静止ヒト造血幹細胞を維持する培養法

このプロトコルは、国立国際保健医療センターのガイドラインに従っています。マウスに対して行われたすべての実験手順は、国立国際医療センター動物実験委員会によって承認されています。注: プロトコルの概要を 図 1に示します。 1. 脂質製剤 示された濃度でガラス管中のメタノールに以下の脂質を溶解します: パルミチン酸ナトリウム, 16 mg/mL;オレイン酸ナトリウム、 30 mg/mL;コレステロール, 4 mg/mL.脂質溶液を-30°Cに保存し、使用前にサンプルを解凍してください。 ステップ1.1で調製した脂質溶液を、パルミチン酸100μg/mLの最終濃度、100μg/mLオレイン酸、および20μg/mLコレステロールの最終濃度を得るために必要な用量で、新鮮なガラス管に混合します。例えば、10 mLの培養培地を調製する場合、パルミチン酸溶液62.5 μL、オレイン酸溶液33μL、および50μLのコレステロール溶液をガラス管に混ぜます。 脂質溶液を通して窒素ガスを通してメタノールを蒸発する(図2A及び2B)。窒素ガスが利用できない場合は、ピペットエイドを使用して溶液を通して空気を通過させます。 37°Cの水浴でガラス管を加熱することにより、残りのメタノールを完全に蒸発させる(図2C)。注:限られたスペースでの高濃度のN2 ガスの使用は潜在的に有害である。メタノールを蒸発させるプロトコルで使用される容積は限られており、従って安全であると考えられるが、予期せぬガス漏れが発生した場合、部屋を十分に換気し、潜在的に高濃度のN2 ガスの標識領域が重要である。 2. 中程度の準備 ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)/F12培地(HEPESおよびグルタミン付き)を準備します。ペニシリンとストレプトマイシン硫酸塩を培地に加えて、最終濃度の50単位と50μg/mLにそれぞれ加えます。抗生物質を含むDMEM/F12培地は、少なくとも2ヶ月間4°Cで保存することができる。 4%w/vのウシ血清アルブミン(BSA)をダルベックの修飾イーグル培地(DMEM)/F12培地(HEPESおよびグルタミン付)に加えます。 NaOH溶液を用いて培地のpHを7.4-7.8に調整し、通常はpH 7.6に調整する。 ステップ1で準備したガラス管に培地を追加します。最大溶解度の溶液を達成するために、3〜15 mL培地の添加が推奨される。 完全に超音波処理(最適:超音波処理の20分以上)によって脂質を溶解します。BSAと脂質が溶解した後、サンプルは-80°Cで保存し、2ヶ月以内に使用する必要があります。使用直前に解凍します。 DMEM/F12にインスリン、トランスフェリン、セレニットナトリウム、エタノールアミン(ITS-X)混合物を1/1,000個加えます。0.22 μm フィルタ(“培養メディア”として指定)を使用して混合培地をフィルタリングします。使用前に、ヒト幹細胞因子(SCF)およびヒトトロンボポエチン(TPO)を各3ng/mLの最終濃度で培養培地に添加する。サイトカインとITS-Xを追加した後、培地を保存することはできません。 染色バッファー: Ca-およびMgフリーリン酸緩衝生理食塩分(PBS)に10Sを加えます。この溶液は、4°Cで2週間保存することができます。 メディアの解凍: DMEM/F12 に 10% FCS を追加します。このソリューションは単独で使用できます。 サイトカインストック溶液:20μg/mLで、ヒトSCFまたはヒトTPOをPBS(Ca-およびMgフリー)に溶解します。この溶液は、活動を失うことなく、少なくとも1年間-80°Cで保存することができます。解凍したら、ストック液を4°Cで保存し、1ヶ月以内に使用してください。注:BSAの汚染物質の変動を避けるために、すべての購入後にロットを調べます。BSAの異なるバッチを同時に培養HSCとし、7日目の表現型HSC数を以下に記載して調べる。BSA バッチが CD34+ セルの数または頻度が低い場合 (入力セルの数の半分以下など) は、このバッチの使用は避けてください。 3. ヒト骨髄CD34+細胞の調製 ヒトCD34+骨髄細胞を購入し、使用するまで液体窒素に保存します。あるいは、健康なボランティアまたは新鮮な臍帯血球からの骨髄細胞は、研究所の倫理委員会とドナーの同意によって承認された場合に使用することができる。 37°Cの水浴で15 mL円錐形のチューブに10mLの解凍媒体を温めます。 37°Cの水浴で2分以内にバイアル中の凍結細胞を解凍します。70%エタノールでバイアルを拭いて汚染物質を除去した後、ステップ3.2から予め温めた培地を含む15mLの円錐チューブに細胞を移す。 室温で15分間200×gで15mLチューブを遠心します。