Uso di Y-Mazes chiusi per valutare il comportamento chemosensorio nei rettili
Summary
I labirinti Y consentono ai ricercatori di determinare la pertinenza di stimoli specifici che guidano il comportamento degli animali, in particolare segnali chimici isolati da una varietà di fonti. Un’attenta progettazione e pianificazione può produrre dati solidi (ad esempio, discriminazione, grado di esplorazione, numerosi comportamenti). Questo apparato sperimentale può fornire una visione potente delle questioni comportamentali ed ecologiche.
Abstract
I rettili utilizzano una varietà di segnali ambientali per informare e guidare il comportamento degli animali come le scie chimiche al profumo prodotte dal cibo o dai conspecifici. Decifrare il comportamento olmo-trailing dei vertebrati, specie particolarmente invasive, consente la scoperta di spunti che inducono comportamenti esplorativi e possono aiutare nello sviluppo di preziosi strumenti biologici di base e applicati. Tuttavia, individuare comportamenti guidati in modo dominante da segnali chimici rispetto ad altri segnali ambientali concorrenti può essere impegnativo. I labirinti Y sono strumenti comuni utilizzati nella ricerca sul comportamento animale che consentono la quantificazione del comportamento chemiosensoriale dei vertebrati in una serie di taxa. Riducendo gli stimoli esterni, i labirinti Y rimuovono i fattori confondenti e presentano animali focali con una scelta binaria. Nei nostri studi sul labirinto Y, un animale profumato è limitato a un braccio del labirinto per lasciare una scia di profumo e viene rimosso una volta soddisfatti i parametri di deposizione del profumo. Quindi, a seconda del tipo di prova, l’animale focale è permesso entrare nel labirinto o viene creato un percorso olo-olcale concorrente. Il risultato è un record della scelta e del comportamento dell’animale focale mentre discrimina tra i segnali chimici presentati. Qui vengono descritti due apparati di labirinto Y su misura per diverse specie di rettili invasivi: le lucertole tegu in biancoe nero argentine (Salvator merianae) e ipitonibirmani ( Pythonbivittatus),che delineano il funzionamento e la pulizia di questi labirinti Y. Inoltre, sono stati riassunti la varietà di dati prodotti, svantaggi e soluzioni sperimentali e framework di analisi dei dati suggeriti.
Introduction
I labirinti Y sono strumenti semplici e comuni negli studi sul comportamento animale che consentono di affrontare una varietà di domande. Oltre ad essere ampiamente utilizzati negli studi di laboratorio, i labirinti Y sono anche funzionalmente compatibili con vari ambienti sul campo per studiare animali selvatici in contesti relativamente remoti. I ricercatori hanno esaminato i comportamenti dei vertebrati selvatici utilizzando i labirinti Y in un’ampia varietà di taxa in applicazioni sul campo altrettanto diverse (ad esempio, lampredi1; pesci ciclidi2; rane velenose3; lucertole lacertidi4; serpenti giarrettiera5).
Molti ricercatori si concentrano su come e in che misura gli spunti chimici guidano i comportamenti degli animali nell’ecologia riproduttiva, spaziale e foraggiamento6. Una varietà di stimoli chimici può essere testata nei labirinti Y e su scale fini, come due scie chimiche che differiscono solo leggermente nellaconcentrazione 7o capacità di rilevamento in base allo stato riproduttivo della specie bersaglio8. Le scie chimiche, il principale stimolo utilizzato nei test del labirinto Y, possono essere create naturalmente da conspecifici o specificamente collocate nell’ambiente da un ricercatore utilizzando una fonte chimicadefinita 1,5. Gli stimoli possono anche essere testati in combinazioni uniche per determinare l’influenza multimodale di segnali come i contesti mutevoli di presentazione cue (percorsi aerotrasportati vs substrati9;segnali visivi più chimici10). Sebbene esistano molti altri metodi per valutare le risposte chemiosensirie nei rettili (vedi sezione di discussione), i labirinti Y consentono di valutare i comportamenti di ricerca e a più scale temporali e spaziali, il che può portare a maggiori livelli di inferenza comportamentale.
