脂質結合タンパク質およびアレルゲンからの内因性リガンドの除去と置換

アレルゲンデータベースの調査では、アレルゲンは全ての既知のタンパク質ファミリーの2%にしか見つからないことが明らかになっており、一般的な機能的および生物的性質がアレルゲン性¹に寄与することを示唆している。これらの特性のうち、脂質貨物を結合する能力はアレルゲンの間で強く過剰に表現されているように見えるが、これらの貨物が感作プロセス¹に影響を与える可能性があることを示唆している。実際、ブラジルナッツアレルゲンBer e1は、その完全な感作電を実現するためにその内因性脂質との共投与を必要とすることが示されている^2.これらの脂質は、MITアレルゲンDer p2およびDer p 7によって示されるように免疫系を直接刺激する可能性があり、どちらもLPS結合タンパク質^3、4、5と強い構造相同性を共有する。この観察に基づいて、Derp2とDerp7は細菌脂質を結合し、TLR4媒介シグナル伝達を介して宿主免疫系を直接刺激し、感作プロセス^5,6を促進することが提案された。また、内因性に結合した脂質が、アレルギー性タンパク質自体の生物物理学的性質を変化させる可能性もあります。例えば、Sina2(マスタード)およびArah1(ピーナッツ)とリン脂質小胞と相互作用する能力は胃および内皮分解⁷に対する耐性を有意に増強し、一方で主要な白樺花粉アレルゲンBet v 1へのリガンド結合は、内経処理の速度と得られるペプチドの多様性^を両方とも変化させた。これは特に、安定性、T細胞エピトープ生成、およびBet v 1およびBla g 1などのタンパク質のアレルゲン性との間で観察された相関関係を考えると、アレルゲン性に関連する。後者は、この作品^9、10の主題になります。

Bla g 1は、昆虫主アレルゲン(MA)タンパク質ファミリーの原型型的なメンバーを表し、異常に大きな疎水性キャビティ^9,11を囲む12の両生媒性アルファヘリックスからなるユニークな構造を有する。Bla g 1の利用可能なX線結晶構造は、結合したリン脂質または脂肪酸リガンドと一致するこの空洞内の電子密度を示す。³¹P-NMRと質量分析によって確認された推測。これらの貨物は本質的に異種であり、その組成はアレルゲン源に大きく依存しており、大腸菌およびP.パストリスで発現する組換えブラg1について異なる脂質プロファイルが観察された。不思議なことに、天然のアレルゲン源(ゴキブリのフラス)から精製されたBla g 1は、その結合部位に主に脂肪酸を含み、パルミチン酸塩、オレエー酸酸、ステアレートの混合物がその「天然」リガンド^9,11として同定された。複数の精製ステップに従って脂質および脂肪酸を保持するBla g 1の能力は、単離でタンパク質を研究する努力を妨げる。逆に、天然のパルミチン酸、ステアリン酸、および、Bla g 1のオレエー酸リガンド(それ以降はnMixと呼ばれる)がそのアレルゲン性およびネイティブ生物学的機能⁹の両方において重要な役割を果たすることが示唆されている。しかし、これらのリガンドは組換え源から得られたBla g 1には存在せず、この仮説を評価することは困難である。同様の問題は、ベットv 1^12,13のような他の脂質結合アレルゲンに対して観察されている。脂質とアレルゲン相互作用の体系的な研究を容易にするために、アレルゲンを内因的に結合した脂質を定量的に取り除き、アポ形態または特異的リガンドを装填するプロトコルを開発しました。

アレルゲンは、アフィニティークロマトグラフィーおよび/またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、自然または組み換え源から最も一般的に精製されます。ここでは、アレルゲンが脂肪酸結合タンパク質¹⁴用に開発されたプロトコルと同様の有機溶媒に溶出される逆相C18カラムを採用した、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)の形で追加の精製工程を導入する。得られたタンパク質は、次いで、脂肪酸および/またはリン脂質の存在または存在下で熱アニーリングステップを行う。天然のBla g1を回収することに加えて、高温は脂質貨物の溶解性および入手可能性を高め、所望の疎水性リガンドを均一にアポ形態または均一に装填した状態でBla g1を得る。 ³¹このように精製されたBla g 1のP-NMRスペクトルは、所望の化合物との内因的に結合したリガンドおよび均一な置換の完全な除去を確認し、環状二色は、ブラg1倍の正常な回収を確認した。この方法の有用性は、貨物結合がBla g 1のサーモスタ性およびタンパク質分解性を増強し、感作およびアレルギー性^に潜在的な影響を及ぼすT細胞エピトープ生成の運動学を変化させることが判明した最近の研究で強調されている。