠部分遗传类胚胎干细胞作为精子的替代品

所有动物实验均按照苏黎世州伦理委员会和苏黎世ETH分子健康科学研究所的EPIC动物设施的标准和规定，在ZH152/17许可证下进行。 注：此协议从删除H19和IG- DMR 开始。有关如何建立phaESC行的详细信息，请参阅已发表的报告10、13。本协议的概述和时间框架（第 14 步）在图 1A中提供：媒体、解决方案和缓冲区列在表1 中。建立DKO-phaESC线的程序（步骤1–6）显示在图1B中，构建半克隆胚胎的策略（步骤7–14）在图1C中描述。 1. 在噬菌体中删除 H19 -Dmr 和 Ig -dmr 的质粒的传输 准备CRISPR/Cas9质粒，以便共同表达Cas9核糖核酸，并引导RNA针对 H19-DMR和 IG-DMR的删除。利盖特四对指南RNA寡头（H19-DMR-gRNA1-F，R：H19-DMR-gRNA2-F，R：IG-DMR-格纳1-F，R：IG-DMR-gRNA2-F，R列在 表2）到pX330质粒。注：参照已公布的议定书，详细程序准备这4个CRISPR/Cas9质粒14。或者，一般小鼠菌株的质粒也可以通过存储库（材料表）访问。 在 37 °C 的孵育下 10 分钟，用 1 mL 的 0.2% 明胶溶液涂抹 6 井板的一口井的表面。 板 2 × 105 野生型噬菌体在明胶涂层井在 HAESC 介质没有抗生素， 并在 37 °C 在 5% CO2 大气中孵育板 1 天.注意：从介质中省略抗生素，以提高后续唇切除术的效率。我们在第10段使用了野生型的噬菌体。我们建议使用早期通道，但各种通道编号已成功使用8个。通道数与获得半克隆胚胎和小鼠的效率之间的相关性目前尚不清楚。 在 6 井板的井中 （从步骤 1.3） 与 6 个质粒同时使用唇切除试剂： 50 ng 小猪巴克 质粒携带 CAG-EGFP 转基因， 50 ng 猪巴克 转置酶质粒， 和 600 ng 的 4 CRISPR/Cas9 质粒 （从步骤 1.1） 。参照制造商关于转染详细程序的协议。注：两 个猪巴斑 块用于将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）无处不在的转子整合到噬菌体的基因组中。如果不需要对细胞进行 GFP 标记，则这两个质粒可以由 CRISPR/Cas9 质粒代替荧光蛋白的瞬时表达（例如 pX458 质粒），而不是 pX330 质粒之一。然后，瞬态 EGFP 表达可用于对瞬变的细胞进行排序。 输血两天后，吸气介质，并添加 800 μL 的三氯辛。 在 5% CO 2 大气中以 37 °C 孵化板5 分钟。然后，加入 2 mL 的洗涤缓冲器以淬灭 trypsin，并多次使用移液器以获得单个细胞悬架。 将细胞悬架转移到 15 mL 管中。 在 160 x g 下将管子离心 5 分钟，并去除超自然。 将细胞颗粒重新插入 400 μL 的 HAESC 维护缓冲区，并辅以 15 微克/mL 霍奇斯特 33342。注：为了减少霍奇斯特33342的潜在毒性，使用了1μg/mL霍奇斯特33342和50微米维拉帕米尔，而不是15微克/mL霍奇斯特3334215。 在 5% CO2 大气中在 37 °C 孵化细胞悬架 15 分钟。孵化后，通过细胞过滤器盖将细胞悬架转移到 5 mL 管中，并将管保持在 4 °C，直到准备在下一步（第 2 节）中使用。 2. 使用流动细胞仪对转染的噬细胞进行单细胞电镀 在分拣已转化的噬菌体的前一天，在明胶涂层的96井板上，板辐照小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），密度为4×MEF介质中的104个细胞/厘米2。通常，6 个板准备建立一个有针对性的删除的 phaESC 线。在 5% 的 CO2大气中以 37 °C 孵化板。注：辐照的 MEF 可在商业上获得。