I rettili sono stati ampiamente testati per la loro dipendenza da segnali chimici nell’ecologia riproduttiva e foraggiante, e i ricercatori spesso impiegano labirinti Y inquesti studi 11,12. L’ecologia chimica dei rettili continua ad essere decifrata da studi che impiegano Y-laze per affrontare una varietà di domande evolutive e comportamentali che sono preziose per i gestori della fauna selvatica. Ad esempio, recenti test con specie invasive di serpenti e lucertole hanno rivelato che i segnali chimici da soli possono influenzare la scelta e l’allocazione del tempo all’interno del nuovo ambiente di un labirinto Y13,14,15.
L’uso di grandi labirinti Y per animali focali di dimensioni moderate (ad esempio, rettili di grandi dimensioni) è generalmente limitato a ambienti di laboratorio in cui gli animali focali possono essere alloggiati facilmente a lungo termine, i fattori sperimentali (ad esempio clima, luce, stimoli esterni) possono essere controllati e l’accesso alle infrastrutture (ad esempio, energia, acqua corrente) è illimitato. Gli studi sugli animali selvatici, tuttavia, sono spesso limitati a luoghi specifici per vari motivi (ad esempio, logistica, permettendo). Di conseguenza, sorgono sfide che devono essere affrontate attraverso la risoluzione creativa dei problemi e adeguamenti metodologici per mantenere risultati coerenti e comparabili.
Qui, sono state descritte due configurazioni sperimentali utilizzando i labirinti Y e gli strumenti di monitoraggio remoto per valutare l’ecologia chimica riproduttiva dei rettili squamate invasivi (cioè serpenti e lucertole) in diversi scenari di campo: lucertole tegu argentine catturate allo stato selvatico e in cattività(Salvator merianae)a Gainesville, FL e pitoni birmani catturati allo stato selvatico (Python bivittatus) nel Parco Nazionale delle Everglades, FL. Come implica il suo nome, l’apparato del labirinto Y crea un ambiente sperimentale in cui un animale entra in un passaggio principale (la base della Y; “base”) che poi porta a due passaggi divergenti (le braccia della Y; “armi”). In questi esperimenti, due tipi di animali vengono utilizzati per un’unica prova: gli animali che depongono il profumo (forniscono il profumo di stimolo in un’area ristretta del labirinto) e gli animali focali (i dati vengono raccolti su questo animale mentre esplora il percorso del profumo).
Come apparato sperimentale negli studi chemioecologici, qualsiasi labirinto Y deve essere costruito in modo da consente una facile rimozione dell’animale all’interno e può essere sezionato per una pulizia e un ripristino accurati. Sono inoltre discussi i vincoli inerenti a questi diversi ambienti di prova (ad esempio, animali diurni e notturni, differenze infrastrutturali) che hanno portato ad adeguamenti metodologici. Sebbene l’attenzione si concentrasse sulle lucertole tegu e sui pitoni birmani, questi disegni possono essere applicati a una vasta gamma di specie di rettili. In questa ricerca sui rettili invasivi, gli Y-labirinti beneficiano del tasso e della scala di inferenza perché consentono una rapida raccolta di dati per informare gli obiettivi di gestione che si spostano di passo con la minaccia di invasione posta da una determinata specie. In particolare, lo studio della chemioecologia delle specie invasive è fondamentale per lo sviluppo di efficaci strumenti di controllo chimico.
