JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

Dijital Yüksek Hızlı Siliyer Videomikroskopi Kullanarak Burun Fırçalama Örneklemesi ve İşleme – COVID-19 Pandemisine Adaptasyon

Published: November 07, 2020
doi:
10.3791/61949
, , , , , , , , ,
1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center,University of Liège, 2Department of ENT,University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit,University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics,University of British Columbia and British Columbia Children’s Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology,University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège

Summary

PCD tanısı için başarılı ve yüksek kaliteli siliyer fonksiyonel analizi garanti etmek için, solunum epitel örneklemesi ve işlenmesi için hassas ve dikkatli bir yöntem şarttır. COVID-19 pandemisi sırasında PCD tanı hizmeti vermeye devam etmek için, siliyer videomikroskopi protokolü uygun enfeksiyon kontrol önlemlerini içerecek şekilde güncellenmiştir.

Abstract

Primer Siliyer Diskinezi (PKH), önemli otosinopulmoner hastalığa yol açan genetik motil bir siliopatidir. PCD tanısı, farklı tanı yöntemlerindeki zorluklar nedeniyle sıklıkla kaçırılır veya gecikir. PCD için tanı araçlarından biri olan Dijital Yüksek Hızlı Videomikroskopi (DHSV) kullanan siliyer videomikroskopi, siliyer vuruş frekansı (CBF) ve vuruş paterni (CBP) analizinden oluşan siliyer fonksiyonel analiz (CFA) yapmak için en uygun yöntem olarak kabul edilir. Bununla birlikte, DHSV, numunelerin işlenmesi ve analiz edilmesi için standartlaştırılmış, yayınlanmış çalışma prosedüründen yoksundur. Ayrıca, COVID-19 pandemisi sırasında önemli bir enfeksiyon kontrol sorunu olan canlı solunum yolu epitelini kullanır. Bu sağlık krizi sırasında tanısal bir hizmet sunmaya devam etmek için, siliyer videomikroskopi protokolü yeterli enfeksiyon kontrol önlemlerini içerecek şekilde uyarlanmıştır.

Burada, siliyer solunum numunelerinin numune alınması ve laboratuvarda işlenmesi için gözden geçirilmiş bir protokolü açıklıyoruz ve COVID-19 enfeksiyon kontrol önlemlerine uymak için yapılan uyarlamaları vurguluyoruz. Bu protokole göre işlenen ve analiz edilen 16 sağlıklı denekten alınan burun fırçalama örneklerinden elde edilen CFA’nın temsili sonuçları açıklanmıştır. Ayrıca, kalite seçim kriterlerini karşılamayan numuneler artık CFA’ya izin verdiğinden, optimum kalitede epitel siliye şeritlerin elde edilmesinin ve işlenmesinin önemini de gösteriyoruz, bu da bu tekniğin tanısal güvenilirliğini ve verimliliğini potansiyel olarak azaltıyor.

Introduction

Primer siliyer diskinezi (PKH), solunum kirpiklerinin durağan, yavaş veya diskinetik olduğu, mukosiliyer klirens bozukluğuna ve kronik oto-sino-pulmoner hastalığa yol açan kalıtsal heterojen hareketli siliopatidir 1,2,3,4. PKH’nin klinik bulguları erken bebeklik döneminde başlayan kronik ıslak öksürük ve kronik burun tıkanıklığı, bronşektaziye yol açan tekrarlayan veya kronik üst ve alt solunum yolu enfeksiyonları, tekrarlayan veya kronik otitis media ve sinüzittir 5,6,7. PKH hastalarının yaklaşık yarısı situs inversus veya situs ambiguus gibi organ lateralite defektleri ile başvurmaktadır. Bazı hastalar ayrıca erkeklerde hareketsiz sperm ve kadınlarda Fallop tüplerinde hareketsiz kirpikler nedeniyle infertilite sorunları ile başvurmaktadır 1,2,8. PCD nadirdir, ancak prevalansı tanımlamak zordur ve 1: 10.000 ila 1: 20.000 9,10 arasında değişmektedir. Ancak PKH’nin gerçek prevalansının tanıdaki güçlükler ve klinik şüphe eksikliği nedeniyle daha yüksek olduğu düşünülmektedir. PCD semptomları, diğer akut veya kronik solunum yollarının ortak solunum bulgularını taklit eder ve tanıyı doğrulamanın tanısal zorlukları iyi bilinmektedir, bu da yetersiz tedavi ve takibe yol açmaktadır 2,5,9,11.