我们使用来自DRS4小鼠E12.5胚胎的MEF。虽然没有 MEF，HAESC 可以在明胶涂层板上生长，但我们建议 MEF 提高分拣单 HAESC 的可行性。 在分拣当天，从 96 井板中吸气 MEF 介质，每井添加 120 μL 的新鲜 HAESC 介质。将板保持在 37 °C 的 5% CO2 大气中。 根据制造商的说明，使用 100μm 喷嘴设置细胞分拣机。355 nm 紫外线激光器和 488 nm 蓝色激光分别用于激发霍奇斯特 33342 和 EGFP 荧光。注：或者，通过 405 nm 的激发可以检测到霍赫斯特 33342。 使用门对 5 mL 管中的转染性噬细胞进行排序（从步骤 1.10 开始），用于收集 G1/S 阶段显示 EGFP 表达的杂质细胞。从步骤 2.2 将一个单元格沉积到 96 井板的每口井中。注：对Harchst 33342染色物的检测通常区分3个1n、2n和4nDNA含量的细胞峰值，分别对应于G1阶段的单体细胞、G2/M相中的单体细胞和G1相中的双倍体细胞的混合物，以及G2/M相中的双倍体细胞。G1/S 阶段的类固醇细胞被确定为强度较低的霍奇斯特 33342 荧光的峰值。图 2A中显示了一个具有代表性的结果和一个分拣门。 电镀后，在 5% CO2 大气中以 37 °C 的 96 井板孵育。 3. 转染性噬菌体的亚克隆 单细胞电镀三天后，可以在显微镜下观察到96井板的几口井。标记只有单个菌落生长的井。注：根据我们的经验，在96口井板的20%-40%的井中观察到单个菌落。 在单细胞电镀后的第 4 天，用单个菌落在井中用新的 HAESC 介质替换一半的介质。 传递前一天（单细胞电镀后的第 4 天或第 5 天），板在明胶涂层的 96 井板上辐照 MEF，密度为 4 × 104 细胞/cm2 在 MEF 介质中。将板保持在 37 °C 的 5% CO2 大气中。 经过 5 或 6 天的单细胞电镀，选择直径大于 150μm 的 96 井板中的单个菌落的井。注：最好选择大约 100 口油井，以建立一条带有目标 DMR 删除的 phaESC 生产线。 在选定的油井中吸气介质，并添加 30 μL 的三氯辛。在 5% 的 CO2 大气中以 37 °C 的 96 井板孵育 5 分钟。然后，在每口井中加入 30 μL 的洗涤缓冲液，以淬灭试穿素。 在每个井中加入 140 μL 的 HAESC 介质，并多次使用移液器以获得单个细胞。 从步骤 3.3 准备的 96 井板的井中吸气 MEF 介质。 将每口油井的噬菌体从步骤 3.6 转移到新 96 井板的新井中，从步骤 3.7 转移到新井板。 在 5% 的 CO2 大气中，在 37 °C 处孵化含有 phaESC 亚clone 的 96 井板。 第二天，从每口井中吸气所有介质，并添加 120 μL 的新 haESC 介质。在 5% 的 CO2 大气中以 37 °C 孵化板。 在细胞成为通路的汇流器的前一天，在明胶涂层的24井板上将辐照的MEF放在密度为4×104 个细胞/厘米2 的MEF介质上。将板保持在 37 °C 的 5% CO2 大气中。 当噬菌体成为通路的汇流物时，吸气介质并添加 30 μL 的 trypsin。在 37 °C 下孵化 96 井板 5 分钟。 将 90 μL 的洗涤缓冲器添加到每口井中，以淬灭试穿素。多次派珀特获得单细胞。 从步骤 3.11 开始，从 24 井板的井中吸气 MEF 介质，并添加 600 μL 的新鲜 HAESC 介质。 将第 3.13 步中每口井中悬浮的 phaESC 子片的 60μL 从步骤 3.14 转移到 24 井板的新井中。在第 4 步中保留每个 phaESC 子片段的剩余悬浮，用于 DNA 提取和基因交配。 在 5% 的 CO2 大气中，将 24 井板与 phaESC 子片在 37 °C 中孵化。 