La discriminazione è l’osservazione chiave dei test empirici che utilizzano i labirinti Y in cui un animale focale sceglie tra due stimoli e tale processo decisionale viene valutato. Una fascia di comportamenti può anche essere segnata nelle prove del labirinto Y durante la prova stessa (in diretta) o dopo la prova (video) per espandere il potere inferenziale. La complessità degli obiettivi a priori di un dato studio determina se l’osservazione dal vivo o le registrazioni archiviate si adattano meglio al progetto. Qui, i metodi Y-maze sono stati descritti in dettaglio per affrontare le domande chemioecologiche per informare studi futuri da parte di ricercatori interessati a domande simili sul comportamento dei rettili, specialmente nell’ecologia chimica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre i labirinti Y sono strumenti molto potenti per indagare l’ecologia chimica nei rettili, il loro design limitato può precludere altre vie di indagine. Tuttavia, è disponibile una varietà di altre opzioni11,12,20,21,22. Ad esempio, i test tongue-flick sono più semplici da eseguire e consentono la valutazione simultanea dei comportamenti esposti a una serie di stimoli chimici relativi agli odori dicontrollo 23,24,25,26. I test a campo aperto sono un’altra opzione in cui un animale focale esplora liberamente un recinto fino a quando non incontra una fonte di segnali chimici e le sue reazioni comportamentalivengono successivamente valutate 27,28. Combinazioni di questi approcci possono valutare le capacità discriminatorie dei rettili in diversi contesti come presentare un mix di odori artificiali e naturali insieme alla refugia29. I labirinti Y possono anche essere modificati per esporre gli animali a segnali chimici aerotrasportati da soli o in combinazione con segnali sostenuti da substrati16,30e l’inferenza post hoc può essere utilizzata per riprogettare la raccolta dei dati se sono disponibili dati video archiviati31. I bioasay dovrebbero essere progettati per semplificare la raccolta dei dati e ridurre al minimo gli stimoli contrastanti, specialmente quando si valuta una fonte specifica di segnali (ad esempio, segnali chimici21).
I ricercatori nel comportamento animale spesso osservano e quantificano le risposte focali degli animali in ambienti nuovi e artificiali (ad esempio, un labirinto chiuso con un paesaggio senza caratteristiche), e si dovrebbe fare attenzione a valutare se un determinato animale sta esibendo un comportamento naturale ed esplorativo rispetto all’elusione, all’agitazione o a comportamenti angosciati simili. Il comportamento animale in difficoltà negli apparati sperimentali è attribuito principalmente alla neofobia: paura dellanovità 32. Un esempio è il comportamento di fuga, in cui l’animale focale spinge contro le articolazioni o i bordi dell’apparato per ottenere l’uscita. Un altro esempio è la timidezza, dove l’animale focale dimostra riluttanza ad entrare nel labirinto, il cui grado può essere quantificato dalla latenza dell’ingresso nel labirinto. La progettazione dell’apparato (ri)può facilitare l’innesto dell’animale focale per evitare questi effetti confondenti del disagio. L’approccio più comune è l’introduzione ripetuta dell’animale focale all’apparato per rimuovere la novità dell’ambiente prima dell’inizio delle prove, e i modelli statistici contemporanei (ad esempio, modelli misti lineari generalizzati) consentono di utilizzare gli animali da laboratorio in più prove. Una parte importante rilevante per le considerazioni ecologiche nei test comportamentali è che la neofobia ridotta è associata al successo delle specie invasive33. Pertanto, a seconda della conoscenza a priori della specie in questione, la neofobia può avere un’importanza variabile come considerazione sperimentale del design.