Dijital Yüksek Hızlı Videomikroskopi (DHSV) kullanan siliyer videomikroskopi, PCD 4,8,12,13 için tanı araçlarından biridir. DHSV, siliyer vuruş frekansı (CBF) ve vuruş paterni(CBP) analizi 2,14,15,16’dan oluşan siliyer fonksiyonel analizi (CFA) gerçekleştirmek için en uygun yöntem olarak kabul edilir. DHSV, genellikle burun fırçalamadan elde edilen canlı solunum epiteli kullanır13.

Mevcut COVID-19 salgını göz önüne alındığında, kanıtlar altta yatan solunum yolu hastalığının COVID-19 enfeksiyonundan sonra daha kötü sonuçlara yol açabileceğini gösterdiğinden, PCD tanısının doğrulanması artık daha da önemlidir17,18. Mevcut pandemi sırasında güvenli ve etkili bir PCD tanı hizmeti, doğrulanmış PCD hastalarının genel popülasyona kıyasla ek koruyucu önlemlerden yararlanmasına da izin verecektir19.

COVID-19’un bulaşması öncelikle damlacık yayılımıyoluyla gerçekleşir 20. Asemptomatik (veya minimal semptomatik) hastalardan yüksek bulaşma potansiyeli, burun örneği20’deki yüksek viral yük ile önerilmektedir. Ek olarak, viral partiküller aerosol haline gelirse, havada en az 3 saat kalırlar21. Bu nedenle, solunum sağlığı çalışanları, tanı teknikleri için klinik bakım ve örnek toplama işlemi gerçekleştirirken yüksek bir viral yük rezervuarına maruz kalmaktadır22. Ayrıca, canlı solunum örneklerinin manipülasyonu, teknisyeni COVID-19 kontaminasyonuna maruz bırakır. COVID-19 hastalarına bakan solunum hekimleri ve KBB cerrahları için en iyi uygulama önerileri23 uygulanırken, COVID-19 pandemisi sırasında DHSV’nin uygulanmasına yönelik önerilerin eksikliği vardır.

Bir PCD teşhis hizmeti sunmaya devam etmek için, sağlık çalışanının (numune toplama gerçekleştiren) ve teknisyenin (numune işleme gerçekleştiren) güvenliğini sağlarken, siliyer videomikroskopi protokolünün COVID-19 pandemisi sırasında uyarlanması gerekiyordu. Siliyer videomikroskopi tekniği şu anda araştırma hizmeti ve uzmanlaşmış tanı merkezleri ile sınırlıdır, çünkü CFA kapsamlı eğitim ve deneyim gerektirir. Ayrıca, şu anda, DHSV 4,13 kullanarak numunelerin işlenmesi ve analiz edilmesi için standardizasyon ve hassas çalışma prosedürü eksikliği vardır.

Bu makalenin amacı, DHSV için standart çalışma prosedürlerini, özellikle canlı burun epitelini örneklendirirken ve işlerken enfeksiyon kontrol önlemlerine ve güvenliğe atıfta bulunarak tanımlamaktır. Bu, mevcut COVID-19 salgınına rağmen yüksek kaliteli PCD tanı ve bakımının devam etmesini sağlayacaktır.