在细胞培养物达到通过密度的前一天，在明胶涂层的 6 井板上将辐照的 MEF 板放在密度为 4 × 104 细胞/cm2 的 MEF 介质上。将板保持在 37 °C 的 5% CO2 大气中。 当噬菌体变得足够汇流通过，吸气介质，并添加250μL的三氯苯二甲酸酯。在 37 °C 下孵化 24 井板 5 分钟。注意：在第 4.9 步进行基因化后，只需通过删除 H19-DMR 和 IG-DMR的 phaESC 线。 将 750 μL 的洗涤缓冲器添加到每口井中，以淬灭试穿素。多次获得单细胞悬架。将细胞悬架转移到 15 mL 管中。 以 160 x g 的速度将管子离心 5 分钟，取出超母体，并在 2 mL 的 HAESC 介质中重新注入细胞颗粒。 从步骤 3.17 开始，从 6 井板的井中吸气 MEF 介质。将每根管子的phaESC悬架从步骤3.20转移到一口新井中。将板保持在 37 °C 的 5% CO2 大气中。 通过重复步骤 3.17 到 3.21 来扩展细胞克隆，并增加板大小和 trypsin、洗涤缓冲器和 haESC 介质的体积。为每个子克隆的 phaESC 系列 MEF 准备一个 T25 烧瓶，用于第 5 步。注：我们建议在进入第 5 步之前，将每个亚克隆 phaESC 线的注释冻结在 300 μL 的冷冻介质中，并在液氮储存中保留低温素。 4. 与 MEF 的亚克隆噬菌体线的第一次基因对比 要从步骤 3.15 的剩余细胞悬架中提取基因组 DNA，在 96 井板的每口井中加入 200 μL 的裂解缓冲器。将细胞悬架转移到 1.5 mL 管中。用额外的 200μL 裂解缓冲器冲洗每口井，以恢复所有剩余的细胞，并收集在同一个 1.5 mL 管中。 在 55 °C 的 55 °C 下孵育 1.5 mL 管，混合 3 小时。 孵化后，在每根1.5mL管中加入460μL的异丙酚，轻轻混合，直到DNA沉淀物可见。 以 10，000 x g ≥ 5 分钟的速度将管子离心，并去除超大物。用 200μL 的 70% 乙醇清洗 DNA 颗粒。 以 10，000 x g ≥ 5 分钟的速度将管子离心，并去除超大物。 将管子在空气中干燥10分钟，然后用20μL的水补充DNA。 按照制造商的协议，使用可热DNA聚合酶执行聚合酶链反应 （PCR）。注：PCR 的引言对列在表 2中，使用如下：H19-DMR-P1 和 P3（已删除的H19-DMR 为 407 bp）;H19-DMR-P2 和 P3（野生型H19-DMR 为 623 bp）;IG-DMR-P1和P3（删除IG-DMR的319个基点）;IG-DMR-P2和P3（野生类型IG-DMR的492 bp）。所有引言对的 PCR 温度配置文件如下： 30s 98 °C， 35 x （10 s 98 °C， 20s 56 °C， 30 s 72 °C）， 5 分钟 72 °C. H19-DMR和IG-DMR删除的放大脱氧核糖核酸片段的长度显示了一些变化，因为与 CRISPR/Cas9 介解编辑相关的非同源端连接。噬菌体是用MEF培养的，其中含有野生型H19-DMR和IG-DMRDNA。 因此，放大野生型DNA片段的H19-DMR-P2/P3和IG-DMR-P2/P3的引物对信息不丰富。 但是，这些引座对包含为控件，并且应在所有反应中给出一个波段。 通过糖凝胶电泳分析PCR片段。参照已公布的关于电泳16详细程序的协议。 通过删除 H19-DMR和 IG-DMR来识别细胞线。电泳的代表性图像显示在 图2B中。注：在我们的例子中，在135个亚克隆的phaESC线中发现了8个删除 H19-DMR和 IG-DMR的细胞系。 5. 亚克隆phaESC线的单体细胞净化 当步骤 3.22 的 T25 烧瓶中的亚克隆 phaESC 培养物变得足够密集，用于传递时，吸气介质并添加 1.5 mL 的 trypsin。在 37 °C 下孵化烧瓶 5 分钟。