上清を慎重に吸引してペレットをそのままに保つ(培地<50μLを残す)。残りの培地で細胞を再懸濁し、氷上の1.5mLチューブに移します。注:目や傷ついた組織を含む粘膜に直接ヒト由来のサンプルへの暴露は、既知または未知の病原体による感染を引き起こす可能性があります。したがって、手袋や眼鏡は、人間の細胞を扱うときにお勧めします。購入したCD34+細胞がB型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、ヒト免疫不全ウイルス1(HIV1)に対して陰性を検査した場合でも、暴露の発生率が発生した場合は、制度ガイドラインに従って注意深くモニタリングする必要があります。ヒト細胞に曝露された物質を処分する際には、制度上のガイドラインに従ってください。 4. HSC のソート フルオロクロム共役抗体で細胞にラベルを付けます。50 μLの染色バッファーに抗CD34-FITC 10 μL、抗CD38-PerCP-Cy5.5の2 μL、抗CD90-PE-Cy7の5 μL、抗CD45RA-PEの10 μLを混合します。抗体混合物中の細胞ペレットを再懸濁する。暗い中で4°Cで30分間細胞をインキュベートする。 抗体を洗浄するために1mLの染色バッファーを加えます。4°Cで5分間340×gでチューブを遠心分離します。 上清を捨てます。 細胞ペレットを0.5 mLの染色バッファー+ 0.1% ヨウ化プロピジウムに再懸濁します。40 μmフィルターを使用して、サスペンションを5 mLチューブに移します。 FACSAria-IIIuを使用して、PI – CD34+CD38-CD90+CD45RA-分数内のフェロチHSCをゲートし、500 μLの培養培地で満たされた1.5 mLチューブに細胞を並べ替える(図3)。図3に示す格紙の戦略を用いて、CD34+細胞の〜10%が、細胞のHSCを表見すると予想される。注:格紙戦略は、健康な個体17 からのCD34+CD38-分数のリネージュマーカーの低い発現を与えられた系統マーカー染色を省略しながら、前に説明した16 のように行われる。 4°Cで5分間340×gで選別した細胞を遠心分離し、上清を捨てます。上清を慎重に吸引し、ペレットがそのまま残るようにします。 培養するまで、並べ替えられたセルを氷の上に保存します。注: スペクトルオーバーラップの蛍光補償は、最初の実験で行う必要があります。 5. 細胞培養 ステップ2で調製したサイトカインを含む培養培地200μLを平底96ウェルプレートに移します。 培地の蒸発を避けるために、使用されていないウェルをすべて100~200 μLのPBSで満たします。 60細胞/μLでサイトカインを使用せずに培養培地でソートしたHSCを再中断します。 アリコート600 HSC/ウェル(細胞懸濁液の10 μL)を各ウェルに入します。セル番号は変更できます。300未満の細胞は、より大きな技術的変動をもたらすので、生物学的な違いを検出するために条件ごとにより多くの井戸が必要です。1つの井戸で1000以上の細胞を培養することは、サイトカイン/栄養不足または不利なサイトカイン/ケモカインの蓄積のために避けるべきです。 加湿した多気インキュベーター中の細胞を37°Cで5%CO2及び1%O2雰囲気で培養した。 7 日間を超えるカルチャの場合は、3 ~ 4 日ごとにメディアボリュームの半分を交換することをお勧めします。100μLの培地をピペットで慎重に吸引し、サイトカインを含む新たに調製した培養培地を100μLずつ各ウェルに添加します。培養培地は37°Cであらかじめ温める必要があります。 6. フローサイトメトリーを用いたマーカーのフェノタイプの解析 注: 7 日間培養した後にセルを分析する必要がありますが、培養期間は変更できます。 8チャンネルのピペットを使用して、培地の170μLを廃棄します。 抗体混合物で細胞にラベルを付けます。0.5 μLの抗 CD34-FITC、0.1 μLの抗 CD38-PerCP-Cy5.5、0.25 μL の抗 CD90-PE-Cy7、0.5 μL の抗 CD45RA-PE、および 9 μL の染色バッファーを 1 ウェルあたり混合します。混合物の10 μLを96ウェルプレートに加え、暗い4°Cで30分間培養します。 抗体を洗浄するには、100 μLの染色バッファーをウェルに加え、低加速と中減速を使用して400×gのプレートを400gで5分間遠心します。 慎重にウェルの底に細胞を維持するために上清の100 μLを吸引し、その後、200 μLの染色バッファー + 0.1% v/v の PI + 1% v/v の蛍光微小球 (例えばフローチェックフルオロスフィアス) の細胞を再懸濁します。 フローサイトメトリー計器を設定します。混合サンプルモードで、100 μLの混合サンプルモードでサンプルのデータを取得します。 