JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

Celvrije productie van proteoliposomen voor functionele analyse en antilichaamontwikkeling gericht op membraaneiwitten

Published: September 22, 2020
doi:
10.3791/61871
,
1Graduate School of Medicine,Ehime University, 2Proteo-Science Center,Ehime University

Summary

Dit protocol beschrijft een efficiënte celvrije methode voor de productie van hoogwaardig proteoliposoom door middel van een bilayer-dialysemethode met behulp van een tarwecelvrij systeem en liposomen. Deze methode biedt geschikte middelen voor functionele analyse van membraaneiwitten, screening van medicijndoelen en ontwikkeling van antilichamen.

Abstract

Membraaneiwitten spelen een essentiële rol in verschillende cellulaire processen en vervullen vitale functies. Membraaneiwitten zijn medisch belangrijk bij het ontdekken van geneesmiddelen omdat ze het doelwit zijn van meer dan de helft van alle geneesmiddelen. Een obstakel voor het uitvoeren van biochemische, biofysische en structurele studies van membraaneiwitten en de ontwikkeling van antilichamen is de moeilijkheid om grote hoeveelheden hoogwaardig membraaneiwit te produceren met de juiste conformatie en activiteit. Hier beschrijven we een “bilayer-dialysemethode” met behulp van een tarwekiemcelvrij systeem, liposomen en dialysebekers om efficiënt membraaneiwitten te synthetiseren en gezuiverde proteolisomen in korte tijd te bereiden met een hoog slagingspercentage. Membraaneiwitten kunnen zoveel worden geproduceerd als in enkele milligrammen, zoals GPCR’s, ionkanalen, transporters en tetraspaninen. Deze celvrije methode draagt bij aan het verminderen van de tijd, kosten en moeite voor het bereiden van hoogwaardige proteoliposomen en biedt geschikte middelen voor functionele analyse van membraaneiwitten, screening van medicijndoelen en de ontwikkeling van antilichamen.

Introduction

Membraaneiwitten zijn een van de belangrijkste medicijndoelen bij diagnose en therapieën. Inderdaad, de helft van de kleine samengestelde geneesmiddelen zijn membraaneiwitten, zoals G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR’s) en ionkanalen1. In de loop der jaren hebben onderzoekers gewerkt aan biochemische, biofysische en structurele studies van membraaneiwitten om hun structuur en functie op te helderen 2,3. De ontwikkeling van monoklonale antilichamen tegen membraaneiwitten wordt ook actief uitgevoerd om functionele en structurele studies te versnellen en therapeutische en diagnostische toepassingen te ontwikkelen 4,5,6,7,8,9. Al deze studies vereisen een grote hoeveelheid hoogwaardige membraaneiwitten10. Er zijn bijvoorbeeld enkele milligrammen gezuiverde membraaneiwitten met natuurlijke conformatie nodig voor de ontwikkeling van antilichamen. Een veel grotere hoeveelheid sterk gezuiverde membraaneiwitten is nodig voor röntgenkristallografie. Massaproductie van membraaneiwitten blijft echter een knelpunt in membraaneiwitonderzoek11. Membraaneiwitten hebben gecompliceerde structuren met een of meer transmembraan helices en spelen een belangrijke rol bij celhomeostase. Heterologe overexpressie van membraaneiwitten leidt tot meerdere obstakels, zoals aggregatie van membraaneiwitten die zich ophopen bij hoge lokale concentraties of verstoring van cellulaire signaalroutes. Zelfs als de expressie succesvol is, ondervinden volgende stappen van monstervoorbereiding ook problemen. Bijvoorbeeld, de bereiding van proteoliposoom, vereist vaardigheden op hoog niveau en professionele ervaringen in oplosbaarheid, zuivering en stabilisatie van membraaneiwitten, en kost ook veel moeite en tijd12,13.