然后，添加 4.5 mL 的洗涤缓冲器和移液器几次，以获得单细胞悬架。 将每个单元格悬架传输到 15 mL 管中，并在 160 x g 下离心管 5 分钟。去除超自然物，在 400 μL 的 HAESC 维护缓冲区中重新插入细胞颗粒，并辅以 15 μg/mL 霍奇斯特 33342。 在 37 °C 下孵化细胞悬架 15 分钟。孵化后，通过细胞过滤器盖将细胞悬架转移到5mL管中。用额外的 400 μL 的 HAESC 维护缓冲器冲洗细胞过滤器盖，并在同一 5 mL 管中收集剩余的细胞。将管子保持在4°C，直到准备排序。 根据制造商的说明设置带 100μm 喷嘴的流量细胞计。注：霍赫斯特33342可在405纳米时通过激发检测到。在这里，355 nm 紫外线激光器用于检测霍赫斯特 33342。 设置细胞悬架（从步骤 5.3 开始）和包含 2 mL 的 HAESC 维护缓冲器的新的 15 mL 管，以收集流动细胞计的分拣细胞。 开始分析，并设置分拣门，以收集G1/S阶段的类胡萝卜素细胞。请参阅 图 2A 中的直方图，以识别 G1/S 阶段的噬菌体人口。注：由于第 2 步中双倍体细胞的完全二倍体化或错误电镀，某些亚克隆的噬菌体线可能不包含任何单体细胞。如果在 G1/S 阶段未观察到类固醇细胞，则无需排序即可进入另一个样本。在我们的例子中，5个细胞系包含单体细胞，3个细胞系只包含8个亚克隆phaESC线中的双倍体细胞。 细胞分拣后，沿 15 mL 收集管的墙壁添加 5 mL 的洗涤缓冲器。在160 x g 下将管子离心5分钟。去除超自然。 根据分拣细胞的数量选择适合培养的板。使用96井板、24井板和12井板的单井分别培养1，000-40，000个细胞、40，000-200，000个细胞和200，000-400，000个细胞。分别以 120 μL、600 μL 和 1.2 mL 的 HAESC 介质来补充细胞颗粒。注意：在高密度下对细胞进行平板，因为低汇流会导致细胞在分拣后死亡。从现在起，在没有MEF的明胶涂层井上培养噬菌体，以促进第6步的基因化，以及随后从第9步开始申请细胞内注射。 将细胞悬架转移到适当大小的明胶涂层井中后，在 5% CO2 大气中以 37 °C 孵育板。 继续扩展 phaESC 文化，重复步骤 3.18 到 3.21，增加板尺寸，增加 trypsin、洗涤缓冲器和 HAESC 介质的体积。这些细胞在没有MEF的明胶涂层井上培养。 对于每个子克隆的phaESC线，分别在24井板的一口井和6井板的一口井中分别准备一个培养物，用于步骤6和9。注：在进入第 9 步之前，应将每个亚克隆 phaESC 线的某些细胞冻结在 300 μL 的冷冻介质中，作为液氮储存罐中的低温素。 6. 没有 MEF 的亚克隆噬菌体线的第二次基因对比 注：进行第二轮基因对比，以确认亚克隆的phaESC线具有H19和IG-DMR的缺失，并且在去除MEF后不存在野生型等位基因。 在显微镜下确认，第5.11步的24口井板井中的培养物不含MEF。注意：如果观察到 MEF，则有必要继续传递这些文化，直到 MEF 消失，以避免使用来自 MEF 的野生型 DNA 对 PCR 造成污染物。 从汇合培养物中吸气介质，并在 24 井板的每口井中添加 400 μL 的裂解缓冲器。多次管状后，将细胞悬架转移到 1.5 mL 管中。 在 55 °C 的 55 °C 下孵育 1.5 mL 管，混合 3 小时。 孵化后，在1.5 mL管中加入400μL的异丙酚，轻轻混合，直到DNA沉淀物可见。 以 10，000 x g 的≥离心管 5 分钟，取出超自然。用 200μL 的 70% 乙醇清洗 DNA 颗粒。 以 10，000 x g 的≥离心管 5 分钟，取出超自然。 将管子在空气中干燥10分钟，然后用50微l的水补充DNA。 