극심분리에 의한 혈장 지단백질의 격리 및 분석
Summary
혈장 지단백질을 분석하기 위해 여러 가지 방법이 사용되었습니다. 그러나, 초원심 분리는 여전히 가장 인기 있고 신뢰할 수있는 방법 중 하나입니다. 여기서는 순차밀도 극심분리를 이용하여 플라즈마로부터 지단백질을 분리하는 방법과 진단 및 연구 목적으로 아폴리포단백질을 분석하는 방법에 대한 방법을 설명합니다.
Abstract
플라즈마 지단백질과 아폴리포단백질의 분석은 지질 대사와 죽상 동맥 경화증의 이상지질혈증 진단 및 연구 결과를 위한 필수적인 부분입니다. 플라즈마 지단백질을 분석하기 위한 몇 가지 방법이 있지만, 초원심 분리는 여전히 가장 인기 있고 신뢰할 수 있는 방법 중 하나입니다. 그것의 그대로 분리 절차 때문에, 이 방법에 의해 고립된 지단백질 분획은 지단백질, apolipoproteins, proteomes 및 시험관내 배양된 세포를 가진 지단백질의 기능적인 연구 결과에 이용될 수 있습니다. 여기서, 우리는 VLDL (d&1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDL (d=1.04 및 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1.10, 및 1.21 g/mL)를 포함하는 7개의 지단백질 분획을 격리하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 또한, SDS-PAGE 및 서양 블로팅에 의해 아포아-I, apoB 및 apoE와 같은 아포포단백질을 분석하고 고지립 토끼 모델을 사용하여 지단백질 및 아폴리포단백질 프로파일의 대표적인 결과를 보여주는 방법을 독자에게 소개합니다. 이 방법은 임상의와 기초 과학자 모두에게 지단백질 기능을 분석하는 표준 프로토콜이 될 수 있습니다.
Introduction
이상지질혈증은 세계에서 죽상 경화성 질환의 주요 위험 요소입니다. 저밀도 지단백(LdL) 및 저농도 고밀도 지단백(HDL)의 높은 수준은 관상 동맥 심장질환(CHD)1,2의고위험과 밀접한 관련이 있다. 임상 환경에서, LDL 콜레스테롤(LDL-C)과 HDL-콜레스테롤(HDL-C)은 임상 실험실3,4에서자동화된 분석기를 사용하여 일상적으로 측정된다. 그럼에도 불구 하 고, 이상 지질 혈 증의 진단 및 인간 및 실험 동물에 지질 대사와 동맥 경화증의 연구에 대 한 세부 사항에 지 단 단 프로파일을 분석 하는 것이 필수적이다. 초원심분리, 크기 배제 크로마토그래피[빠른 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)], 아가로즈 및 다극성 겔, 핵자기 공명, 선택적 화학적 흡기 등의 플라즈마 지단백질을 분석하는 몇 가지 방법이 보고되었다. 1950년대에 하벨 그룹은 먼저 초원심분리를 사용하여 밀도에 의해 정의된 지단백질개념을 제안하고 chylomicrons(CM), 매우 저밀도 지단백(VLDL), 중밀도 지단백질(IDL), LDL 및 HDL5로 분류하여 다른그룹,6개군에 의해 더 수정되었다. 지금까지, 초원심 분리는 실용적인 프로토콜을 아직 사용할 수없는 동안 가장 인기 있고 신뢰할 수있는 방법입니다. 이 논문에서는 이전에 설명한 순차 밀도 부동 초원심분리기를 사용하여 소량의 플라즈마를 격리하기 위한 사용하기 쉬운 프로토콜을 설명하려고시도하였다. 7개의 플라즈마 지단백질 분획 [VLDL(d&1.006 g/mL), IDL(d=1.02 g/mL), LDL(d=1.04 및 1.06 g/mL), HDL(d=1.08), HDL(d=1.08) 1.10, 및 1.21 g/mL)]을 통해 연구자들은 지단백질과 그들의 조성성 아폴리포단백질9,10,11모두에대한 광범위한 분석을 할 수 있다. 그대로 7개의 연속밀도 지단백은 지단백질 기능을 분석하고 세포 기반 체외 전략에도 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 임상 진단과 기본 연구 모두에 유용해야합니다. 여기서 우리는 토끼 플라즈마를 다른 종의 플라즈마가 동일한 방식으로 적용 할 수있는 동안이 기술을 입증하는 예로 사용했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
고지혈증은 동맥 경화성 질환의 가장 중요한 위험 요소 중 하나입니다. 따라서, 플라즈마 지단백질의 분석은 이상지질혈증 환자의 진단에 필수적일 뿐만 아니라 지단백질 대사와 죽상 동맥 경화증의 분자 기계장치의 조사에또한 중요합니다. 이 연구에서는 극심분리가 가능한 실험실에서 적용될 수 있는 혈장 지단백질의 격리 및 분석 프로토콜을 설명했습니다. 이 방법에 의해 얻은 정보는 포괄?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 JSPS KAKENHI 그랜트 번호 JP 20K08858, 중국 국립 자연과학 재단 (81941001 및 81770457) 일본 – 중국 연구 협력 프로그램에 따라 JSPS-CAS의 연구 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
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