Aan de andere kant zijn er de afgelopen decennia enkele geavanceerde technologieën ontstaan om eiwitten te produceren zonder het gebruik van levende cellen 14,15,16,17,18. Celvrije eiwitsynthesetechnologie reconstitueert de translatiereactie in een reageerbuis. Omdat er geen beperkingen zijn die het cellulaire expressiesysteem heeft, hebben celvrije systemen het potentieel om een verscheidenheid aan eiwitten te synthetiseren die moeilijk tot expressie te brengen zijn of toxiciteit in cellen vertonen. Gezuiverd celextract of gereconstitueerde translationele machines worden gemengd met sjabloon mRNA’s, aminozuren en energiebronnen, en recombinante eiwitten worden in korte tijd gesynthetiseerd. Wat de membraaneiwitsynthese betreft, worden sommige soorten steigers bestaande uit lipiden of amfifielen, zoals liposomen, bicellen, nanodiscs of copolymeren toegevoegd aan de celvrije reactie 19,20,21,22,23,24. Gesynthetiseerde membraaneiwitten interageren met de steigers en kunnen worden gestabiliseerd in water. Celvrije gesynthetiseerde membraaneiwitten worden veel gebruikt in functionele studies en antilichaamproductie 25,26,27,28,29,30,31.

In dit protocol beschrijven we een efficiënte celvrije methode van proteoliposoomproductie met behulp van tarwecelvrij systeem en liposomen. Tarwecelvrij eiwitsynthesesysteem is een krachtig in vitro vertaalsysteem met behulp van extract uit tarwekiemen 15,32,33. Tarwekiemen bevatten een grote hoeveelheid translationele machines en weinig vertaalremmers. De translationele machinerie in tarwe, een lid van eukaryoten, is geschikt voor het vertalen van eukaryote eiwitten en de translatie-efficiëntie ervan wordt nauwelijks beïnvloed door codongebruik van het sjabloon-mRNA. Met behulp van een tarwecelvrij systeem hebben we een verscheidenheid aan eiwitten gesynthetiseerd, waaronder eiwitkinasen34,35, ubiquitine-ligases36, transcriptiefactoren37 en membraaneiwitten met hoge slagingspercentages. Voor de productie van membraaneiwitten voegen we lipideblaaslipoom toe aan het translatiemengsel als steiger19,38. Hydrofobe domeinen van membraaneiwit interageren met lipide bilayer en worden spontaan geïntegreerd met liposoom. Dichtheidsgradiëntcentrifugatie wordt gebruikt om proteoliposoom strikt te scheiden van endogene tarwe-eiwitten, hoewel een gemeenschappelijke centrifugatie van het translatiereactiemengsel voldoende is voor een eenvoudige zuivering van proteoliposoom20. Vele soorten integrale membraaneiwitten zijn gesynthetiseerd met behulp van tarwecelvrij systeem en toegepast voor verschillende onderzoeken en ontwikkelingen 25,38,39,40,41,42,43,44. Bovendien ontwikkelden we de “bilayer-dialysemethode” voor grootschalige productie45,46. Bij deze methode wordt het dialyseapparaat van het cuptype ondergedompeld in de substraatvoedingsbuffer en worden twee lagen translatiereactiemengsel en substraatvoedingsbuffer in de beker gevormd, zoals weergegeven in figuur 1. Continue toevoer van substraten en verwijdering van het bijproduct kunnen gedurende lange tijd efficiënt worden uitgevoerd aan zowel de boven- als de onderkant van het reactiemengsel, wat leidt tot een uitstekende vertaaleffectiviteit (figuur 2A en figuur 2B)45.