在第 4.7 步之后执行基因型 PCR，在第 4.8 步中进行凝胶电泳，以识别具有 H19和 IG- DMR 的删除并且不含野生类型等位基因的细胞系。注： 图 2B 中显示了典型的第二代基因分析的图像，以供参考。在我们的例子中，在单体细胞净化（第5步）之后选择的所有5个细胞系都来自野生型等位基因，并且只拥有 H19和 IG-DMR的删除等位基因。 使用在此第二个基因输入后选择的子克隆 phaESC 线作为 DKO-phaESC 线。 7. 老鼠的超排卵 对于 MII 卵母细胞的生产，在卵母细胞收集前 63–65 h 中，通过在怀孕母马血清性腺激素 （PMSG） 溶液中注射 5 IU 启动超排卵。注：本协议建议使用B6D2F1小鼠菌株，因为B6D2F1卵母细胞能很好地耐受细胞内注射，并在程序17后表现出很高的发育潜力。 PMSG注射后48小时，内皮注射5IU的人类胆汁性腺激素溶液到每只小鼠。 8. 卵母细胞集合 在一口井中准备一个4井板，其中含有700μL的透明质介质，在剩下的3口井中准备700微升的M2介质。此外，准备一个6厘米的菜与7 mL的M2介质和一个中心井菜与900μL的M16介质。在 5% 的 CO2 大气中，在 37 °C 的温度下预热盘子和菜肴。 在细胞内注射的当天，早上8点左右，通过颈椎脱位或CO2 吸入对超排卵女性（从第7.2步开始）实施安乐死。使用钳子和剪刀解剖卵子。将紫菜与 M2 介质放在 6 厘米的菜中。 通过用 30 G 针撕裂卵管的安普拉来释放积水细胞复合物 （COCs）。将 COC 转移到预热透明质介质中，并在 5% 的 CO2 大气中保持在 37 °C。 2–3分钟后，用口移液器收集无积水卵母细胞，将卵母细胞转移到4井板其他3口井中的新鲜M2介质中洗3次。 收集元相II（MII）卵母细胞，它拥有第一极地体，在中井盘与M16介质，并保持板在37°C在5%的CO2 大气，直到用于细胞内注射在第12步。 9. DKO-噬菌体的治疗和收集 在无 MEF 的 6 井板井中准备 DKO-phaESC 文化，在细胞内注射前一天以 60-80% 的对流度（从步骤 5.11 开始）。 为了在M相诱导细胞周期阻滞，完全吸气介质，并添加含有0.05毫克/mL脱甲酸酯的2mL的haESC介质。 经过8小时的脱甲酸酯治疗后，吸气介质，并加入800μL的三氯辛。 在 5% CO2 的大气中在 37 °C 下孵化板 5 分钟，然后加入 2 mL 的洗涤缓冲器以淬灭 trypsin，并多次使用移液器获得单细胞悬架。 将细胞悬架转移到 15 mL 管中。在 160 x g 下将管子离心 5 分钟，并去除超自然。 将细胞颗粒重新插入 400 μL 的 HAESC 维护缓冲区，其中包含 15 μg/mL 霍奇斯特 33342。 在 5% CO2 大气中在 37 °C 孵化细胞悬架 15 分钟。孵化后，通过细胞过滤器盖将细胞悬架转移到 5 mL 管中，并将管保持在 4 °C，直到细胞分拣到第 10 步。 10. 净化M相逮捕的DKO-噬菌体 根据制造商的说明设置带 100μm 喷嘴的流量细胞计。注：霍赫斯特33342可在405纳米时通过激发检测到。在这里，355 nm 紫外线激光器用于检测霍赫斯特 33342。 从步骤 9.7 中设置 M 相逮捕的 DKO-噬菌体，并开始分析。选择一个合适的分拣门，从用脱甲酸酯处理的样品中收集单体M相细胞（2n）。注：经过脱甲酸酯治疗后，预计有2个细胞群，与 图3B中显示的单体细胞和双倍体M相逮捕细胞相对应。脱氧核糖核酸治疗后的细胞循环阻滞完成，因此，没有观察到单体1nDNA峰值。这一点很重要，因为单体M相细胞和双体G1细胞具有相同的DNA含量（2n），并会产生重叠的峰值。 设置一个包含 2 mL 的 HAESC 维护缓冲器的 15 mL 管，以收集流细胞仪中的排序单元。开始单元格排序。 细胞分拣后，沿收集管壁添加 5 mL 的洗涤缓冲。