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Abstract
Introduction
Protocol
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Immunologie et infection

Probenahme und Verarbeitung von Nasenbürsten mittels digitaler Hochgeschwindigkeits-Ziliar-Videomikroskopie – Anpassung an die COVID-19-Pandemie

Published: November 07, 2020
doi:
10.3791/61949
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1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center,University of Liège, 2Department of ENT,University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit,University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics,University of British Columbia and British Columbia Children’s Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology,University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège

Summary

Um eine erfolgreiche und qualitativ hochwertige ziliäre Funktionsanalyse für die PCD-Diagnostik zu gewährleisten, ist eine präzise und sorgfältige Methode zur Probenahme und Verarbeitung des respiratorischen Epithels unerlässlich. Um während der COVID-19-Pandemie weiterhin PCD-diagnostische Dienstleistungen anbieten zu können, wurde das ziliäre Videomikroskopieprotokoll aktualisiert, um geeignete Maßnahmen zur Infektionskontrolle aufzunehmen.

Abstract

Die primäre ziliäre Dyskinesie (PCD) ist eine genetisch bedingte Motilziliopathie, die zu einer signifikanten otosinopulmonalen Erkrankung führt. Die PCD-Diagnose wird aufgrund von Herausforderungen mit unterschiedlichen diagnostischen Modalitäten oft übersehen oder verzögert. Die Ziliar-Videomikroskopie mit digitaler Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie (DHSV), einem der diagnostischen Instrumente für PCD, gilt als die optimale Methode zur Durchführung einer ziliären Funktionsanalyse (CFA), die aus der Analyse der Ziliarschlagfrequenz (CBF) und des Schlagmusters (CBP) besteht. Dem DHSV fehlt jedoch ein standardisiertes, veröffentlichtes Arbeitsverfahren für die Verarbeitung und Analyse von Proben. Es verwendet auch lebendes respiratorisches Epithel, ein wichtiges Problem der Infektionskontrolle während der COVID-19-Pandemie. Um während dieser Gesundheitskrise weiterhin diagnostische Dienstleistungen anbieten zu können, wurde das ziliäre Videomikroskopieprotokoll angepasst, um angemessene Maßnahmen zur Infektionskontrolle zu enthalten.

Hier beschreiben wir ein überarbeitetes Protokoll für die Probenahme und Laborverarbeitung von Flimmeratmungsproben und heben die Anpassungen hervor, die zur Einhaltung der COVID-19-Infektionskontrollmaßnahmen vorgenommen wurden. Repräsentative Ergebnisse von CFA aus Nasenputzproben von 16 gesunden Probanden, die nach diesem Protokoll verarbeitet und analysiert wurden, werden beschrieben. Wir veranschaulichen auch, wie wichtig es ist, epitheliale Flimmerstreifen in optimaler Qualität zu erhalten und zu verarbeiten, da Proben, die nicht den Qualitätsauswahlkriterien entsprechen, nun eine CFA zulassen, was möglicherweise die diagnostische Zuverlässigkeit und die Effizienz dieser Technik verringert.

Introduction

Die primäre Ziliärdyskinesie (PCD) ist eine vererbte heterogene motile Ziliopathie, bei der die respiratorischen Zilien stationär, langsam oder dyskinetisch sind, was zu einer gestörten mukoziliären Clearance und einer chronischen oto-sino-pulmonalen Erkrankung führt 1,2,3,4. Die klinischen Manifestationen der PCD sind chronischer feuchter Husten und chronische verstopfte Nase ab dem frühen Säuglingsalter, rezidivierende oder chronische Infektionen der oberen und unteren Atemwege, die zu Bronchiektasen führen, sowie rezidivierende oder chronische Mittelohrentzündung und Sinusitis 5,6,7. Etwa die Hälfte der PCD-Patienten weist Organlateralitätsdefekte wie Situs inversus oder Situs ambiguus auf. Einige Patientinnen weisen auch Unfruchtbarkeitsprobleme auf, die auf unbewegliche Spermien bei Männern und unbewegliche Flimmerhärchen in den Eileitern bei Frauen zurückzuführensind 1,2,8. PCD ist selten, aber die Prävalenz ist schwer zu definieren und reicht von 1:10.000 bis 1:20.000 9,10. Es wird jedoch angenommen, dass die tatsächliche Prävalenz der PCD aufgrund von Schwierigkeiten bei der Diagnose und fehlendem klinischem Verdacht höher ist. Die Symptome der PCD ahmen häufige respiratorische Manifestationen anderer akuter oder chronischer Atemwegserkrankungen nach, und die diagnostischen Herausforderungen bei der Bestätigung der Diagnose sind bekannt, was zu einer unzureichenden Behandlung und Nachsorge führt 2,5,9,11.

Die Ziliär-Videomikroskopie mit digitaler Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie (DHSV) ist eines der diagnostischen Instrumente für PCD 4,8,12,13. DHSV gilt als die optimale Methode zur Durchführung einer ziliären Funktionsanalyse (CFA), die aus der Analyse der Ziliarschlagfrequenz (CBF) und des Schlagmusters (CBP) besteht 2,14,15,16. DHSV verwendet lebendes respiratorisches Epithel, das in der Regel durch Nasenbürsten gewonnen wird13.