Protocol

1. Bereiding van pEU-expressieplasmide OPMERKING: pEU-expressieplasmide moet startcodon, open leesframe van doelmembraaneiwit en stopcodon in het fragment omvatten (zie figuur 1). Voeg indien nodig detectie-/zuiveringstagreeks(en) toe op de juiste positie. Restrictie-enzymvertering of naadloos klonen is van toepassing voor subcloning. Hier beschrijven we een protocol met behulp van een naadloze kloonmethode. Bereid dna-fragment in.Versterk het ge…

Representative Results

Met behulp van dit protocol kunnen gedeeltelijk gezuiverde proteoliposomen in korte tijd worden verkregen. De representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 2A. Vijfentwintig GPCR’s van klasse A, B en C werden met succes gesynthetiseerd met behulp van de bilayer-dialysemethode (kleinschalig) en gedeeltelijk gezuiverd door centrifugatie en bufferwas. Hoewel de hoeveelheid gesynthetiseerde eiwitten varieert afhankelijk van het type eiwit, kan meestal 50 tot 400 μg membraaneiwitten per …

Discussion

Het gepresenteerde protocol biedt een methode om membraaneiwitten te produceren met een hoog slagingspercentage. Dit protocol is eenvoudig, zeer reproduceerbaar en gemakkelijk op te schalen. Het heeft ook het potentieel om de tijd en kosten van experimenten die een grote hoeveelheid membraaneiwitten verbruiken te verminderen. De bilayer-dialysemethode verbetert de productiviteit met 4-10 keer in vergelijking met de bilayer-methode of dialysemethode (figuur 2B)45. In e…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd ondersteund door Platform Project for Supporting Drug Discovery en Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) van AMED onder Grant Number JP20am0101077. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.