在 160 x g 下将管子离心 5 分钟，并去除超自然。 将细胞以适量的 HAESC 维护缓冲器中重新供用，以获得最终浓度为 5 x 105 细胞/mL。 将细胞悬架转移到 1.5 mL 管中。将管子保持在冰上，直到准备好在第 12 步进行细胞内注射。 11. 准备持有和微注射移液器 注意：执行内质注射（第12步），需要几个保持和微注射移液器（图4A）。这些移液器可以根据商业供应商的量身定做需求购买，也可以使用微型皮带拉拔器和微型锻件由合适的玻璃毛细管制成。 将玻色酸玻璃毛细管拉到微皮拉器上。要拉无细丝的玻色酸玻璃毛细细毛（0.78 x 1.00 x 80 mm），以下参数为燃烧水平拉子（材料表）作为参考， 但其他仪器和玻璃毛细管类型会有所不同：热 510（Ramp 测试 480）、拉 0、速度 150、时间 175 和压力 200 用于握管件：热 510 （Ramp 测试 480）， 拉 90， 速度 140， 时间 125 和压力 200 微注入移液器.注意：最佳参数需要单独定义，因为包括湿度、微皮拉器模型和大量玻璃毛细管在内的几个因素会影响注射移液器的形状。应瞄准具有逐渐锥形的拉长形状。 准备手持移液器 将第 11.1 步准备的一个拉毛细金设置为微型锻件。将毛细金放在灯丝上的玻璃珠上，降低毛细金，在加热灯丝时与玻璃珠接触。 通过关闭加热和从玻璃珠分离来打破毛细金，使其外径为 60–100 μm。 水平放置毛细金尖，以面对灯丝上的玻璃珠。 加热灯丝，使毛细细金尖的内径融化到直径为 10–20 μm。 移动毛细毛，使玻璃珠的位置在一个点~1毫米从毛细金尖没有接触。加热灯丝，使毛细管以 20° 角弯曲。从微型锻件上卸下毛细管，称为手持式移液器。注意：为了测量毛细纸的大小，最好在微型锻件中安装目镜抽搐。 微注射移液器的制备 将第 11.1 步准备的一个拉毛细金设置为微型锻件。将毛细金放在灯丝上的玻璃珠上，降低毛细金，在加热灯丝时与玻璃珠接触。 关闭加热并脱离玻璃珠的位置，使其外径为 6 μm，从而打破毛细金。 移动毛细毛，使玻璃珠的位置在一个点~1毫米从毛细金尖没有接触。加热灯丝，使毛细管以 20° 角向上弯曲。将微注入移液器从微型锻件中拆下，存放在安全箱中供以后使用。注：微注入移液器具有以下规格：外径6微米：内径，4.5+5μm;弯曲角，20°。定义微注射移液器的最佳设计对于细胞内注射的成功非常重要。内径过大可防止供体DKO-phESC血浆膜破裂（见讨论部分）。如果内径太窄，可能会妨碍捐赠者 DKO-phESC 的平滑管道输送。弯曲角 < lt; 30° 是可取的，因为高弯曲角阻碍了压子脉冲的效果。 12. DKO-噬菌体的细胞内注射 在细胞内注射（从步骤 12.2 开始）之前，通过在包含 0.6 克 PVP 的 50 mL 管中加入 5 mL M2 介质并鼓动摇杆上的管子在 4 °C 下搅拌 2 天，准备多基皮罗利酮 （PVP） 溶液。PVP 完全溶解后，溶液经过无菌过滤，储存在 4 °C。 在细胞内注射的当天，用 900 μL 的 KSOM 介质准备一个中心井菜，并在 5% CO2 大气中预热 37 °C 的菜。 将 5 μL PVP 溶液和 20 μL M2 介质的滴对齐放在倒置的 10 厘米盘盖上，准备微操纵盘。用矿物油盖住水滴，将菜放在注射显微镜的舞台上。注：微操纵盘的建议排列显示在 图4B中。 将手持式移液器安装到微操纵器上。使用微加载器尖端将微注入移液器装满氟碳油，并将其安装在压电执行器上。 将微注射移液器浸入液中，用 PVP 溶液和移液器上下多次涂抹 PVP 玻璃，使其不那么粘稠。将少量 PVP 溶液加载到微注入移液器中，并将移液器移动到 M2 介质下滴。 将手持式移液器浸入 M2 介质中，并聚焦于掉落底部的移液器。 将大约 2μL 的 DKO-phaESC 暂停从步骤 10.6 转移到 M2 中等下降。 