L’acquisizione di dati comportamentali dai video impone più vincoli che diventano colli di bottiglia principali nelle tempistiche sperimentali. Ad esempio, la durata di una determinata prova può aumentare esponenzialmente il tempo di estrazione dei dati. Una soluzione alternativa è analizzare il comportamento solo fino a quando non viene raggiunta una soglia (ad esempio, tempo totale attivo). La soglia può essere basata sul video più lungo disponibile per una determinata versione di prova. In alternativa, è possibile sviluppare l’osservazione basata sulle macchine (ad esempio, l’intelligenza artificiale), sebbene ciò richiede tempo e risorse con un notevole sforzo necessario per il controllo della qualità. Un altro problema è la gestione dei dati: i video devono essere di qualità sufficiente per consentire il punteggio e la valutazione comportamentali, con conseguenti vincoli di archiviazione dei dati. Mentre l’archiviazione cloud è ora accessibile, le velocità di caricamento/download sono spesso problematiche, specialmente quando l’acquisizione dei dati avviene in posizioni di campo remote. Ulteriori sfide si manifestano nei limiti degli strumenti di registrazione che influiscono sull’integrità dell’osservazione comportamentale. Una visione chiara del comportamento focale degli animali è sempre necessaria, ma la visibilità è spesso ostacolata da fattori incontrollabili (ad esempio, umidità, insetti, movimento del vento). Inoltre, quando le registrazioni provengono da una singola prospettiva (ad esempio, vista a volo d’uccello), i comportamenti che si verificano nel piano verticale (ad esempio, la testa solleva14) sono difficili da valutare. Una soluzione è fornire più angoli di fotocamera per prova. Infine, l’ora del giorno influisce in modo significativo sulla registrazione comportamentale. L’analisi comportamentale notturna richiede una fotocamera con modalità notturna e proiezione minima della luce per evitare abbagliamento ostruttivo sulla superficie del labirinto Y o attrazione di insetti che possono interrompere l’alimentazione della fotocamera. Considerando quanto sopra, la conoscenza preliminare del sito di studio o della biologia delle specie può informare quali vincoli possono verificarsi con quale frequenza e quindi informare le dimensioni desiderabili del campione.
Il comportamento è strettamente accoppiato con la fisiologia, ed è stata dimostrata l’utilità dei labirinti Y per la valutazione dell’endocrinologia comportamentale in una varietà di specie. Tuttavia, questo documento enfatizza alcune variazioni nell’esecuzione di questi esperimenti a seconda delle specie bersaglio, della domanda di ricerca e delle risorse disponibili. Pertanto, la selezione dei materiali e delle dimensioni di ogni configurazione di prova dovrebbe essere attentamente considerata per la potenziale successiva espansione della ricerca. La sezione 2 descrive le modifiche apportate ai materiali delineati nella sezione 1, che sono state incorporate per adattarsi a future e più complesse prove comportamentali con tego. L’accresciuta profondità verticale dei labirinti delle Everglades consentirà di rispondere a nuove domande sull’ecologia chimica nei tego catturati allo stato selvatico senza prolungare indebitamente la progettazione e l’installazione del progetto, dimostrando ulteriormente la traducibilità di questo apparato sperimentale.
Quando si utilizzano le tecniche sopra descritte in un ambiente relativamente remoto (vedere la sezione 2), è necessario considerare diversi fattori limitanti e la pianificazione del progetto è fondamentale. A seconda del potere statistico necessario per l’esperimento di trattamento prescritto e dei tempi biologici delle specie bersaglio (ad esempio, stagionalità), le risorse e il lavoro richiesti saranno influenzati. Inoltre, se si desidera un uso singolo o ripetuto di animali focali, è necessaria un’attenta attenzione alla riduzione dei potenziali fattori di stress. Ognuno di questi fattori estenderà la sequenza temporale del progetto o richiederà un aumento della manodopera, dello spazio e dei materiali. Ad esempio, la sezione 2 presenta l’uso di pitoni maschi catturati allo stato selvatico come animali focali che si trascinano dietro un altro gruppo di maschi catturati allo stato selvatico e manipolati ormonalmente, che richiedono circa 24 ore di tempo di acclimatazione silenzioso nelle scatole di detenzione per ridurre al minimo gli effetti di stress. Sebbene questi periodi di acclimatazione prolungarono i tempi di prova a oltre due giorni, lo stress dovuto alla prigionia e alla manipolazione influisce sul comportamento degli animali selvatici e deve essere ridotto al minimo per generare setdi dati puliti 34,35.
