Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

Evelien Van Hoeymissen; Koenraad Philippaert; Rudi Vennekens; Joris Vriens; Katharina Held

doi:10.3791/61753

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Neurosciences

Горизонтальные гиппокампа ломтики мыши мозга

Published: September 22, 2020

doi:

10.3791/61753

Evelien Van Hoeymissen^1,2, Koenraad Philippaert², Rudi Vennekens², Joris Vriens*¹, Katharina Held*^1,2

¹Laboratory of Endometrium, Endometriosis and Reproductive Medicine, Department of Development and Regeneration,KU Leuven, ²Laboratory of Ion Channel Research, VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research, Leuven, Belgium and Department of Molecular Medicine,KU Leuven

Summary

Эта статья направлена на описывать систематический протокол для получения горизонтальных ломтиков мозга гиппокампа у мышей. Цель этой методологии заключается в сохранении целостности гиппокампа волокна пути, такие как перфорантный путь и мшистый волокна тракта для оценки зубной извилины связанных неврологических процессов.

Abstract

Гиппокамп является высокоорганизованной структурой в головном мозге, которая является частью лимбической системы и участвует в формировании памяти и консолидации, а также проявление тяжелых расстройств мозга, в том числе болезни Альцгеймера и эпилепсии. Гиппокамп получает высокую степень внутри- и межсвязной связи, обеспечивая надлежащую связь с внутренними и внешними структурами мозга. Это подключение осуществляется с помощью различных информационных потоков в виде волоконных путей. Ломтики мозга являются часто используемой методологией при изучении нейрофизиологических функций гиппокампа. Гиппокамп мозга ломтики могут быть использованы для нескольких различных приложений, в том числе электрофизиологических записей, свет микроскопических измерений, а также несколько молекулярно-биологических и гистохимических методов. Таким образом, ломтики мозга представляют собой идеальную модельную систему для оценки белковых функций, для исследования патофизиологических процессов, связанных с неврологическими расстройствами, а также для целей обнаружения наркотиков.

Существует несколько различных способов подготовки ломтика. Препараты среза мозга с вибромом позволяют лучше сохранить структуру тканей и гарантировать достаточный запас кислорода во время нарезки, которые представляют преимущества по сравнению с традиционным использованием вертолета ткани. Кроме того, различные плоскости резки могут быть применены для вибромы мозга ломтик подготовки. Здесь представлен подробный протокол для успешной подготовки вибрато-отрезанных горизонтальных ломтиков гиппокампа мозга мыши. В отличие от других препаратов ломтик, горизонтальная нарезка позволяет сохранить волокна гиппокампа входной путь (перфорантный путь) в полностью нетронутом состоянии в ломтик, что облегчает исследование энторинал-гиппокампа взаимодействий. Здесь мы предоставляем тщательный протокол для вскрытия, экстракции и острой горизонтальной нарезки мозга мурина, и обсуждаем проблемы и потенциальные подводные камни этой техники. Наконец, мы покажем несколько примеров использования срезов мозга в дальнейших приложениях.

Introduction

Обширное исследование гиппокампа началось, когда Сковилл и Милнер сообщили о неспособности пациента (H.M.) сформировать новую, декларативную память после хирургического удаления гиппокампа и близлежащих височных структур доли в качестве лечения тяжелой эпилепсии¹. С этого момента, гиппокамп был изучен широко, начиная от общих свойств нейронов и функций до развития тяжелых расстройств мозга, таких как эпилепсия и болезнь Альцгеймера²^,³^,⁴^,⁵. Гиппокамп является частью лимбической системы, состоящей из группы связанных структур мозга, участвующих в эмоциях и^{формировании памяти 6,}⁷. Плотная сеть из нескольких волоконных путей достигает жесткой гиппокампа подключения к внутренним и внешним структурам мозга. Эти пути включают в себя медиальный и боковой перфораторный путь (энторинал коры для вмятины извилины, CA3 – CA1 и subiculum)⁸, мшистый путь волокна (дентат извилины CA3)⁹ и Шаффер залога / аспутной комиссариальной путь (CA3 к CA1)¹⁰ (Рисунок 1). Гиппокамп представляет собой один из наиболее широко изученных областей мозга до сих пор из-за его высоко сохраняется ламинарная организация формирования нейронального слоя, и возможность получить жизненно важные нейронные культуры и ломтики мозга с относительной легкостью⁵.