使用口移液器将 10 MII 卵母细胞从步骤 8.5 转移到相同的 M2 中等下降。 对于注塑，在 M2 中下滴中旋转卵母细胞，使周边空间面对微注入移液器，MII 板不位于微注入移液器（图 4A）的路径上。通过通过保持移液器施加负压来保持卵母细胞。注：MII板在视觉上被识别为卵母体的突出，称为”驼峰”，通常位于第一个极地体旁边。MII 板包含带有附加染色体的美感主轴。必须避免触摸微注射移液器和MII板，因为主轴和染色体的机械损伤会破坏胚胎发育。 通过施加温和的负压，将一个 DKO-phaESC 加载到微注入移液器的尖端。通过管道破裂DKO-phaESC的等离子膜，以避免注入完好的DKO-phaESC（图3C;见讨论）。注：如果DKO-噬菌体的等离子膜未通过管道破裂，请丢弃DKO-phaESC并加载另一个DKO-phaESC。 将微注入移液器与卵母细胞的佐纳颗粒接触，并在微注入移液器内施加少量负压。 应用压子脉冲（强度，20;频率，4）突破僵尸，同时将微注入移液器的尖端推向近视线空间。确认包含主轴和染色体的 MII 板不位于微注入移液器的路径上。注意：经验上将设置调整到最低的压子脉冲，用于钻穿 Zona，以最大限度地减少对卵母损坏的可能性。 从微注入移液器中丢弃佐纳佩卢西达的碎片，并将 DKO-phaESC 放置在移液器的边缘。 用微注入移液器穿透卵母细胞，使卵母到达对面。注意：不要触摸 MII 板，以防止主轴和染色体损坏。 应用压子脉冲（强度，6;频率，1）刺穿卵母。确保欧莱玛沿着微注入移液器的轴放松。注：经验上定义压子脉冲的最低设置，以打破卵母，以尽量减少对卵母细胞的损害。 将DKO-phaESC以最小体积的介质注入卵母细胞，并顺利地从卵母细胞中取出微注入移液器。 从保持的移液器中释放注入的卵母细胞，并将其放在微滴的一侧，供以后收集。 重复 M2 中下垂中其他 MII 卵母细胞从步骤 12.9 到 12.17 的注射过程。注意：避免将卵母细胞挡在孵化器之外超过20分钟。根据我们的经验，一批10个卵母细胞可以在适当的训练后15分钟内舒适地操纵。 将一批注入的卵母细胞从 M2 中等滴转移到带有 KSOM 介质的预热中井盘。 将菜保持在37°C的5%CO2 大气中1小时。 重复从步骤 12.5 和 12.20 的卵母细胞操作与额外的 MII 卵母细胞组，以获得足够的注射卵母细胞。 13. 激活构造的半克隆胚胎 准备两个中心井菜肴，每个 900 μL 的 KSOM 介质和激活介质。准备一个4井板，每口井中配有700μL的KSOM介质。在 5% CO2 的大气中，在 37 °C 的温度下预热菜肴和盘子。 在 KSOM 介质中 1 小时后，将注入的卵母细胞从步骤 12.21 转移到具有激活介质的预热中心井盘中。 将菜保持在 37 °C 的 6 小时，在 5% 的 CO2 大气中激活。 激活后，观察一些半克隆胚胎形成三个极地体，它们是卵母细胞的第一个和第二个极地体，以及来自DKO-phaESC（图3E）的伪极体。 将胚胎移植到4井板中带有KSOM介质的新油井中，将胚胎洗3次。 将胚胎转移到具有KSOM介质的中井盘中，并将培养皿保持在37°C的5%CO2 大气中，以进一步发展。 14. 开发构造的半克隆胚胎 经过KSOM介质从步骤13.6的1天培养，几个半克隆胚胎达到2细胞阶段（图5A）。 为了进一步发展体外预植胚胎，在5%的二氧化碳大气中，继续在KSOM介质中以37°C培育半克隆胚胎。在第2天将半克隆胚胎转移到新的KSOM介质中。在第4天，几个胚胎将到达胚波细胞阶段（图5A）。 对于半克隆小鼠的衍生，将2细胞胚胎从第14.1步转移到伪怀孕受体女性的卵子中。通过在胚胎移植前一天与输精管切除的男配来识别伪怀孕女性，并根据当天早晨胚胎移植（ 0 . 5 天后）有清晰可见的插头来选择她们。大约 19.5 dpc， 全期幼崽自然从接受女性 （图 5B） 交付。