In sintesi, i labirinti Y sono strumenti potenti e adattabili che possono essere utilizzati per indagare l’ecologia chimica di diversi animali selvatici in condizioni ampiamente variabili, a condizione che vi sia una pianificazione a priori vigile. Occorre prendere in attenta considerazione la scelta delle domande appropriate e la corretta progettazione dell’allestimento sperimentale per determinate taxa e condizioni. Ricercatori e manager possono trarre beneficio significativo dall’utilizzo di Y-laze per comprendere meglio la biologia chemiosenoriale animale in quanto questi strumenti consentono progetti sperimentali flessibili che forniscono grandi volumi di dati comportamentali su larga scala, specialmente se combinati con strumenti di monitoraggio remoto.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo sviluppo del primo labirinto Y è stato supportato da accordi di cooperazione (15-7412-1155-CA, 16-7412-1269-CA e 17-7412-1318-CA) tra la James Madison University (JMU) e l’USDA Animal and Plant Health Inspection Service. Lo sviluppo del labirinto Y nel Parco Nazionale delle Everglades è stato finanziato da un accordo di cooperazione (P18AC00760) tra la JMU e il National Park Service. Ringraziamo T. Dean e B. Falk per la facilitazione di questo progetto nelle Everglades NP e per l’assistenza nel permesso e nel finanziamento. Ringraziamo W. Kellow per l’assistenza nella costruzione del labirinto USGS Y. C. Romagosa, L. Bonewell e R. Reed fornirono supporto amministrativo e logistico. Ringraziamo i due recensori anonimi che hanno offerto un feedback utile. I finanziamenti per il lavoro delle Everglades e il supporto in natura sono stati forniti dal Programma scientifico dell’ecosistema prioritario delle Everglades del U.S. Geological Survey (USGS), dal National Park Service (P18PG00352) e dall’USGS Invasive Species Program. Qualsiasi uso di nomi commerciali, aziendali o di prodotti è solo a scopo descrittivo e non implica l’approvazione da parte del governo degli Stati Uniti. I risultati e le conclusioni di questa pubblicazione non sono stati formalmente diffusi dal Dipartimento dell’Agricoltura degli Stati Uniti e non dovrebbero essere interpretati per rappresentare la determinazione o la politica dell’USDA.
Materials
| 1" Steel zinc-plated corner brace | Everbilt, The Home Depot | 13619 | See Supplemental File 1, Step 2.1 "90 degree 2.5 cm steel corner brace" |
| 121.92cm W x 304.8cm L x 1.27cm H white polypropylene Extended Range High-Heat UHMW Sheet | TIVAR | UHMNV SH | See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.1. "white polpropylene") |
| 182.88 cm L x 81.28 cm W x 0.64 cm Thick Clear Acrylic Sheet | Plexiglass | 32032550912090 | See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.1.6. "Acrylic pieces") |
| 2.54 cm W x 2.54 cm H x 243.84 cm L Mill-Finished Aluminum Solid Angle | Steelworks | 11354 | See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.1.1. "aluminum angle bracket") |
| 4.5 kg spool of 5 mm Round Polypropylene Welding Rods | HotAirTools | AS-PP5N10 | See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.1. "heat weld") |
| 5 mm Plain Aluminum Rivets | Arrow | RLA3/16IP | See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.1.1. "rivet") |
| Aluminum angle, 1.9 cm | Everbilt, The Home Depot | 802527 | See Supplemental File 1, Step 1.2 "aluminum angle (1.9 cm x 1.9 cm x 0.16 cm thick)" |
| Aluminum angle, 2.5 cm | Everbilt, The Home Depot | 800057 | See Supplemental File 1, Steps 1.2 and 2.2.2 "aluminum angle (2.5 cm x 2.5 cm x 0.16 cm thick)" |
| Aluminum angle, 3.2 cm | Everbilt, The Home Depot | 800037 | See Supplemental File 1, Step 1.2 "aluminum angle (3.2 cm x 3.2 cm x 0.16 cm thick)" |
| Aluminum flat bar 1" x 1/8" thick | Everbilt, The Home Depot | 801927 | See Supplemental File 1, Step 3.2.1 "aluminum strap" |
