Некодирующая малая РНК MicC способствует вирулентности белков наружной мембраны Salmonella enteritidis
Summary
Система рекомбинации, опосредованная λ-красным, была использована для создания мутанта делеции небольшой некодирующей РНК micC.
Abstract
Некодирующая малая РНК (сРНК) является новым фактором регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне. Разновидность sRNA MicC, известная в Escherichia coli и Salmonella Typhimurium, может подавлять экспрессию белков внешней мембраны. Для дальнейшего изучения функции регуляции micC в Salmonella Enteritidis мы клонировали ген micC в штамме Salmonella Enteritidis 50336, а затем сконструировали мутант 50336Δ micC с помощью системы рекомбинации на основе λ Red и комплементированного мутанта 50336Δ micC/p micC, несущего рекомбинантную плазмиду pBR322, экспрессирующую micC. Результаты qRT-ПЦР показали, что транскрипция ompD в 50336Δ micC была в 1,3 раза выше, чем у штамма дикого типа, в то время как транскрипция ompA и ompC у 50336ΔmicC была в 2,2 раза и 3 раза выше, чем у штамма дикого типа. Они указывали на то, что micC подавляет экспрессию ompA и ompC. В следующем исследовании патогенность 50336ΔmicC была обнаружена как у 6-недельных мышей Balb/c, так и у 1-дневных цыплят. Результат показал, что LD 50 штамма дикого типа 50336, мутанты 50336Δ micC и 50336Δ micC/pmicC для 6-недельных мышей Balb/c составляли 12,59 КОЕ, 5,01 КОЕ и 19,95 КОЕ соответственно. LD50 штаммов для 1-дневных цыплят составляли 1,13 x 109 КОЕ, 1,55 x 10 8 КОЕ и 2,54 x 108 КОЕ соответственно. Он указал, что удаление micC повышает вирулентность S. Энтеритидис у мышей и цыплят путем регулирования экспрессии белков наружной мембраны.
Introduction
Некодирующие малые РНК (сРНК) имеют длину 40-400 нуклеотидов, которые обычно не кодируют белки, но могут быть транскрибированы независимо в бактериальных хромосомах 1,2,3. Большинство мРНК кодируются в межгенных областях (IGR) между областями, кодирующими гены, и взаимодействуют с целевыми мРНК посредством действий спаривания оснований и регулируют экспрессию генов-мишеней на посттранскрипционном уровне 4,5. Они играют важную роль в регуляции метаболизма веществ, синтезе белка внешней мембраны, восприятии кворума и экспрессии гена вирулентности5.
MicC представляет собой 109-нуклеотидный малый транскрипт РНК, присутствующий в сероварах Escherichia coli и Salmonella enterica Typhimurium, который может регулировать экспрессию нескольких белков внешней мембраны, таких как OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 и Omp36 6,7,8,9. MicC регулирует экспрессию OmpC путем ингибирования связывания рибосом с лидером мРНК ompC in vitro, и для его функции в Escherichia coli6 требуется шаперон РНК HfQ. В Salmonella Typhimurium MicC подавляет мРНК ompD через дуплекс РНК ≤12.н. в кодирующей последовательности (кодоны 23-26), а затем дестабилизирует эндонуклеолитическую мРНК7. Этому процессу регуляции помогает белок шаперона Hfq10. OmpC представляет собой обильный белок внешней мембраны, который, как считалось, важен в средах с высокими концентрациями питательных веществ и токсинов, например, в кишечнике6. Порин OmpD является наиболее распространенным белком наружной мембраны Salmonella Typhimurium и составляет около 1% от общего количества клеточного белка11. OmpD участвует в адгезии к макрофагам человека и эпителиальным клеткам кишечника12. MicC также подавляет экспрессию пор как OmpC, так и OmpD. Считается, что MicC может регулировать вирулентность. Чтобы исследовать новые гены-мишени, регулируемые MicC, и изучить функцию регуляции вирулентности micC, мы клонировали ген micC в штамме Salmonella Enteritidis (SE) 50336, а затем сконструировали мутант 50336ΔmicC и дополненный мутант 50336ΔmicC/p micC. Новые гены-мишени были проверены с помощью qRT-PCR. Вирулентность 50336ΔmicC была обнаружена мышами и куриными инфекциями.
Protocol
Representative Results
Discussion
С. Энтеритидис является важным факультативным внутриклеточным патогеном, который может инфицировать молодых цыплят и вызывает симптомы от энтерита до системной инфекции и смерти17,18. Кроме того, S. Enteritidis вызывает латентные инфекции у взрослых ц…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Китайского национального научного фонда (No 31972651 и 31101826), Научного фонда высшего образования провинции Цзянсу (No 14KJB230002), Государственной ключевой лаборатории ветеринарной биотехнологии (No SKLVBF201509), гранта Фонда естественных наук Янчжоу (No YZ2014019), проекта, финансируемого Приоритетной академической программой развития высших учебных заведений провинции Цзянсу (PAPD).
Materials
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
References
- Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).
- Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
- Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
- Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
- Waters, L. S., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136 (4), 615-628 (2009).
- Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
- Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
- Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).
- Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
- Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
- Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
- Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
- Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).
- Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
- De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
- Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).
- Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).
- Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
- Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
- Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
- Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
- Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
- Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
- Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
- Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J. Regulatory RNA in bacterial pathogens. Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).
