오가노캣 공정을 이용한 리뇨셀룰로오스 바이오매스의 분획

참고: 샘플을 실온(며칠) 또는 냉장고(장기간)에 두어 언제든지 프로세스가 일시 중지될 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 1. 비치 나무 입자 10mm 체로 커팅 밀을 사용하여 원하는 입자크기(Fagus sp.)를 생성하고, 50°C에서 일정한 질량(~24h)으로 입자를 건조시켜 – 10%의 잔류 수분 함량을 남긴다. 2. 리공세포로오스 분획 및 작업 리그노셀룰로오스 전처리 및 분별 25mL 스테인리스 스틸 고압 반응기에서 실온에서 5mL의 초순수수로 500 mg의 너도밤나무(Fagus sp.)입자및 78.0 mg(0.5mmol, 0.1M)을 일시 중단한다. 서스펜션에 2-MTHF 5mL과 교반 바를 추가하고 반응기를 닫습니다. 1시간 동안 1500rpm의 교반 속도로 가열판에 반응기를 160°C로 가열합니다. 10분 동안 얼음물의 실온으로 반응을 식히십시오. 반응기를 열고 NaOH 용액52.5 μL(증류수내 50wt% NaOH)을 추가하고 실온에서 15분, 교반판에 500rpm을 저어줍니다. 유기상 및 리닌 정량화의 격리 원심 분리 혼합물 (실온, 5 분, 1880 × g). 파이펫을 사용하여 유기상(2-MTHF)을 50mL 원형 플라스크로 전송합니다. 고체 및 건조 리그닌 분획이 얻어질 때까지 회전 증발기(40°C, 200rpm, 180mbar)에서 유기상을 증발시한다. 분석 밸런스로 계량하여 리그닌 수율을 결정합니다. 추가 분석을 위해 실온에 고체 리그닌을 저장합니다. 고체 셀룰로오스 농축 펄프 및 수성 상 분리 셀룰로오스 필터 용지(17-30 μm 모공 크기)를 사용하여 수성 상을 걸러내고 셀룰로오스 농축 펄프를 분리하고 수성 상을 5mL 유리병으로 이송합니다. 펄프를 중립 pH까지 3 x 25mL 물로 세척하고 세척 용액을 100mL 비커에 별도로 보관하십시오. 펄프를 80°C에서 일정한 질량(~24h)으로 건조시다. 분석 밸런스를 사용하여 계량하여 말린 펄프 수율을 결정합니다. FDCA 수상 의 복구 및 격리 수성상 및 세척용액의 pH를 얼음 욕조에서 냉각시키면서 농축 HCl을 사용하여 pH 1로 일정한 교반하에 2.3단계에서 별도로 조정한다. 범용 표시기 용지를 사용하여 pH를 제어합니다. 두 솔루션모두에서 침전된 고체(FDCA)를 걸레로 하고, 잔류물을 결합하고, 80°C에서 일정한 질량(~24h)으로 건조한다. 세고를 버리십시오. 분석 저울로 계량하여 FDCA 수율을 결정합니다. 수성 위상을 25mL 플라스크로 옮기고 분석을 위해 4°C에 저장한다. 모피 정량화를 위한 샘플 준비 별도의 실험을 수행하여 모피의 양을 결정합니다. 2.1.1-2.2.1 단계를 반복합니다. 수집된 유기 용매 분획에 내부 표준으로 n-decane 40 mg을 추가하고 분석을 위해 보관하십시오. 3. 분석 펄스 암페로메트릭 검출(HPAEC-PAD)을 이용한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 수성 상에서 설탕 분석 증류수 190μL로 2.4.3단계에서 수집된 수상10μL을 희석시켰다. 희석된 시료에 2mM 2-deoxy-D-포도당 10μL을 추가합니다. 0.5mL+min-1의 유량으로 단당류 분리를 수행하고 10분 동안 2mMNaOH로 평형 후 샘플을 주입한다. 중성 설탕을 18분 이상 2m NaOH로 분리합니다. 그 후, 550 mM NaOH를 10 분 동안 사용하여 비뇨기산을 분리하십시오. 800m NaOH로 10분 동안 기둥을 헹구습니다.참고: 소프트웨어는 단당류의 양을 내부 표준의 양으로 정규화하고 다른 단당류의 표준 교정 곡선을 사용하여 정량화합니다. 1H-13 C이성핵 단일 양자 상관 핵 자기 공명을 통한 리닌 분석(1H-13C-HSQC NMR) 0.5mL의 디메틸설프리산화물([d6]DMSO)에 리닌 50 mg을 용해시키고, 혼합물을 NMR 튜브로 옮기다. 400MHz 분광계를 사용하여 1H-13C HSQC(측정 시간 220분) NMR 측정을 수행합니다. 스펙트럼을 사용하여 리그닌에 존재하는 연결 유형을 결정합니다. 스펙트럼의 화학적 이동을 DMSO 신호(δ(1H) = 2.500 ppm; δ(13C) = 39.52 ppm)으로 참조한다. 모든 신호가 양수일 때까지 두 축모두에서 수동 위상 보정을 수행한 다음 기준 수정을 수행합니다. 방향족 단위의 신호와 리그닌의 연결체를 통합; 화학 적 변화에 대한 표 1을 참조하십시오. 