该协议通过使用丰富的脂肪酸、胆固醇、低浓度的细胞因子和缺氧来模拟骨髓微环境,使静默的人类造血干细胞在体外得以维持。
人类造血干细胞(HSCs)与其他哺乳动物HSC一样,在骨髓中维持终身造血。HSC在体内保持静默,不像更分化的祖细胞,在化疗或辐照后快速进入细胞周期,以治疗骨髓损伤或体外培养。通过在富脂肪酸、胆固醇、细胞因子浓度低和缺氧的情况下模拟骨髓微环境,人类HSC在体外保持静默。在这里,描述了在体外静默状态下维护功能 HSC 的详细协议。这种方法将使研究人类HSC在生理条件下的行为。
造血干细胞(HSCs)和多能祖细胞(MPPs)协调地形成一个储层,用于持续补充分化细胞,以维持造血在人类的一生。细胞循环静止是HSC的一个突出特征,区别于MPP2。传统上,HSC被认为位于造血系统等级的顶点,产生所有分化的血细胞。这种分层模型主要是从移植实验3中推断出的。然而,最近的研究表明,与移植实验4、5、6、7相比,HSC的动态在体内有所不同。使用多个条形码系统的血统追踪实验表明,表型粘膜HSC不是一种独特的细胞类型,有助于稳定状态造血,而MPP在移植设置时自我更新活动有限,不断提供成熟的血细胞4、5、8。相比之下,HSC对成熟细胞的贡献在骨髓损伤4后得到增强。这可能是由于骨髓消融后微环境发生剧烈变化,包括骨髓移植。虽然将粘膜细胞的血统追踪应用于人类细胞是很困难的,但结合单细胞衍生菌落分离和全基因组测序相结合的植物学分析揭示了造血系统的类似特性,其中HSC和MPP都负责成熟细胞7的日常生产。因此,虽然移植对于检查穆林或人类HSC活动至关重要,但还需要其他实验模型来了解HSC在生理条件下的行为。
已详细研究HSC的培养方法,以了解其临床应用和特征。人类HSC可以在体外扩大使用细胞因子的组合,重组细胞外矩阵,去除自我更新拮抗剂,与中性细胞或内皮细胞共同培养,添加白蛋白或其替代品,自我更新转录因子的转导,以及添加小分子化合物9,10。其中一些方法,包括添加小化合物SR111和UM17112,已在临床试验中测试,有希望的结果9。考虑到 HSC 在体内的静默性质,保持 HSC 以最小的细胞循环是重新概括体外 HSC 行为的关键。静止和增殖的HSC表现出微分细胞周期条目13,代谢状态14,和耐受多重应力15。用于维持人类体外HSC静默的方法是有限的。
通过模仿骨髓的微环境(低氧和富含脂质)和优化细胞因子的浓度,可以在培养下保持人类HSC的无差别和静止。在体外回顾HSC的静默性质,将增进对HSC稳定状态特性的理解,并实现HSC的实验操作。
最近,有几种方法可以扩展最小差异化的HSC,包括18、19、20、21。虽然这些方法非常出色,但 HSC 在细胞因子水平高的情况下被迫激活其细胞周期,这与 HSC 显示最少循环的体内情况不同。此协议通过回顾骨髓微环境,有助于保持 HSC 的静止状态,如体内观察到的那样。
通过在低细胞因子、富脂和缺氧条件下培养人类HSC,HSC在保持其标记表型的同时表现出最少的循环。本协议的关键步骤是准备含有高浓度脂肪酸和胆固醇的介质,以及低细胞因子浓度和缺氧下培养物(第 1 步、第 2 步和第 4 步)。如果没有胆固醇和/或脂肪酸,低细胞因子浓度下的HSC维持率会降低22。如前23日报道的那样,在缺氧条件下培养细胞也很重要。
除了细胞因子浓度外,这些培养条件与用于穆林HSC的条件相似。Murine HSC 在没有 TPO 的情况下生存,而人类 HSC 需要至少 2 ng/mL 的 TPO,而 SCF22的 TPO 为 3 ng/mL。由于TPO的浓度远远高于人类血清(+100 pg/mL),本协议中使用的条件可能缺少支持人类HSC生存的具体因素。 FLT3在人类HSC24上表达。增加其配体 FLT3LG 略低 TPO 维护 HSC22 的要求。
与粘液HSC相比,人类HSC需要更高的胆固醇浓度,大概是因为无法诱导胆固醇合成酶的表达,以及脂肪酸22下高浓度(>400微克/mL)下对脂毒性易感性。虽然只有棕榈酸、油性、亚油酸和固酸的组合进行了测试,这在人类血清中是大量发现的,但应评估其他脂质组合,以降低脂质氧化性,提高维持功能性HSC的速度。
虽然经过两周培养后,免疫缺陷小鼠培养的人类HSC的再填充活动已于22日得到证实,但这一培养系统并没有完全重新概括HSC在体内的利基功能。据报道,CD45RA的表达有所增加,重新人口容量低于新分类的HSC22。然而,在超生理水平上添加到介质中的营养物质(如葡萄糖、氨基酸、聚氨酯和胰岛素)的浓度可以优化。BSA中的污染物也可能损害HSC18,25的维护。此外,一些培养细胞经历细胞死亡,而另一些则经历细胞分裂:因此,保持总细胞数可能不表示每个细胞的静止状态。
尽管有这些限制,本研究中制定的协议中描述的文化条件将有助于推进HSC的研究和工程,特别是在近生理条件下。保持 HSC 的微分和循环活性的培养条件将适合测试专门作用于 HSC 的生物和化合物,通过扁豆病毒转导或基因组编辑来操纵 HSC,而不会失去干度,并阐明白血病相关基因诱导的转化的第一步。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢原口和田崎女士的技术支持和实验室管理,感谢K.西罗希塔的拍照。香港部分得到来自MEXT/JSPS(第19K17847号赠款)和国家全球健康与医学中心的KAKENHI赠款的支持。KT 部分得到了来自 MEXT/JSPS 的 KAKENHI 赠款(赠款号为 18H02845 和 18K19570)、国家全球健康和医学中心(赠款号 26-001 和 19A2002)、AMED(赠款号) 的支持。JP18ck0106444、JP18ae0201014和JP20bm0704042)、小野医学研究基金会、关泽医学研究基金会和竹田科学基金会。
Human bone marrow CD34+ progenitor cells | Lonza | 2M-101C | |
NOD/Shi-scid,IL-2RγKO Jic | In-Vivo Science Inc. | https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html | |
Anti-human CD34-FITC (clone: 581) | BD biosciences | Cat# 560942; RRID: AB_10562559 | |