| Avigilon 2.0 MP camera | Avigilon, a Motorola Solutions Company | 2.0C-H4SL-BO1-IR | See "1.5 Camera set-up and video acquisition" (step 1.5.1 "Avigilon 2.0 MP") |
| Avigilon NVR | Avigilon, a Motorola Solutions Company | HD-NVR3-VAL-6TB-NA | See "1.5 Camera set-up and video acquisition" (step 1.5.3 "NVR") |
| Clear acrylic sheet (5.6 mm thick) | United States Plastic Corp. | 44363 | See Supplemental File 1, Step 1.3 "clear acrylic sheet" and step 3.2.1 "clear acrylic door" |
| Fillet Weld Nozzle 3/16" x 15/32" / 4.5 x 12 mm | TRIAC | 107.139 | See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.1. "heat weld") |
| Hanging File Folder Box | Sterilite | 18689004 | See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.2.1. "Boxes") |
| HardiePanel HZ10 | James Hardie Building Products | 9000525 | See Supplemental File 1, Step 1.1 "fiber cement siding" |
| Heat Welding Gun | TRIAC | 141.227 | See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.1. "heat weld") |
| Kraft Butcher Paper Roll, 24" | Bryco Goods | 24 inch x 175 FT | See "1.2 Protocol for running scent-laying tegus" (step 1.2.1.2 "butcher paper") |
| Kraft Butcher Paper Roll, 46 cm wide | Bryco Goods | BGKW2100 | See "2.3. Protocol for running scent-laying pythons" (step 2.3.4. "scenting paper") |
| Micro-90 Concentrated Cleaning Solution | International Products Corporation | M-9050-12 | See "1.4 Breakdown and clean-up" (step 1.4.4 "laboratory-grade soap") |
| MKV ToolNix – Matroska tools for linux/Unix and Windows | Moritz Bunkus | v.48.0.0 | See "2.2. Camera setup and video acquisition" (step 2.2.4.2. "movie processing software") |
| Network Camera | Axis Communications | M3104-LVE | See "2.2. Camera setup and video acquisition" (step 2.2.1. "Project camera") |
| Palight ProjectPVC 1/4" | Palram | 159841 | See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.2.3. "faceplate") |
| Palight ProjectPVC 1/8" | Palram | 156249 | See "2.1. Y-maze components and rationale for changes to USDA design " (step 2.1.2.1. "door") |
| Privacy windscreen (green) | MacGregor | Size to fit | See Supplemental File 1, Step 4.2 "green heavy duty shade cloth" |
| Protective Glove, Full-Finger | ArmOR Hand | HS1010-RGXL | See "2.3. Protocol for running scent-laying pythons" (step 2.3.11.2. NOTE: "puncture-resistant glove") |
| REScue Disinfectant | Virox Animal Health | 44176 | See "1.5. Breakdown and clean-up." (step 1.5.4. NOTE "sanitation solution") |
| Reversable PVC trim, 1/2" x 24" | UFP Industries, Veranda products | H120XWS17 | See Supplemental File 1, Step 2.1 "PVC board partition", and step 3.2.1 "thinner PVC trim boards" |
| S4S / Veranda HP TRIM | UFP Industries, Veranda products | H190OWS4 | See Supplemental File 1, Steps 1.2, 2.2.2, and 2.2.3 "PVC board" |
| S4S / Veranda HP TRIM (1" x 8" Nominal) | UFP Industries, Veranda products | 827000005 | See Supplemental File 1, Steps 3.2.1 "PVC trim board" |
| ScotchBlue 24 in. Pre-taped Painter’s Plastic | 3M | PTD2093EL-24-S | See "1.2 Protocol for running scent-laying tegus" (step 1.2.1.3 "plastic sheeting") |
| Sterilite 114 L tote box | Sterilite Company | 1919, Steel | See Supplemental File 1, Step 3.2 "arm box" |
| Sterilite 189 L tote box | Sterilite Company | 1849, Titanium | See Supplemental File 1, Step 3.2 "Base box" |
| Super Max Canopy | ShelterLogic | 25773 | See Supplemental File 1, Step 4.3 "white canopy" |
| VLC Media Player | VideoLAN | v.3.0.11 | See "2.2. Camera setup and video acquisition" (step 2.2.4.3. "media file reviewing program") |
| White Pavilion Tent | King Canopy | BJ2PC | See Supplimental File 2 "3. Enclosure materials and consideratons" (step 3. "pavilion tent") |
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