다음 수식을 사용하여 방향족 단위(arom.)의 합계를 계산합니다.Σ (arom.) = (S2,6 / 2) + ((G2 + G5) / 2) + (H2,6 / 2)(1)Si가 2 및 6 실릴 양성자에 대응하는 신호에 상주하는 것으로,Gi는 2 및 5 과아실 양성자와 대응하는 신호에 상주하고,Hi는 2 및 6 p-하이드록시페닐 프로톤에 대응하는 신호에 상주한다. 다음 수식을 사용하여 각 단위의 백분율을 계산합니다.S = (S2,6/ 2) / σ (arom.) × 100 %(2)G = (G2 + G5) / 2) / 100 %(3)×H = (H2,6 / 2) / σ (arom.) × 100 %(4)S, G, H는 100단체 당 각각의 모노머 시링실-(S), 과아실-(G), p-하이드록시페닐(H)-모노머 유닛의 백분율이다. 다음 수식을 사용하여 100 단위당 연결 수를 계산합니다.β-O-4연계 =α β-O-4/+100%(5)×α β [β+β β-β + γ β-β+ × 100%(6)[α β-5 + β β-5 + γ β-5] / × 100%(7)α, β 및 γ 해당 β-O-O-β O-o-4-β 및 β-5연계의 α, β 및 γ 양성자 신호에 대응하는 신호에 통합됩니다.참고: 연결은 100단조 단위당 연결장치로 제공됩니다. 피크의 중복으로 인해β-O-4는α 양성자 신호만사용하여 계산됩니다. β β 및 β-5 연결은 해당 연결의 모든 신호를 사용하여 계산됩니다. 젤 투과 크로마토그래피 (GPC) 분석 1.5mL 가스 크로마토그래피(GC)-바이알에서 말린 리그닌 10 mg과 포도당 1mg(내부 표준)을 1mL에 0.1 M NaOH 및 0.01 wt% NaN3 수성 용액에 녹입니다. 중격이 있는 캡을 사용하여 GC 바이알을 닫습니다. 자외선 검출기가 장착된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템에 샘플의 100μL을 주입하고 λ = 280 nm의 파장을 모니터링한다. 극지 실리카 (8mm x 50mm)와 3 개의 젤 기둥 (8mm x 300mm, 입자 직경 : 5 μm, 명목 모공 폭 : 1000 Å)의 유속1mm min-1의유속으로 사전 열 프로그래밍 된 온도 분할 / 스플리스 인젝터 시스템으로 구성된 시스템을 사용합니다. 내부 표준(glucose)의 신호에 대해 얻은 데이터를 참조한다. 266에서 65000 Da 범위의 폴리(styrene sulfonate)를 사용한 외부 교정을 참조하는 소프트웨어를 사용하여 대량 분포를 계산합니다. GC를 통한 퍼펄 수량화 OrganoCat 전처리의 유기 단계에 내부 표준으로 20 mg n-decane를 추가합니다. 유기 상의 1mL를 1.5mL GC-바이알로 옮기. 이 용액의 1 μL을 극성 폴리우레탄 글리콜 고정상및 헬륨을 1.5mLmin-1및 화염 이온화 검출기로 운반기 가스로서 30m 컬럼을 사용하여 가스 크로마토그래프에 1μL을 주입한다. 초기 온도를 50°C로 설정한 다음 8°C~1 내지 250°C로 올리고 5분 동안 250°C에서 유지한다. 소프트웨어에서 제공하는 일체(Int)와 외부에서 계산된 보정 계수(cf)를 사용하여 모피를 정량화합니다. 2-MTHF의 1mL에서 1 mg의 furfural 및 5 mg의 n-decane 샘플을 준비하고 전술한 절차를 사용하여 GC에 주입합니다. 다음과 같이 보정 계수를 계산합니다.CF = (Int(n-decane) / m(n-decane))/ (Int(furfural) / Int(furfural))(8) 보정 계수를 사용하여 다음 수식으로 알 수 없는 샘플의 furfural 양을 계산합니다.m(furfural) =m (n-decane) / Int (n-decane) × cf × Int (furfural)(9) 셀룰로오스 농축 펄프 가수 분해 1.5mL 바이알을 사용하여 혼합(재료표참조)이 있는 가열 블록에서 오가노캣 전처리로부터 얻은 셀룰로오스 농축 잔류물의 펄프 가수분해를 수행한다. 셀룰로오스 농축 펄프 20 mg과 셀룰라아제 10 μL(60 필터 종이 단위(FPU) mL-1 및 82 셀로비아스 단위(CBU)mL-1)을1.5mL 바이알에 1mL의 구연산 버퍼(pH = 4.5)에 넣고 1.5mL 바이알, 50°C에서 0h, h 12h, h.h1로 흔들어 줍니다. 그 후, 효소를 분해하기 위해 샘플을 99°C로 10분 간 가열합니다. 포도당(육소키나아제) 분석 키트를 사용하여 포도당 농도를 결정한다.