Experimentele auto-immune uveïtis: een intraoculair inflammatoir muismodel
Summary
In dit rapport presenteren we een protocol waarmee de onderzoeker een muismodel van intraoculaire uveïtis kan genereren. Meer algemeen aangeduid als experimentele auto-immune uveïtis (EAU), dit gevestigde model legt vele aspecten van de menselijke ziekte vast. Hierin zullen we beschrijven hoe de progressie van de ziekte kan worden geïnduceerd en gevolgd met behulp van verschillende uitlezingen.
Abstract
Experimentele auto-immune uveïtis (EAU) wordt aangedreven door immuuncellen die reageren op zelf-antigenen. Veel kenmerken van dit niet-infectieuze, intraoculaire ontstekingsziektemodel recapituleren het klinische fenotype van posterieure uveïtis die mensen treft. EAU is betrouwbaar gebruikt om de werkzaamheid van nieuwe inflammatoire therapieën, hun werkingsmechanisme te bestuderen en om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de progressie van de ziekte van intraoculaire aandoeningen verder te onderzoeken. Hier bieden we een gedetailleerd protocol over EAU-inductie in de C57BL / 6J-muis – het meest gebruikte modelorganisme met gevoeligheid voor deze ziekte. Klinische beoordeling van de ernst en progressie van de ziekte zal worden aangetoond met behulp van fundoscopie, histologisch onderzoek en fluoresceïneangiografie. De inductieprocedure omvat subcutane injectie van een emulsie met een peptide (IRBP1-20) uit het oculaire eiwit interfotoreceptor retinoïde bindend eiwit (ook bekend als retinolbindend eiwit 3), Complete Freund’s Adjuvant (CFA) en aangevuld met gedode Mycobacterium tuberculosis. Injectie van deze viskeuze emulsie op de achterkant van de nek wordt gevolgd door een enkele intraperitoneale injectie van Bordetella pertussis toxine. Bij het begin van de symptomen (dag 12-14) en onder algemene anesthesie worden fundoscopische beelden gemaakt om de progressie van de ziekte te beoordelen door middel van klinisch onderzoek. Deze gegevens kunnen direct worden vergeleken met die op latere tijdstippen en piekziekte (dag 20-22) met geanalyseerde verschillen. Tegelijkertijd stelt dit protocol de onderzoeker in staat om potentiële verschillen in vaatdoorlaatbaarheid en schade te beoordelen met behulp van fluoresceïneangiografie. EAU kan worden geïnduceerd in andere muizenstammen – zowel wildtype als genetisch gemodificeerd – en gecombineerd met nieuwe therapieën die flexibiliteit bieden voor het bestuderen van de werkzaamheid van geneesmiddelen en / of ziektemechanismen.
Introduction
Dit protocol zal aantonen hoe experimentele auto-immune uveïtis (EAU) in de C57BL/6J-muis kan worden geïnduceerd door een enkele subcutane injectie van een retinaal antigeen in een geëmulgeerd adjuvans. Methoden voor het monitoren en beoordelen van ziekteprogressie zullen worden gedetailleerd door middel van fundoscopische beeldvorming en histologisch onderzoek, met meetparameters die binnenin worden beschreven. Daarnaast zal fluoresceïneangiografie, een techniek voor het onderzoeken van de retinale bloedvatstructuur en permeabiliteit, worden besproken.