Рисунок 1: Мультфильм, иллюстрирующий различные области гиппокампа и основные пути волокна. Различные области гиппокампа обозначены сплошными цветными линиями: энториновая кора (EC; черный), зубная извилина (DG; оранжевый), Корну Аммонис (CA) 3 (циан), 2 (желтый) и 1 (пурпурный) и субикулум (зеленый). Волокно пути показаны с цветной пунктирной линии: медиальной (MPP, красный) и боковой перфорантный путь (LPP, синий) (от энторинной коры до зубной извилины, CA3, CA1 и субикулум), мшистый волоконный путь (MF, фиолетовый) (от зубной извилины до CA3) и обеспечение Шаффера (SC, коричневый) (ипсилатеральный от CA3 до CA1)/асбилитальные из-за эмиссионных путей (AC, светло-зеленый) (контратеральный от CA3 до CA1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Протоколы среза мозга часто приводят к потере связей из более отдаленных областей мозга в область интересов^5. Кроме того, капилляры больше не функционируют^{5 и} кровообращение^{лишено 11}. Несмотря на эти ограничения, ломтики мозга по-прежнему в первую очередь используются для исследования нейрофизиологических функций гиппокампа из-за ряда преимуществ. Во-первых, экстракция гиппокампа^{быстро 12} и не требует много материалов. Единственными необходимыми инструментами являются комплект для вскрытия, лабораторная водяная ванна, доступ к карбогену и вибрирующий микротом (вибром)^13. Другими активами техники среза мозга являются обход гемово-мозгового барьера (BBB) и вымывания эндогенно выпущенных молекул до начала^{эксперимента 5,}что позволяет изучать эффект препаратов с относительно точным контролем дозировки^14. Кроме того, ломтики мозга сохраняют цито-архитектуру и синаптические схемы^{в гиппокампе 15,}^16,где сохраняется нейроанатомия и местная среда с нейрональной связью и сложными нейронно-глийными^{взаимодействиями 4,}^11,^17. Кроме того, соединения гиппокампа волокна преимущественно однонаправленные и гиппокампа нейроны имеют высокую синаптической пластичности, которая чрезвычайно упрощает сбор и интерпретацию высококачественных электрофизиологических записей для того, чтобы понять^{неврологические процессы 18}^,¹⁹. Важно отметить, что срезы мозга представляют 100 ценных активов, применимых в широком спектре различных научных методов, охватывающих от молекулярно-биологических^{методов}над визуализации^{записей до электрофизиологических измерений 12,}²⁰^,²¹^,²²^,²³,²⁴^,²⁵^,²⁶.

Как описано выше, гиппокампа ломтики мозга представляют 4000 экспериментальный инструмент для изучения структурных и функциональных особенностей синаптической связи. Это дает возможность оценить влияние химических веществ или мутаций на возбудимость нейронов и пластичность^16.

Острые препараты ломтик мозга представляют довольно чувствительный метод и оптимальное качество ломтика в значительной степени зависит от идеальных экспериментальных условий, в том числе возраст животного, метод эвтаназии, скорость вскрытия и нарезки, нарезки решений и параметров (например, нарезка скорость), а также условия для^{восстановления ломтика 4}. Таким образом, хорошо продуманный протокол имеет первостепенное значение и обеспечивает воспроизводимость различных исследовательских подразделений¹³.

Здесь мы предоставляем подробный протокол для острой горизонтальной подготовки ломтик гиппокампа, с целью сохранения целостности гиппокампа боковой и медиальной перфорантной путь и мшистый путь волокна, что позволяет исследование дента извилины связанных^{процессов 9}. Мы подробно опишем ключевые шаги по вскрытию, извлечению и горизонтальному срезанию муринового мозга, за которым последуют репрезентативные результаты кальциево-микрофлюорометрических записей и полевых возбудительных постсинаптических потенциальных записей (fEPSPs) в базовых условиях и во время протоколов индукции LTP в ломтиках мозга диких мышей типа C57BL/6J.