Angesichts des aktuellen COVID-19-Ausbruchs ist die Bestätigung einer PCD-Diagnose nun noch wichtiger, da es Hinweise darauf gibt, dass eine zugrunde liegende Atemwegserkrankung zu schlechteren Ergebnissen nach einer COVID-19-Infektion führen kann17,18. Eine sichere und effiziente PCD-Diagnostik während der aktuellen Pandemie wird es auch dazu bringen, dass bestätigte PCD-Patienten im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung von zusätzlichen Schutzmaßnahmen profitierenkönnen 19.

Die Übertragung von COVID-19 erfolgt hauptsächlich durch Tröpfchenausbreitung20. Ein hohes Übertragungspotenzial von asymptomatischen (oder minimal symptomatischen) Patienten wird durch die hohe Viruslast in der Nasenprobe20 nahegelegt. Wenn Viruspartikel aerosolisiert werden, bleiben sie außerdem mindestens 3 Stunden in der Luft21. Daher sind Beschäftigte in der Atemwegsmedizin einem hohen Reservoir an Viruslast ausgesetzt, während sie die klinische Versorgung und die Probenentnahme für diagnostische Techniken durchführen22. Darüber hinaus setzt die Manipulation lebender Atemwegsproben den Techniker einer COVID-19-Kontamination aus. Während Best-Practice-Empfehlungen für Pneumologen und HNO-Chirurgen, die COVID-19-Patienten betreuen, umgesetzt werden23, fehlt es an Empfehlungen für die Durchführung von DHSV während der COVID-19-Pandemie.

Um weiterhin eine PCD-Diagnostik anbieten zu können und gleichzeitig die Sicherheit des medizinischen Personals (Durchführung der Probenentnahme) und des Technikers (Durchführung der Probenverarbeitung) zu gewährleisten, musste das ziliäre Videomikroskopieprotokoll während der COVID-19-Pandemie angepasst werden. Die Technik der Ziliar-Videomikroskopie ist derzeit auf Forschungsdienste und spezialisierte diagnostische Zentren beschränkt, da CFA eine umfangreiche Ausbildung und Erfahrung erfordert. Darüber hinaus fehlt es derzeit an einer Standardisierung und einem präzisen Arbeitsablauf für die Verarbeitung und Analyse von Proben mit DHSV 4,13.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, Standardarbeitsanweisungen für DHSV zu beschreiben, mit besonderem Bezug auf Infektionskontrollmaßnahmen und Sicherheit bei der Probenahme und Verarbeitung von lebendem Nasenepithel. Dies wird es ermöglichen, trotz des aktuellen COVID-19-Ausbruchs eine qualitativ hochwertige PCD-Diagnose und -Versorgung fortzusetzen.

Protocol

Die Genehmigung wurde von der Ethikkommission des Krankenhauses Lüttich und der Universitätsabteilung für Hygiene und Gesundheitsschutz am Arbeitsplatz eingeholt. 1. Probenahme von respiratorischem Flimmerepithel Stellen Sie vor der Probenahme sicher, dass die Probanden mindestens 4-6 Wochen lang frei von Infektionen und frei von nasalen und inhalativen Medikamenten sind. Bereiten Sie das ergänzte M199-Präparat vor: Ergänzen Sie das Zellkulturmedium 199 (M199) (500 ml…

Representative Results

Um die Effizienz der Technik zu veranschaulichen, präsentieren wir die Ergebnisse der CFA in einer Serie von 16 gesunden erwachsenen Probanden (5 Männer, Altersspanne 22-54 Jahre). Nasenputzproben von 14 (4 Männer, Altersspanne 24-54 Jahre) von insgesamt 16 Probanden lieferten genügend geeignete Epithelränder, die die für die Durchführung einer CFA erforderlichen Auswahlkriterien erfüllten. Von diesen 14 Nasenputzproben wurden insgesamt 242 Flimmerränder erfasst, von denen 212 die def…

Discussion

Dieses Papier zielt darauf ab, ein Standardverfahren für CFA unter Verwendung von Nasenbürstenproben bereitzustellen, wobei Anpassungen für angemessene Überlegungen zur Infektionskontrolle während der COVID-19-Pandemie vorgenommen wurden. Die PCD-Diagnose ist eine Herausforderung und erfordert derzeit gemäß internationaler Empfehlung eine Reihe verschiedener diagnostischer Tests, darunter nasale Stickstoffmonoxidmessung, CFA mit DHSV, ziliäre Ultrastrukturanalyse mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Mark…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir bedanken uns bei Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier und allen Teammitgliedern des PCD-Diagnosezentrums von Paris-Est für ihre Verfügbarkeit und den herzlichen Empfang während des Besuchs in ihrem PCD-Diagnosezentrum und den zahlreichen Austausch. Wir danken auch Robert Hirst und allen Teammitgliedern im PCD-Zentrum von Leicester für ihren Empfang und ihre Zeit, ihren Rat und ihr Fachwissen.

Materials

15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution
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References

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Citer Cet Article
Bricmont, N., Benchimol, L., Poirrier, A., Grignet, C., Seaton, C., Chilvers, M. A., Seghaye, M., Louis, R., Lefebvre, P., Kempeneers, C. Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy – Adaptation for the COVID-19 Pandemic. J. Vis. Exp. (165), e61949, doi:10.3791/61949 (2020).
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