Dit EAU-model vat centrale kenmerken van niet-infectieuze posterieure uveïtis bij mensen samen met betrekking tot clinicopathologische kenmerken en de basale cellulaire en moleculaire mechanismen die ziekte veroorzaken. EAU wordt gemedieerd door Th1- en/of Th17-subgroepen van zelfreactieve CD4+T-lymfocyten, zoals aangetoond in adoptieve overdrachtsexperimenten en met IFNγ-uitgeputte muizen1. Veel van ons begrip van de mogelijke rollen voor deze cellen bij uveïtis komt van het bestuderen van EAU2, waar zowel Th1- als Th17-cellen worden gedetecteerd in de retinale weefsels3. Vaak wordt EAU gebruikt als een preklinisch model om het nut van nieuwe therapieën bij het verzachten van ziekten te beoordelen. Therapeutische benaderingen die met succes de EAU-ziekte hebben gemoduleerd, hebben enige werkzaamheid in de kliniek aangetoond en de door de FDA goedgekeurde status bereikt. Voorbeelden hiervan zijn groepen immunoregulerende geneesmiddelen zoals de T-celgerichte therapieën: ciclosporine, FK-506 en rapamycine 4,5,6. Onlangs zijn interventies gericht op nieuwe paden ook onderzocht in dit model om zowel het mechanisme als het effect op de uitkomst van de ziekte te onderzoeken. Deze omvatten gerichte transcriptionele regulatie via chromatinelezer Bromodomain Extra-Terminal (BET) eiwitten en P-TEFb-remmers3. Bovendien hebben meer conventionele benaderingen zoals een VLA-4-remmer onlangs onderdrukking in EAU aangetoond via modulatie van effector CD4 + T-cellen7. Bovendien is gebleken dat het richten op Th17-cellen met TMP778, een RORγt-inverse agonist, ook EAU8 aanzienlijk onderdrukt. Bovendien biedt dit model de mogelijkheid om chronische auto-immuunontsteking in het netvlies en de bijbehorende onderliggende mechanismen zoals lymfocytenpriming te bestuderen.
De primaire uitlezingen voor preklinische studies van EAU zijn klinische beoordeling door het uitvoeren van retinale fundoscopie beeldvorming en minder vaak, door het beoordelen van retinale integriteit door optische coherentie tomografie (OCT). Retinale histopathologische evaluatie en immunofenotypering van retinale cellen door middel van flowcytometrie worden vervolgens bij beëindiging uitgevoerd. Fundoscopie is een eenvoudig te gebruiken live beeldvormingssysteem dat een snelle en reproduceerbare klinische beoordeling van het hele netvlies mogelijk maakt. Voor immunohistochemische beoordelingen zijn de technieken gebaseerd op de voorbereiding van retinale secties waarmee we weefselarchitectuur kunnen bestuderen op de mate van ontsteking en structurele schade9. De beoordelingscriteria en conventionele scoresystemen, voor alle gebruikte technieken, zullen in dit protocol worden beschreven. De omvang van de schade die is geregistreerd met behulp van fundoscopische beeldvorming correleert vaak nauw met histologische veranderingen. Deze dubbele benadering voor het monitoren en beoordelen van de ernst van de ziekte zorgt voor een grotere gevoeligheid en betrouwbaardere meetresultaten.
EAU is een gevestigde, veelgebruikte model voor preklinische testen en onderzoek van immuungemedieerde oogziekte. Dit model is betrouwbaar en reproduceerbaar met >95% ziekte-incidentie en genereert uitgebreide gegevens die kunnen worden gebruikt om nieuwe therapieën voor de behandeling van intraoculaire ontstekingsziekten te valideren of af te wijzen die wereldwijd een belangrijke oorzaak van blindheid in de werkende leeftijd vormen10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Experimentele diermodellen zijn noodzakelijke hulpmiddelen voor het bestuderen van ziektepathogenese en preklinisch testen van nieuwe therapeutische paradigma’s. In het huidige protocol hebben we een methodologie besproken voor het induceren, monitoren en scoren van EAU, een experimenteel model van intraoculaire inflammatoire uveïtis. Dit EAU-model heeft meer dan 95% ziekte-incidentie wanneer alle procedures worden uitgevoerd volgens het hierin beschreven protocol en resulteert in de ontwikkeling van chronische, monofas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JG kreeg een UCL Impact Studentship en Rosetrees Trust-financiering om CB te ondersteunen. VC ontving een onderzoekssubsidie van Akari Therapeutics Inc. We willen het UCL Institute of Ophthalmology, Biological Service Unit bedanken, in het bijzonder mevrouw Alison O’Hara en haar team voor hun technische ondersteuning.