Protocol

Liege hastanesi-fakülte etik kurulu ve Üniversite İş Yerinde Hijyen ve Sağlığın Korunması Bölümü’nden onay alınmıştır. 1. Solunum siliyer epitel örneklemesi Örneklemeden önce deneklerin en az 4-6 hafta boyunca enfeksiyondan arındırılmış olduklarından ve burun ve inhale ilaçlardan arındırılmış olduklarından emin olun. Takviyeli M199 preparatı hazırlayın: Antibiyotik çözeltisi (5 mL streptomisin / penisilin (50 μg / mL)) ve antifungal ç?…

Representative Results

Tekniğin etkinliğini göstermek için, CFA’nın sonuçlarını 16 sağlıklı yetişkin gönüllüden oluşan bir seride sunuyoruz (5 erkek, yaş aralığı 22-54 yaş). Toplam 16 gönüllüden 14’ünden (4 erkek, yaş aralığı 24-54 yaş) alınan burun fırçalama örnekleri, CFA’yı gerçekleştirmek için gereken seçim kriterlerini karşılayan yeterli uygun epitel kenarları sağlamıştır. Bu 14 burun fırçalama örneğinden toplam 242 siliyer kenar kaydedildi ve 212 kenar tanımla…

Discussion

Bu makale, COVID-19 pandemisi sırasında uygun enfeksiyon kontrolü hususları için yapılan ayarlamalarla birlikte, burun fırçalama örneklerini kullanarak CFA için standart bir çalışma prosedürü sağlamayı amaçlamaktadır. PCD tanısı zordur ve şu anda nazal nitrik oksit ölçümü, DHSV kullanarak CFA, iletim elektron mikroskobu (TEM) kullanarak siliyer ultrayapısal analiz, immünofloresan kullanarak siliyer proteinlerin etiketlenmesi ve PCD’ye neden olan genler için genetik test dahil olmak üzere ulu…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier ve Paris-Est PCD tanı merkezinin tüm ekip üyelerine, PCD tanı merkezlerini ziyaret ettikleri ve sayısız değişim sırasında müsaitlikleri ve içten karşılamaları için teşekkür ederiz. Ayrıca Robert Hirst’e ve Leicester’ın PCD merkezindeki tüm ekip üyelerine karşılamaları, zamanları, tavsiyeleri ve uzmanlıkları için teşekkür ederiz.