Materials

×3 SDS-PAGE sample buffer Containing 10% 2-mercaptoethanol
5-20% gradient SDS-PAGE gel ATTO E-D520L
70% ethanol Diluted ethanol by ultrapure water.
Agarose Takara Bio
Ammonium acetate Nakalai tesque 02406-95 As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C.
Ampicillin Sodium Nakalai tesque 02739-74
Asolectin Liposome, lyophilized CellFree Sciences CFS-PLE-ASL A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.
BSA standard 1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer
CBB gel stain
cDNA clone of interest Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment
Chloroform Nakalai tesque 08402-84
Cooled incubator Temperature ranging from 0 to 40 °C or wider.
Creatine kinase Roche Diagnostics 04524977190
Dialysis cup (0.1 mL) Thermo Fisher Scientific 69570 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL
Dialysis cup (2 mL) Thermo Fisher Scientific 88404 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL
DNA ladder marker Thermo Fisher Scientific SM0311 GeneRuler 1 kb DNA Ladder
DpnI Thermo Fisher Scientific FD1703 FastDigest DpnI
E. coli strain JM109
Electrophoresis chamber ATTO
Ethanol (99.5%) Nakalai tesque 14713-95
Ethidium bromide
Evaporation flask, 100 mL
Gel imager
Gel scanner We use document scanner and LED immuninator as a substitute.
LB broth
Lipids of interest Avanti Polar Lipids
Micro centrifuge TOMY MX-307
NTP mix CellFree Sciences CFS-TSC-NTP Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each
Nuclease-free 25 mL tube IWAKI 362-025-MYP
Nucrease-free plastic tubes Watson bio labs Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
Nucrease-free tips Watson bio labs Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
PBS buffer
PCR purification kit MACHEREY-NAGEL 740609 NucleoSpin Gel and PCR Clean-up
pEU-E01-MCS vector CellFree Sciences CFS-11
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Nippon Gene 311-90151
Plasmid prep Midi kit MACHEREY-NAGEL 740410 NucleoBond Xtra Midi
Primer 1 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 2 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 3 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 4 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 5 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’
Sequencing primer, forward
Primer 6 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’
Sequencing primer, reverse
Protein size marker Bio-Rad 1610394 Precision Plus Protein Standard
Rotary evaporator
seamless cloning enzyme mixture New England BioLabs E2611L Gibson Assembly Master Mix
Other seamless cloning reagents are also avairable.
SP6 RNA Polymerase & RNase Inhibitor CellFree Sciences CFS-TSC-ENZ
Submarine Electrophoresis system
TAE buffer
Transcription Buffer LM CellFree Sciences CFS-TSC-5TB-LM
Translation buffer CellFree Sciences CFS-SUB-SGC SUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4).
Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.
Ultrapure water We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave.
We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system.
Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.
Ultrasonic homogenizer Branson SONIFIER model 450D-Advanced Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.
UV transilluminator
Vacuum desiccator
Wheat germ extract CellFree Sciences CFS-WGE-7240 WEPRO7240
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  2. Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 63, 18-25 (2020).
  3. Congreve, M., de Graaf, C., Swain, N. A., Tate, C. G. Impact of GPCR Structures on Drug Discovery. Cell. 181 (1), 81-91 (2020).
  4. Wilkinson, T. C. I. Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 831-837 (2016).
  5. Hino, T., Iwata, S., Murata, T. Generation of functional antibodies for mammalian membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 563-568 (2013).
  6. Webb, D. R., Handel, T. M., Kretz-Rommel, A., Stevens, R. C. Opportunities for functional selectivity in GPCR antibodies. Biochemical Pharmacology. 85 (2), 147-152 (2013).
  7. Douthwaite, J. A., Finch, D. K., Mustelin, T., Wilkinson, T. C. I. Development of therapeutic antibodies to G-protein coupled receptors and ion channels: Opportunities, challenges and their therapeutic potential in respiratory diseases. Pharmacology and Therapeutics. 169, 113-123 (2016).
  8. Hashimoto, Y., Yagi, K., Kondoh, M. Current progress in a second-generation claudin binder, anti-claudin antibody, for clinical applications. Drug Discovery Today. 21 (10), 1711-1718 (2016).
  9. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. mAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  10. Errey, J. C., Fiez-Vandal, C. Production of membrane proteins in industry: The example of GPCRs. Protein Expression and Purification. 169, 105569 (2020).
  11. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  12. Wiseman, D. N., et al. Expression and purification of recombinant G protein-coupled receptors: a review. Protein Expression and Purification. 167, 105524 (2020).
  13. Jeffery, C. J. Expression, Solubilization, and Purification of Bacterial Membrane Proteins. Current Protocols in Protein Science. 83 (1), 1-15 (2016).
  14. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242 (4882), 1162-1164 (1988).
  15. Takai, K., Sawasaki, T., Endo, Y. Practical cell-free protein synthesis system using purified wheat embryos. Nature Protocols. 5 (2), 227-238 (2010).
  16. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  17. Shimizu, Y., Kuruma, Y., Ying, B. W., Umekage, S., Ueda, T. Cell-free translation systems for protein engineering. The FEBS Journal. 273 (18), 4133-4140 (2006).
  18. Klammt, C., et al. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. The FEBS Journal. 273 (18), 4141-4153 (2006).