Materials
| antisedan | ZOETIS, USA | for waking up | |
| Complete Freund’s Adjuvant; CFA | Sigma, UK | F5881 | for immunisation |
| Domitor | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Flourescein | Sigma, UK | F2456 | for Angiography |
| IRBP1-20 | Chamberidge peptide, UK | peptide;antigen | |
| Ketamine | Orion Pharma, Finland | for anesthesia | |
| Micron III | Phoenix Research, USA | for fundoscopy | |
| Mouse Serum | Sigma, UK | M5905 | for immunisation |
| Mycobacterium terberculosis | Sigma, UK | 344289 | for immunisation |
| Pertussis Toxin | Sigma, UK | P2980 | for immunisation |
| phenylephrine hydrochloride 2.5% | Bausch & Lomb UK | PHEN25 | for dilation |
| Tropicamide 1% | SANDOZ | for dilation | |
| Viscotears | WELDRICKS Pharmacy, UK | 2082642 | for eye lubrication |
References
- Lyu, C., et al. TMP778, a selective inhibitor of RORgammat, suppresses experimental autoimmune uveitis development, but affects both Th17 and Th1 cell populations. The European Journal of Immunology. 48, 1810-1816 (2018).
- Klaska, I. P., Forrester, J. V. Mouse models of autoimmune uveitis. Current Pharmaceutical Design. 21, 2453-2467 (2015).
- Eskandarpour, M., Alexander, R., Adamson, P., Calder, V. L. Pharmacological Inhibition of Bromodomain Proteins Suppresses Retinal Inflammatory Disease and Downregulates Retinal Th17 Cells. The Journal of Immunology. 198, 1093-1103 (2017).
- Mochizuki, M., et al. Preclinical and clinical study of FK506 in uveitis. Current Eye Research. 11, 87-95 (1992).
- Nguyen, Q. D., et al. Intravitreal Sirolimus for the Treatment of Noninfectious Uveitis: Evolution through Preclinical and Clinical Studies. Ophthalmology. 125, 1984-1993 (2018).
- Leal, I., et al. Anti-TNF Drugs for Chronic Uveitis in Adults-A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Frontiers in Medicine (Lausanne). 6, 104 (2019).
- Chen, Y. H., et al. Functionally distinct IFN-?+ IL-17A+ Th cells in experimental autoimmune uveitis: T-cell heterogeneity, migration, and steroid response. European Journal of Immunology. 50 (12), 1941-1951 (2020).
- Xu, H., et al. A clinical grading system for retinal inflammation in the chronic model of experimental autoimmune uveoretinitis using digital fundus images. Experimental Eye Research. 87, 319-326 (2008).
- Copland, D. A., et al. The clinical time-course of experimental autoimmune uveoretinitis using topical endoscopic fundal imaging with histologic and cellular infiltrate correlation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 5458-5465 (2008).
- Dick, A. D. Doyne lecture 2016: intraocular health and the many faces of inflammation. Eye (Lond). 31, 87-96 (2017).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in Molecular Biology. 900, 443-469 (2012).
- Caspi, R. R. A look at autoimmunity and inflammation in the eye. Journal of Clininical Investigation. 120, 3073-3083 (2010).
- Caspi, R. R., et al. Mouse models of experimental autoimmune uveitis. Ophthalmic Research. 40, 169-174 (2008).
- Shao, H., et al. Severe chronic experimental autoimmune uveitis (EAU) of the C57BL/6 mouse induced by adoptive transfer of IRBP1-20-specific T cells. Experimental Eye Research. 82, 323-331 (2006).
- Horai, R., et al. Microbiota-Dependent Activation of an Autoreactive T Cell Receptor Provokes Autoimmunity in an Immunologically Privileged Site. Immunity. 43, 343-353 (2015).
- Chen, J., et al. Comparative analysis of induced vs. spontaneous models of autoimmune uveitis targeting the interphotoreceptor retinoid binding protein. PLoS One. 8, 72161 (2013).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C. C., Caspi, R. R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8, 63904 (2013).
- Harry, R., et al. Suppression of autoimmune retinal disease by lovastatin does not require Th2 cytokine induction. Journal of Immunology. 174, 2327-2335 (2005).