Materials

15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , 1-9 (2015).
  3. Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122 (2018).
  4. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
  5. Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M. Primary Ciliary Dyskinesia. Clinics in chest medicine. 37 (3), 449-461 (2016).
  6. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis, monitoring, and treatment of primary ciliary dyskinesia: PCD foundation consensus recommendations based on state of the art review. Pediatric Pulmonology. , (2016).
  7. Fitzgerald, D. A., Shapiro, A. J. When to suspect primary ciliary dyskinesia in children. Paediatric Respiratory Reviews. , (2016).
  8. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), (2019).
  9. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis, and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 1-13 (2017).
  10. Ardura-Garcia, C., et al. Registries and collaborative studies for primary ciliary dyskinesia in Europe. European Respiratory Journal Open Research. 6 (2), (2020).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical features and associated likelihood of primary ciliary dyskinesia in children and adolescents. Annals of the American Thoracic Society. , (2016).
  12. Chilvers, M. A., O’Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  13. Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
  14. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. The European respiratory journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  15. Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
  16. Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of Ciliary Beat Pattern in Three Different Beating Planes in Healthy Subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
  17. Götzinger, F., et al. COVID-19 in children and adolescents in Europe: a multinational, multicentre cohort study. The Lancet Child & Adolescent Health. , (2020).
  18. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in coronavirus disease 2019 patients: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Infectious Diseases. 94, 91-95 (2020).
  19. Brough, H. A., et al. Managing childhood allergies and immunodeficiencies during respiratory virus epidemics – The 2020 COVID-19 pandemic: A statement from the EAACI-section on pediatrics. Pediatric Allergy and Immunology. 31 (5), 442-448 (2020).
  20. Zou, L., et al. SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. The New England journal of medicine. 382 (12), 1177-1179 (2020).
  21. van Doremalen, N., et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. The New England journal of medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  22. Tran, K., Cimon, K., Severn, M., Pessoa-Silva, C. L., Conly, J. Aerosol generating procedures and risk of transmission of acute respiratory infections to healthcare workers: a systematic review. PloS one. 7 (4), 35797 (2012).
  23. Van Gerven, L., et al. Personal protection and delivery of rhinologic and endoscopic skull base procedures during the COVID-19 outbreak. Rhinology. 58 (3), 289-294 (2020).
  24. Marty, F. M., Chen, K., Verrill, K. A. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen. New England Journal of Medicine. 382 (22), 76 (2020).
  25. Petruzzi, G., et al. COVID-19: Nasal and oropharyngeal swab. Head & Neck. 42, (2020).
  26. George, A., Prince, M., Coulson, C. Safe nasendoscopy assisted procedure in the post-COVID-19 pandemic era. Clinical Otolaryngology. , (2020).
  27. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  28. Jorissen, M., Willems, T., Van der Schueren, B. Ciliary function analysis for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia: advantages of ciliogenesis in culture. Acta oto-laryngologica. 120 (2), 291-295 (2000).
  29. Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
  30. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  31. Stannard, W. A., Chilvers, M. A., Rutman, A. R., Williams, C. D., O’Callaghan, C. Diagnostic testing of patients suspected of primary ciliary dyskinesia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 307-314 (2010).
  32. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9 (1), 11 (2014).
  33. Armengot, M., Milara, J., Mata, M., Carda, C., Cortijo, J. Cilia motility and structure in primary and secondary ciliary dyskinesia. American Journal of Rhinology & Allergy. 24 (3), 175-180 (2010).
  34. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (1), 78 (2012).
  35. Wallmeier, J., et al. Mutations in CCNO and MCIDAS lead to a mucociliary clearance disorder due to reduced generation of multiple motile cilia. Molecular and Cellular Pediatrics. 2, 15 (2015).
  36. Boon, M., et al. MCIDAS mutations result in a mucociliary clearance disorder with reduced generation of multiple motile cilia. Nature Communications. 5 (6), 4418 (2014).
  37. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 197 (12), 24-39 (2018).
  38. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. (19), 30205 (2019).
  39. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the Genetics of Primary Ciliary Dyskinesia. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  40. MacCormick, J., Robb, I., Kovesi, T., Carpenter, B. Optimal biopsy techniques in the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The Journal of Otolaryngology. 31 (1), 13-17 (2002).
  41. Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  42. Jackson, C. L., Goggin, P. M., Lucas, J. S. Ciliary Beat Pattern Analysis Below 37°C May Increase Risk of Primary Ciliary Dyskinesia Misdiagnosis. Chest. 142 (2), 543-544 (2012).
  43. Green, A., Smallman, L. A., Logan, A. C., Drake-Lee, A. B. The effect of temperature on nasal ciliary beat frequency. Clinical otolaryngology and allied sciences. 20 (2), 178-180 (1995).
  44. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
  45. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (1), 14 (2012).
  46. Sisson, J. H., Stoner, J. a., Ammons, B. a., Wyatt, T. a. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. Journal of Microscopy. 211, 103-111 (2003).
  47. Blanchon, S., et al. Deep phenotyping, including quantitative ciliary beating parameters, and extensive genotyping in primary ciliary dyskinesia. Journal of Medical Genetics. , (2019).
  48. Feriani, L., et al. Assessing the Collective Dynamics of Motile Cilia in Cultures of Human Airway Cells by Multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
  49. Sears, P. R., Thompson, K., Knowles, M. R., Davis, C. W. Human airway ciliary dynamics. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (3), 170-183 (2013).
  50. Quinn, S. P., et al. Automated identification of abnormal respiratory ciliary motion in nasal biopsies. Science translational medicine. 7 (299), (2015).

Tags

Nasal BrushingDigital High-speed Ciliary VideomicroscopyPrimary Ciliary DyskinesiaCOVID-19Diagnostic TestSamplingProcessingInfection ControlSensitivitySpecificityElectron MicroscopyGenetic TestingWeil-Blakesley Nasal ForcepsEpithelial StripsGlass SlideSpacer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Bricmont, N., Benchimol, L., Poirrier, A., Grignet, C., Seaton, C., Chilvers, M. A., Seghaye, M., Louis, R., Lefebvre, P., Kempeneers, C. Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy – Adaptation for the COVID-19 Pandemic. J. Vis. Exp. (165), e61949, doi:10.3791/61949 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image