Anti-human CD38-PerCP-Cy5.5 | BD biosciences | Cat# 551400; RRID: AB_394184 | |
Anti-human CD45RA-PE | BD biosciences | Cat# 555489; RRID: AB_395880 | |
Anti-human CD90-PE-Cy7 (clone: 5E10) | BD biosciences | Cat# 561558; RRID: AB_10714644 | |
Anti-human CD13-PE (clone: WM15) | BioLegend | Cat# 301703; RRID: AB_314179 | |
Anti-human CD33-PE (clone: WM53) | BD biosciences | Cat# 561816; RRID: AB_10896480 | |
Anti-human CD19-APC (clone: SJ259) | BioLegend | Cat# 363005; RRID: AB_2564127 | |
Anti-human CD3-APC-Cy7 (clone: SK7) | BD biosciences | Cat# 561800; RRID: AB_10895381 | |
Anti-human CD45-BV421 (clone: HI30) | BD biosciences | Cat# 563880; RRID:AB_2744402 | |
Anti-mouse CD45-PE-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | Cat# 103114; RRID: AB_312979 | |
Anti-mouse Ter-119-PE-Cy7 (clone: TER-119) | BD biosciences | Cat# 557853; RRID: AB_396898 | |
Fc-block (anti-mouse CD16/32) (clone: 2.4-G2) | BD Biosciences | Cat# 553142; RRID: AB_394657 | |
Phosphate buffered saline | Nacalai Tesque | Cat# 14249-24 | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 26140079 | |
DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11320-033 | |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | Cat# 51500056 | |
Penicillin | Meiji Seika | PGLD755 | |
Streptomycin sulfate | Meiji Seika | SSDN1013 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | Cat# A4503 | |
Sodium palmitate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# P0007 | |
Sodium oleate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# O0057 | |
Cholesterol | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# C0318 | |
Ammonium Chloride | Fujifilm | Cat# 017-2995 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | Fujifilm | Cat# 191-01305 | |
EDTA・2Na | Fujifilm | Cat# 345-01865 | |
Heparine Na | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD. | Cat# 224122557 | |
Sevoflurane | Fujifilm | Cat# 193-17791 | |
Dextran | Nacalai Tesque | Cat# 10927-54 | |
Recombinant Human SCF | PeproTech | Cat# 300-07 | |
Recombinant Human TPO | PeproTech | Cat# 300-18 | |
Recombinant human Flt3 ligand | PeproTech | Cat# 300-19 | |
Propidium iodide | Life Technologies | Cat# P3566 | |
Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | Cat# 7547053 | |
FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
AutoMACS Pro | Miltenyi Biotec | N/A | |
FACS Aria3u | BD Biosciences | N/A | |
VELVO-CLEAR VS-25 (sonicator) | VELVO-CLEAR | N/A | |
Nitrogen gas cylinder | KOIKE SANSHO CO., LTD | N/A | |
Gas regulator | Astec | Cat# IM-055 | |
Multigas incubator | Astec | Cat# SMA-30DR | |
Glass tube, 16 mL | Maruemu corporation | N-16 | |
Glass tube, 50 mL | Maruemu corporation | NX-50 | |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGPR33RS |