Protocol

Все эксперименты на животных для этого исследования были одобрены комитетом по этическим обзорам КУ Левен (Бельгия) (P021/2012). 1. Приготовление раствора с высоким содержанием сахарозы и искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) До экспериментального дня Подготовка 1 л 10x ломтик предварительное решение с лабораторным классом Тип 1 воды, содержащей (в mM): 25 KCl, 20 CaCl2, 10 MgSO4, 12,5 KH2PO4 (Таблица 1). Для того, чтобы предотвратить осадки фосфатов кальция, медленно смешивать химические вещества в стакан предварительно заполнены 800 мл H2 O,постоянно помешивая с магнитным мешалка. Храните раствор при температуре 4 градусов по Цельсию или комнатной температуре (RT). В экспериментальный день Подготовка 1 l 1x ACSF с лабораторным классом Тип 1 вода, содержащая (в mM): 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgSO4, 1.252PO4, 26 NaHCO3, 25 Глюкоза (Таблица 2). Используйте осмометр давления пара для проверки осмоляности между 305-315 мО (рН 7,55-7,6).ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения осадков фосфатов кальция, медленно смешать все твердые химические вещества в стакан предварительно заполнены 800 мл H2 O,постоянно помешивая с магнитным мешалка. Добавить MgSO4 и CaCl2 в самом конце, медленно капает в нужном количестве от 1 М фондовых решений. Непрерывно пузырь 1x ACSF решение на RT с карбогеном установить рН между 7,3-7,4.ПРИМЕЧАНИЕ: Если рН немного слишком высок или слишком низок, небольших корректировок прочности карбогенации будет достаточно. Если рН выше 7,45 с карбогенацией, отрегулируйте его, добавив несколько капель раствора 1 M2PO4. Приготовьте 250 мл (на мозг) раствора с высоким содержанием сахарозы в стакане, содержащем 25 мл 10x ломтика предварительного раствора и (в mM): 252 Сахароза, 26 NaHCO3, и 10 Глюкоза (Таблица 3). Убедитесь, что осмоляность находится между 320-325 мОсм (рН 7,55-7,6). Пузырь высокой сахарозы ломтик раствора в течение 10-15 мин с карбогеном для контроля рН между 7,3-7,4.ПРИМЕЧАНИЕ: Если рН выше 7,45 с карбогенацией, отрегулируйте его, добавив несколько капель раствора 1 M KH2PO4. Храните раствор с высоким содержанием сахарозы в течение 20-30 минут в ультра-морозильнике (-80 градусов по Цельсию) до тех пор, пока он не будет частично заморожен. 2. Подготовка рабочего пространства для вскрытия мозга Во время охлаждения раствора высокой сахарозы приготовьте следующее. Разогреть водяную баню до 32 градусов по Цельсию. Заполните восстановительнуюкамеру (рисунок 2A)карбогенным раствором ACSF и поместите камеру в водяную баню. Непрерывно применять карбоген к основной бутылке ACSF и ACSF в камере восстановления. Ашер животное в экспериментальную комнату.ПРИМЕЧАНИЕ: Возраст, пол и напряжение животного должны быть определены отдельным экспериментатором и зависит от конкретного вопроса исследования. Тем не менее, параметры животного должны оставаться постоянными в рамках одного исследования, с тем чтобы гарантировать сопоставимость между различными экспериментальными днями. Этот протокол был разработан для использования C57BL/6J мышей мужского пола в возрасте 2-6 недель. Если пожилые животные будут использоваться, ломтик и восстановлениярешения, возможно,должны быть адаптированы соответствующим образом 4,27 (например, NMDGнаоснове решений 23,28) для того, чтобы сохранить здоровье мозга острых ломтиков. Подготовь анестезию. Выложить тканевую бумагу, пластиковую трубу Pasteur с широким отверстием (разрезать), 90 мм культуры блюдо, наполненное льдом, квадрат фильтровальной бумаги поверх охлажденной культуры блюдо, сильные ножницы для обезглавливания, рассечение ножницы, изогнутые типсы, шпатель, 35 мм культуры блюдо, тонкая кисть, лезвие, образец пластины (поставляется с вибром), супер клей, пипетка наконечник, четыре ремня фильтровальной бумаги (2 см х 0,5 см) (Рисунок 2A). Настройка вибромы: Во-первых, запрограммировать вибром для правильных настроек (скорость движения лезвия: 0,08 мм/с, амплитуда резки: 1,4 мм, частота резки: 85 Гц) и прикрепить карбогеновую линию в срез