  19. Nozawa, A., et al. A cell-free translation and proteoliposome reconstitution system for functional analysis of plant solute transporters. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1815-1820 (2007).
  20. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35-45 (2011).
  21. Henrich, E., Hein, C., Dotsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
  22. Henrich, E., Peetz, O., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 243 (2017).
  23. Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10, 744 (2019).
  24. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  25. Sackin, H., Nanazashvili, M., Makino, S. I. Direct injection of cell-free Kir1.1 protein into Xenopus oocytes replicates single-channel currents derived from Kir1.1 mRNA. Channels. 9 (4), 196-199 (2015).
  26. Zemella, A., Richter, T., Thoring, L., Kubick, S. A combined cell-free protein synthesis and fluorescence-based approach to investigate GPCR binding properties. Methods in Molecular Biology. 1947 (10), 57-77 (2019).
  27. Vaish, A., Guo, S., Murray, R. M., Grandsard, P. J., Chen, Q. On-chip membrane protein cell-free expression enables development of a direct binding assay: A curious case of potassium channel KcsA-Kv1.3. Analytical Biochemistry. 556, 70-77 (2018).
  28. Suzuki, Y., et al. Functional G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) synthesis: the pharmacological analysis of Human Histamine H1 Receptor (HRH1) synthesized by a wheat germ cell-free protein synthesis system combined with asolectin glycerosomes. Frontiers in Pharmacology. 9, 38 (2018).
  29. Cortes, S., Barette, C., Beroud, R., De Waard, M., Schaack, B. Functional characterization of cell-free expressed Kv1.3 channel using a voltage-sensitive fluorescent dye. Protein Expression and Purification. 145, 94-99 (2018).
  30. Woznicka-Misaila, A., Juillan-Binard, C., Baud, D., Pebay-Peyroula, E., Ravaud, S. Cell-free production, purification and characterization of human mitochondrial ADP/ATP carriers. Protein Expression and Purification. 144, 46-54 (2018).
  31. Hashimoto, Y., et al. Engineered membrane protein antigens successfully induce antibodies against extracellular regions of claudin-5. Scientific Reports. 8 (1), 8383 (2018).
  32. Sawasaki, T., et al. A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products. FEBS Letters. 514 (1), 102-105 (2002).
  33. Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nature Methods. 5 (12), 1011-1017 (2008).
  34. Nemoto, K., Takemori, N., Seki, M., Shinozaki, K., Sawasaki, T. Members of the plant CRK superfamily are capable of trans- and autophosphorylation of tyrosine residues. The Journal of Biological Chemistry. 290 (27), 16665-16677 (2015).
  35. Takeda, H., et al. Comparative analysis of human src-family kinase substrate specificity in vitro. Journal of Proteome Research. 9 (11), 5982-5993 (2010).
  36. Takahashi, H., et al. Establishment of a wheat cell-free synthesized protein array containing 250 human and mouse E3 ubiquitin ligases to identify novel interaction between E3 ligases and substrate proteins. PLoS One. 11 (6), 0156718 (2016).
  37. Nozawa, A., et al. Construction of a protein library of Arabidopsis transcription factors using a wheat cell-free protein production system and its application for DNA binding analysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (7), 1661-1664 (2009).
  38. Goren, M. A., Nozawa, A., Makino, S. I., Wrobel, R. L., Fox, B. G. Cell-free translation of integral membrane proteins into unilamelar liposomes. Methods in Enzymology. 463, 647-673 (2009).
  39. Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35 (2011).
  40. Renauld, S., et al. Functional reconstitution of cell-free synthesized purified Kv channels. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1859 (12), 2373-2380 (2017).
  41. Liu, S., et al. Efficiency and Safety of CRAC Inhibitors in Human Rheumatoid Arthritis Xenograft Models. Journal of Immunology. 199 (5), 1584-1595 (2017).
  42. Jarecki, B. W., Makino, S. I., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into xenopus oocytes. Scientific Reports. 3, 1-7 (2013).
  43. David, G., et al. Phosphorylation and alternative translation on wheat germ cell-free protein synthesis of the DHBV large envelope protein. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 138 (2019).
  44. Jirasko, V., et al. Proton-detected solid-state NMR of the cell-free synthesized α-helical transmembrane protein NS4B from hepatitis C virus. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 21 (10), 1453-1460 (2020).
  45. Takeda, H., et al. Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. Scientific Reports. 5, 11333 (2015).
  46. Zhou, W., Takeda, H. Production of immunizing antigen proteoliposome using cell-free protein synthesis system. Methods in Molecular Biology. 1868, 49-67 (2018).
  47. Hutchings, C. J., Koglin, M., Marshall, F. H. Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. mAbs. 2 (6), 594-606 (2010).
  48. Raetz, C. R. H., et al. Discovery of new biosynthetic pathways: the lipid A story. Journal of Lipid Research. 50, 103-108 (2009).
  49. Baldridge, J. R., Crane, R. T. Monophosphoryl lipid A (MPL) formulations for the next generation of vaccines. Methods. 19 (1), 103-107 (1999).

Tags

Cell-free ProductionProteoliposomesMembrane ProteinsDrug DiscoveryIn-vitro Protein SynthesisLiposome PreparationWheat Germ ExtractTranscriptionTranslationCell-free Expression

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Zhou, W., Takeda, H. Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (163), e61871, doi:10.3791/61871 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image