データをFCS形式でエクスポートし、FlowJoなどのソフトウェアを使用して分析します。細胞数は蛍光微小球ビーズ数を用いて求めることができる。たとえば、研究者がウェルあたり 2000 ビーズを追加し、ビード数が 700 である場合、各分数のセル数に 2000/700 を掛けて、ウェル内の分数の総セル数を推定します。注意:蛍光微小球はホルムアルデヒドの存在のために培養細胞に有毒である。これは、分析中に細胞死を誘発する可能性があります。バイアスを避けるために連続的に分析されるウェル(<50ウェル)の数を最小限に抑えてください。 7. ヒトHSC移植 注:培養細胞の再集団活性は、免疫不全マウスへの移植によって検証される。すべての手順は、動物実験委員会またはその同等物によって承認されなければなりません。 ドナーとして、十分な数の8-12週間の免疫不全性NOD-SCID-Il2rg-null(NOG)マウスを調製する。NOGマウスは感染しやすいので、繁殖ケージをできるだけ清潔に保ち、殺菌された食事と水をマウスに供給します。 培養工程5に記載した移植のための十分な数のHSCを培養する。例えば、5000 HSC(0日目相当)を6匹のレシピエントマウスに移植すると、培養35,000-40,000 HSCを96ウェルプレート(ウェルあたり200μLの培養培地)の40ウェルまたは24ウェルプレートの8ウェル(ウェル当たり1mLの培養培地)で培養します。5%CO2及び1%O2で37°Cで加湿された多気インキュベーターで3〜4日毎に半培地変化で2週間細胞を培養する。カルチャの期間は変更できます。 移植前に6-24時間で2.5GyでNOGマウスを照射する。 培養したHSCを1.5mLチューブで回収します。4°Cで5分間340×gでチューブを遠心分離します。 上清を慎重に吸引し、200μLあたり5000 HSC(0日目相当)の細胞密度で無菌氷冷染色バッファー内の細胞を再懸濁します。染色バッファーを殺菌するには、0.22 μm フィルターを使用してフィルターします。 移植前に、セボフルランまたはイソファラン吸入によってマウスを麻酔する。 培養したHSCの5000μL(0日目相当)を移植するには、1mL注射器と27ゲージ針を用いて、ステップ7.1で照射したNOGマウスの尾静脈またはレトロ眼窩静脈に細胞懸濁液200μLを注入する。新たに単離または解凍された骨髄HSCをコントロールとして移植することができる。手袋は、各手順の間に70%のv/vエタノールで滅菌する必要があります。 末梢血におけるヒト由来細胞の頻度の解析 ヒト細胞の再集団を調べるには、移植後1、2、3ヶ月で末梢血を採取する。 末梢血を採取する前に、セボフルラン吸入によってマウスを麻酔する。 ヘパリン化ガラスキャピラリーチューブを使用して、レトロ軌道サイヌスから40〜80μLの末梢血液を採取し、1.5 mLチューブ内のPBS + ヘパリン(1 U/mL)の1mLでこのサンプルを一時停止します。 340×gで血液懸濁液を4°Cで3分間遠心分離する。 上清を捨て、PBSの1 mL+1.2%w/vデキストラン(200 kDa)を室温で45分間再懸濁します。 上清を340 ×mg で別の1.5mLチューブと遠心分離機に3分間移します。 赤血球のリシスの場合、細胞を0.17 M NH4Clで5分間再懸濁する。 細胞懸濁液340×gを4°Cで3分間遠心分離する。 0.3 μLの抗マウスFcブロックを含む染色バッファーの50 μLで細胞を再懸濁します。このサンプルを4°Cで5分間インキュベートします。 表面マーカー染色用の抗体を追加:0.3 μLのマウスCD45-PE-Cy7、 0.3 μLマウス Ter-119-PE-Cy7、ヒトCD45-BV421の0.3 μL、ヒトCD13-PEの0.3 μL、ヒトCD33-PEの1.2 μL、ヒトCD19-APCの0.3 μL、ヒトCD3-APC-Cy7の0.3 μL。4°Cで細胞を15分間インキュベートします。 1 mLの染色バッファーと遠心分離機を340×gで1回、4°Cで5分間洗浄します。 上清を捨てて、200 μLの染色バッファー + 0.1% v/v PI で細胞を再懸濁します。 セルサスペンションを96ウェルフラットボトムプレートに移し、ミックスサンプルモードをオンにして100 μLの取り込みボリュームを使用して、高速モードのフローサイトメーターを使用してデータを取得します。 FlowJo などのソフトウェアを使用して、分析用のデータを FCS 形式でエクスポートします。 フローサイトメーターを設定します。ミックスサンプルモードをオンにして、取り込み体積を100 μLにして、高速モードでサンプルのデータを取得します。 FlowJo などのソフトウェアを使用して、分析用のデータを FCS 形式でエクスポートします。