камеры. Затем поместите камеру ломтика в держатель, заполните держатель, окружающий срез камеры со льдом и приложите все к виброме. Наконец, поместите лезвие бритвы в держатель лезвия виброма(рисунок 2B). После замораживания раствора высокой сахарозы выполните следующие шаги. После 20-30 мин, возьмите раствор с высоким содержанием сахарозы из ультра-морозильника -80 градусов по Цельсию и держите стакан на льду. Поместите раствор высокой сахарозы рядом с вибромой на скамейке, раздавить и смешать частично замороженный раствор с шпателем, чтобы получить хороший слякоть и начать пузыриться карбогеном. Возьмите некоторые высокой сахарозы ломтик раствора с пластиковой пастер пипетки, чтобы впитать квадратную фильтровальную бумагу на вершине охлажденной 90 мм культуры блюдо. Заполните 35 мм культуры блюдо (или любой эквивалентный небольшой контейнер, который подходит для хранения всего мозга) до 75% с высоким сахарозой ломтик раствора (достаточно, чтобы покрыть весь мозг) и охладить культуру блюдо на льду хранится рядом с стаканом с остальной частью раствора. Карбогенат раствора в 35 мм культуры блюдо. 3. Рассечение и позиционирование мозга мурина Анестезировать животное с 5% изофлюран. Определите правильную глубину анестезии, ущипнув лапу. Рефлекс вывода лап не должен происходить. Перенесите животное на салфетку и обезглавите его сильными ножницами или маленькой гильотиной животного. Используйте ножницы для вскрытия, чтобы разрезать кожу головы. Разрежьте кальварию вдоль сагиттального шва и удалите ее с помощью изогнутых типсов до тех пор, пока не будет виден весь мозг, включая обонятельные луковицы.ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить мозг острыми краями кальварии или типсов. Используйте шпатель, чтобы тщательно вычерпыть мозг (обонятельные луковицы должны оставаться прикрепленными). Передача мозга в охлажденной 35 мм культуры блюдо и удалить все волосы или частицы крови из ткани, мягко мыть мозг с ACSF заполненные Пастер пипетки (кровь имеет цитотоксическое воздействие на ткани мозга29). Перенесите мозг с помощью шпателя на пропитанную фильтровальную бумагу поверх охлажденного 90-мм культурного блюда(рисунок 2A). Используйте лезвие, чтобы разрезать мозг пополам, разделяя два полушария, и поместите оба полушария на свежесрезанной медиальной стороне. Используйте лезвие для удаления спинной части (5%-10%) мозга из каждого полушария с параллельным разрезом до спинного верха(рисунок 2C)30 и поместите оба полушария на свежесрезанной стороне с брюшной частью мозга, обращенной вверх. Расположить каплю супер клея на пластине образца и правильно распределить с наконечником пипетки для размещения обоих полушарий. Используйте ремешок фильтровальной бумаги, чтобы забрать одно полушарие с капиллярных сил, касаясь брюшной стороны с фильтром бумажный ремешок, тем самым не повреждая ткани. Используйте другой ремешок фильтровальной бумаги, чтобы тщательно полусухить спинной стороне мозга, прежде чем позиционирование полушария с спинной стороны вниз на верхней части клея на пластине образца. Повторите ту же процедуру со вторым полушарием.ПРИМЕЧАНИЕ: Полушария должны быть расположены в горизонтальном выравнивании зеркально на пластине вибромы, с ростральными сторонами, указывающими на внешнюю сторону и хвостовые стороны, обращенные (но не касаясь) друг друга посередине. Медиальные стороны обоих полушарий должны указывать на вибромное лезвие и боковые стороны к экспериментатору(рисунок 2D). Поместите образец пластины в нарезке камеры и быстро, но осторожно, накрыть его ледяной высокой сахарозой ломтик раствора слякоть. Как только раствор коснется клея, он затвердеет и правильно приклеит полушария к пластине образца. Убедитесь, что полушария должным образом покрыты раствором с высоким содержанием сахарозы и подтвердите, что раствор пузыриться карбогеном.ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура вскрытия должна быть выполнена как можно быстрее. Пожалуйста, убедитесь, что мозг не остается без снабжения кислородом в течение очень долгого времени. Это должно занять всего около 1-1,5 мин от обезглавливания до погружения мозга в растворе высокой сахарозы слякоть. Это наиболее важное требование для острой подготовки ломтик мозга для того, чтобы гарантировать высокое качество ломтика. 4. Горизонтальная нарезка мозга Распоистив вибромное лезвие перед медиальной стороной полушарий и опустите его на ту же высоту, что и вентральные стороны полушарий, которые в настоящее время обращены вверх. Опустите лезвие с помощью вибромного управления до 600 мкм дальше в спинном направлении и начните нарезку. Лезвие должно попасть в ткань (если нет, обратить лезвие и опустить его немного больше). Нарежьте до тех пор, пока первые два ломтика полностью не будут отделены от двух полушарий. Обратный лезвие и опустите еще 300 мкм и нарежьте снова. Когда гиппокамп становится видимым (используйтемышь 31 атлас мозга для помощи, при необходимости) (Рисунок 2E) собирать ломтики с расширенным пластиковым пипеткой Пастера. Соберите ломтики, пока caudate putamen становится видимым рядом с гиппокампом. Как правило, для мозга мыши можно собрать от 8 до 12 ломтиков по 300 мкм (4-6 в полушарии). Используйте пластиковую пипетку Pasteur, чтобы собрать ломтики и передать их в камеру восстановления в водяной бане(рисунок 2F) (собрать ломтики после каждого раунда нарезки, чтобы предотвратить их от плавающей вокруг в срез камеры).ПРИМЕЧАНИЕ: Работа как можно быстрее и убедитесь, что раствор с высоким содержанием сахарозы является холодным и карбогенным в течение всей процедуры. При необходимости заправьте лед, окружающий срез камеры. 5. Восстановление ломтиков мозга для электрофизиологических записей Оставьте ломтики в заполненной ACSF восстановительной камере в водяной бане 32 градусов по Цельсию на 1 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановление камеры также коммерчески доступны. Вывихи восстановительную камеру из водяной бани. Поместите ломтики на RT, по крайней мере еще 30 минут для восстановления, прежде чем начать дальнейшее применение. 6. записи fEPSP в медиальной перфорантной траектории (MPP) гиппокампа Вытяните записывающие пипетки из борозиликатных стеклянных капилляров с горизонтальным пипетным шкивом для получения пипеток размером с 2 млн евро при заполнении раствором ACSF и погружении в заполненную ACSF камеру записи. Заполните раствор ванны ACSF и раствор ACSF, содержащий соответствующие химические вещества (например, бикукуллин) в управляемой гравитацией многоствольной системе перфузии, которая подключена к камере записи. Непрерывно карбогенат все решения. Включите перистальтический или вакуумный насос, который подключен к всасывающей трубе, которая заканчивается напротив линии перфузии в камере записи. Откройте заполненный ACSF баррель и начните устанавливать непрерывный поток (1-2 капли в секунду). Убедитесь, что эталонный электрод погружен в решение ACSF. Включите компьютер установки, усилитель, микроманипулятор, стимулятор, микроскоп света (ы), камеры и монитора (если это применимо). Откройте соответствующее программное обеспечение для электрофизиологических записей (существует несколько различных поставщиков оборудования и программного обеспечения для электрофизиологического оборудования). Перенесите одно полушарие ломтика мозга из восстановительной камеры в камеру записи установки среза и распоставьте его в правильной ориентации с слоем гранул извилины и молекулярным слоем в поле зрения. Убедитесь, что электроде стимуляции может достичь MPP в ломтик со стороны энторинной коры и что записывающий электрод имеет доступ к MPP с прямо противоположной стороны со стороны CA3. Стабилизуя срез в камере записи с помощью бумажнойзажима (рисунок 3A)или коммерчески доступной сетки среза мозга.ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть полезно, чтобы выключить перфузии во время передачи ломтика и позиционирования. Тем не менее, это не должно занять слишком много времени, чтобы гарантировать качество мозга ломтик. Нижняя и положение записи и стимуляции электродов в MPP в нижней трети молекулярного слоя близко к грануле клеточного слоя(рисунок 3B), лицом друг к другу на расстоянии примерно 100-150 мкм. Электрод стимуляции должен минимально контактировать с поверхностью, в то время как записывающий электрод должен слегка проникать в верхний слой ломтика. Примените стимул низкой интенсивности (30-50 ЗА на 0,1 мс) к срезу мозга, чтобы получить сигнал FEPSP. При необходимости адаптируем положение электродов (например, сигнал с низкой или нетипичной формой fEPSP). Начало записи входных кривых: применять увеличение интенсивности стимула к срезу мозга с интервалом в 30 с. Установите интенсивность стимула до 50% от максимальной реакции fEPSP и начните базовые записи fEPSP применяя интенсивность стимула 50% для 20-40 min в интервалах 30 s к ломтику мозга. Если базовый уровень представляется стабильным, продолжайте делать дополнительные записи (например, протоколы LTP/LTD и/или заявки на наркотики). (Для индукции LTP в MPP, здесь был использован протокол, состоящий из четырех раз 1 s 100 Гц импульсов, применяемых в интервале 5 мин. Бикукуллин применялся за 10 минут до и во время фазы кондиционирования.)ПРИМЕЧАНИЕ: Все записи должны быть выполнены в текущем режиме зажима с соответствующей низкой проходимой фильтрации (Lt;5 кГц) и частоты выборки (nogt;10 кГц). Извлекайте данные в соответствующем формате файла и анализируйте параметры fEPSP, такие как залп волокна, амплитуда fEPSP и наклон fEPSP. 7. Записи изображений кальция ломтиков мозга Перенесите один ломтик мозга в 12-колодец камеры и загрузить его в течение 30 минут до 1 ч с соответствующим красителем кальция. Непрерывно карбогенат погрузочного раствора путем вставки карбогенации трубки через самодельные отверстия (с горячей иглой 18G) в крышке 12-хорошо пластины.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является необходимым в случае мозга ломтик препаратов от генетически модифицированных животных, которые эндогенно выразить флуоресцентные репортер, таких как GCaMP. Подготовь настройку записи, описанную шагами 6.2-6.5.ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов с микрофлюориметрической визуализацией не требуется усилитель или микроманипулятор. Использование стимулятора зависит от эксперимента. Важное значение имеет конкретное программное обеспечение для экспериментов по визуализации флуоресценции. Отрегулируйте программное обеспечение под правильные настройки изображения: это включает в себя усилитель камеры и настройки binning, настройка длины волны, время экспозиции, и протокол времени. Настройки могут варьироваться в зависимости от точных экспериментов. (Для примера следы, 1 х 1 binning, 2,4x до усилителя усиления, 300 EM камеры усиления, воздействие 50 мс на 488 нм повторяется каждые 500 мс в течение всего эксперимента был использован.) После загрузки с красителем кальция, передача полушария ломтик мозга из 12-хорошо в камеру записи и расположения его на стадии микроскопа. Стабилизуем срез в камере записи с помощью зажима(рисунок 3A)или коммерчески доступной сетки среза мозга, аналогичной описанной в шаге 6.7. Убедитесь, что область интереса находится в правильном микроскопическом поле и в фокусе. Используйте программное обеспечение для визуализации флуоресценции, чтобы выбрать несколько областей интереса (ROIs) на вашем ломтике.ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть полезно, чтобы выбрать все поле зрения, чтобы следить за общими колебаниями яркости, из-за фотоотливания. Запустите запись и примените экспериментальные тест-препараты в выбранные моменты времени.ПРИМЕЧАНИЕ: Целесообразно применять высокое решениеK и в конце каждого эксперимента, чтобы проверить нейронный характер клеток и качество ломтика. Извлекайте данные в соответствующем формате файла и проанализируйте изменения сигнала флуоресценции, которые происходят в ИП на протяжении всего измерения. ROIs также могут быть адаптированы во время офф-лайн анализа.ПРИМЕЧАНИЕ: Другие протоколы, которые описывают записи fEPSP и микрофториметрии кальция всрезах мозга доступны в литературе 24,32,33,34,35.

