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Immunologie et infection

Campionamento ed elaborazione della spazzolatura nasale mediante videomicroscopia ciliare digitale ad alta velocità – Adattamento alla pandemia COVID-19

Published: November 07, 2020
doi:
10.3791/61949
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1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center,University of Liège, 2Department of ENT,University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit,University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics,University of British Columbia and British Columbia Children’s Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology,University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège

Summary

Per garantire un’analisi funzionale ciliare di successo e di alta qualità per la diagnosi di PCD, è essenziale un metodo preciso e attento per il campionamento e il trattamento dell’epitelio respiratorio. Per continuare a fornire un servizio diagnostico PCD durante la pandemia COVID-19, il protocollo di videomicroscopia ciliare è stato aggiornato per includere adeguate misure di controllo delle infezioni.

Abstract

La discinesia ciliare primitiva (PCD) è una ciliopatia genetica mobile, che porta a una significativa malattia otosinopolmonare. La diagnosi di PCD è spesso mancata o ritardata a causa di sfide con diverse modalità diagnostiche. La videomicroscopia ciliare, che utilizza la videomicroscopia digitale ad alta velocità (DHSV), uno degli strumenti diagnostici per la PCD, è considerata il metodo ottimale per eseguire l’analisi funzionale ciliare (CFA), che comprende l’analisi della frequenza del battito ciliare (CBF) e del pattern di battito (CBP). Tuttavia, il DHSV manca di una procedura operativa standardizzata e pubblicata per l’elaborazione e l’analisi dei campioni. Utilizza anche l’epitelio respiratorio vivente, un significativo problema di controllo delle infezioni durante la pandemia di COVID-19. Per continuare a fornire un servizio diagnostico durante questa crisi sanitaria, il protocollo di videomicroscopia ciliare è stato adattato per includere adeguate misure di controllo delle infezioni.

Qui, descriviamo un protocollo rivisto per il campionamento e l’elaborazione di laboratorio di campioni respiratori ciliati, evidenziando gli adattamenti apportati per conformarsi alle misure di controllo delle infezioni COVID-19. Vengono descritti i risultati rappresentativi del CFA da campioni di spazzolatura nasale ottenuti da 16 soggetti sani, elaborati e analizzati secondo questo protocollo. Illustriamo anche l’importanza di ottenere e trattare strisce ciliate epiteliali di qualità ottimale, poiché i campioni che non soddisfano i criteri di selezione della qualità ora consentono CFA, riducendo potenzialmente l’affidabilità diagnostica e l’efficienza di questa tecnica.

Introduction

La discinesia ciliare primitiva (PCD) è una ciliopatia mobile eterogenea ereditaria, in cui le ciglia respiratorie sono stazionarie, lente o discineetiche, portando a compromissione della clearance mucociliare e malattia cronica oto-sino-polmonare 1,2,3,4. Le manifestazioni cliniche della PCD sono tosse umida cronica e congestione nasale cronica che inizia nella prima infanzia, infezioni ricorrenti o croniche del tratto respiratorio superiore e inferiore che portano a bronchiectasie e otite media e sinusite ricorrenti o croniche 5,6,7. Circa la metà dei pazienti con PCD presenta difetti di lateralità d’organo come situs inversus o situs ambiguus. Alcuni pazienti presentano anche problemi di infertilità dovuti allo sperma immobile negli uomini e alle ciglia immobili nelle tube di Falloppio nelle donne 1,2,8. La PCD è rara, ma la prevalenza è difficile da definire e varia da 1:10.000 a 1:20.000 9,10. Tuttavia, si ritiene che la reale prevalenza della PCD sia più elevata a causa delle difficoltà nella diagnosi e della mancanza di sospetto clinico. I sintomi della PCD imitano le manifestazioni respiratorie comuni di altre condizioni respiratorie acute o croniche e le sfide diagnostiche nel confermare la diagnosi sono ben note, portando a un trattamento e a un follow-up inadeguati 2,5,9,11.

La videomicroscopia ciliare, che utilizza la videomicroscopia digitale ad alta velocità (DHSV), è uno degli strumenti diagnostici per PCD 4,8,12,13. Il DHSV è considerato il metodo ottimale per eseguire l’analisi funzionale ciliare (CFA), comprendente l’analisi della frequenza del battito ciliare (CBF) e del pattern di battito (CBP) 2,14,15,16. DHSV utilizza epitelio respiratorio vivente, di solito ottenuto dalla spazzolatura nasale13.

Alla luce dell’attuale epidemia di COVID-19, la conferma di una diagnosi di PCD è ora ancora più importante in quanto l’evidenza suggerisce che la malattia respiratoria sottostante può portare a esiti peggiori dopo l’infezione da COVID-1917,18. Un servizio diagnostico di PCD sicuro ed efficiente durante l’attuale pandemia consentirà inoltre ai pazienti PCD confermati di beneficiare di misure protettive aggiuntive, rispetto alla popolazione generale19.

La trasmissione di COVID-19 avviene principalmente attraverso la diffusione delle goccioline20. L’alto potenziale di trasmissione da pazienti asintomatici (o minimamente sintomatici) è suggerito dall’elevata carica virale nel campione nasale20. Inoltre, se le particelle virali vengono aerosolizzate, rimangono nell’aria per almeno 3 ore21. Pertanto, gli operatori sanitari respiratori sono esposti a un elevato serbatoio di carica virale durante l’esecuzione di cure cliniche e raccolta di campioni per le tecniche diagnostiche22. Inoltre, la manipolazione di campioni respiratori viventi espone il tecnico alla contaminazione da COVID-19. Mentre le raccomandazioni sulle migliori pratiche per i medici respiratori e i chirurghi ORL che si prendono cura dei pazienti COVID-19 vengono implementate23, mancano raccomandazioni per l’esecuzione del DHSV durante la pandemia di COVID-19.

Al fine di continuare a fornire un servizio diagnostico PCD, garantendo al contempo la sicurezza dell’operatore sanitario (esecuzione della raccolta dei campioni) e del tecnico (esecuzione dell’elaborazione dei campioni), il protocollo di videomicroscopia ciliare ha dovuto essere adattato durante la pandemia di COVID-19. La tecnica della videomicroscopia ciliare è attualmente limitata ai servizi di ricerca e ai centri diagnostici specializzati, in quanto la CFA richiede una vasta formazione ed esperienza. Inoltre, attualmente, vi è una mancanza di standardizzazione e di una procedura operativa precisa per l’elaborazione e l’analisi dei campioni utilizzando DHSV 4,13.

Lo scopo di questo lavoro è quello di descrivere le procedure operative standard per il DHSV, con particolare riferimento alle misure di controllo delle infezioni e alla sicurezza durante il campionamento e il trattamento dell’epitelio nasale vivente. Ciò consentirà di continuare la diagnosi e l’assistenza alla PCD di alta qualità, nonostante l’attuale epidemia di COVID-19.

Protocol

L’approvazione è stata ottenuta dal comitato etico dell’ospedale di Liegi e dal Dipartimento universitario per l’igiene e la protezione della salute sul lavoro. 1. Campionamento dell’epitelio ciliato respiratorio Assicurarsi che i soggetti siano privi di infezione per almeno 4-6 settimane e privi di farmaci nasali e inalati, prima del campionamento. Preparare la preparazione integrata di M199: Integrare il terreno di coltura cellulare 199 (M199) (500 ml) con soluzione anti…

Representative Results

Per illustrare l’efficacia della tecnica, presentiamo i risultati del CFA in una serie di 16 volontari adulti sani (5 maschi, fascia di età 22-54 anni). I campioni di spazzolatura nasale di 14 (4 maschi, fascia di età 24-54 anni) su un totale di 16 volontari hanno fornito bordi epiteliali appropriati sufficienti che soddisfacevano i criteri di selezione necessari per eseguire la CFA. Da questi 14 campioni di spazzolatura nasale, sono stati registrati un totale di 242 bordi ciliati e 212 bord…

Discussion

Questo documento mira a fornire una procedura operativa standard per CFA utilizzando campioni di spazzolatura nasale, con modifiche apportate per appropriate considerazioni sul controllo delle infezioni durante la pandemia COVID-19. La diagnosi di PCD è impegnativa e attualmente richiede un pannello di diversi test diagnostici, secondo le raccomandazioni internazionali, tra cui la misurazione dell’ossido nitrico nasale, CFA utilizzando DHSV, analisi ultrastrutturale ciliare mediante microscopia elettronica a trasmission…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier e tutti i membri del team del centro diagnostico PCD di Paris-Est per la loro disponibilità e calorosa accoglienza durante la visita al loro centro diagnostico PCD e i numerosi scambi. Ringraziamo anche Robert Hirst e tutti i membri del team del centro PCD di Leicester per la loro accoglienza, il loro tempo, i consigli e la competenza.

Materials

15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution
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Citer Cet Article
Bricmont, N., Benchimol, L., Poirrier, A., Grignet, C., Seaton, C., Chilvers, M. A., Seghaye, M., Louis, R., Lefebvre, P., Kempeneers, C. Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy – Adaptation for the COVID-19 Pandemic. J. Vis. Exp. (165), e61949, doi:10.3791/61949 (2020).
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