Representative Results

Общий обзор инструментов и критических шагов, необходимых для протоколаНа рисунке 2 представлены все необходимые инструменты и критические шаги для подготовки горизонтальных острых ломтиков мозга гиппокампа, описанных в этом протоколе. Как правило, требуется ограниченное количество ключевых инструментов, в том числе несколько инструментов для вскрытия и камера восстановления ломтика(рисунок 2A),лабораторная водяная ванна и виброма(рисунок 2B). Рисунок 2C-E визуализировать важные шаги и ориентации мозга и полушарий во время протокола подготовки ломтика. Рисунок 2F является иллюстрацией ожидаемого результата горизонтальных ломтиков мозга. записи fEPSP в медиальной перфорантной траекторииПосле восстановительного периода, ломтики мозга могут быть использованы для электрофизиологических записей FEPSPs. Здесь мы использовали вертикальный микроскоп, оснащенный многоканайной гравитационно-управляемой системой перфузии(рисунок 3A и рисунок 3B). Стеклянный микропипют (No 2 МЗ) был заполнен раствором ACSF и прикреплен поверх хлористого серебряного электрода, который крепится к рабочему усилителю в цепи с хлорированным электродом ванны. fEPSPs были записаны и визуализированы с усилителем и соответствующим программным обеспечением записи, вставив стеклянный микропипют в MPP гиппокампа в верхнем слое мозга ломтик. fEPSPs были вызваны стимуляцией с 2-контактным кластерным микроэлектродом, применяя различные интенсивности тока к MPP вверх по течению записывающего электрода. Обратите внимание, что этот протокол не предназначен для объяснения того, как получить записи MPP, а просто использует записи в MPP в качестве примера, чтобы продемонстрировать успех протокола подготовки фрагмента, описанного здесь. Если кто-то пытается выполнить записи MPP, определенные элементы управления (например, парные записи импульса) могут быть необходимы для того, чтобы обеспечить надлежащий сайт записи и отличить MPP от LPP8,36,37. Рисунок 3C иллюстрирует отрицательный (левая панель, низкое качество ломтик) и положительный (правая панель, высокое качество ломтик) пример записи fEPSP. Отрицательный пример след показывает большой залп волокна (FV) амплитуда, которая даже выше, чем фактическая амплитуда fEPSP (≈0,5 мВ). В отличие от этого, высококачественный пример среза (правая панель) показывает небольшое соотношение FV к fEPSP и высокую амплитуду fEPSP (0,5 мВ). Волокно залп сигнал, который происходит при деполяризации стимулировали нейрональных волокон и, следовательно, предшествует постсинаптической потенции (fEPSP). Отношение FV к свойствам fEPSP дает важную информацию о сохранении аксональных и синаптических свойств. Высококачественные ломтики с нетронутыми нервными волокнами должны показывать высокую амплитуду fEPSP к соотношению FV. Напротив, низкое качество ломтиков с нарушениями свойств проводимости будет иметь снижение FEPSP к FV отношение. Аналогичным образом, жизнеспособность ломтик мозга могут быть проанализированы путем построения fEPSP склоны по сравнению с волокна залп амплитуды(рисунок 3D). Кроме того, для определения качества среза стандартно используются кривые ввода-вывода (наклон fEPSP и амплитуда FV над интенсивностью стимула). Такие кривые получаются путем применения увеличения текущих стимулов к срезу мозга и путем мониторинга последующих ответов fEPSP. Низкое качество ломтиков мозга показывают снижение ввода-выход кривой из-за неоптимальных свойств проводимости плохо сохранившейся ткани мозга(рисунок 3E,F). Кроме того, кривые ввода и вывода необходимы для определения идеального диапазона интенсивности стимуляции для исследования синаптических процессов. В идеале, интенсивность стимула должна быть установлена около 50% интенсивности для максимальных ответов. При выбранной интенсивности стимулов ответы fEPSP очень чувствительны к любым изменениям в синаптической пластичности, что дает возможность исследовать как долгосрочную потенцию (LTP), так и долгосрочную депрессию (LTD). Для того, чтобы изучить синаптической пластичности, синаптической передачи мозга ломтик (fEPSP наклона) на выбранном 50% интенсивность стимула контролируется в течение более длительного периода времени (как правило, между 20-40 мин) до кондиционирования фазы. Жизнеспособные ломтики мозга будут иметь стабильные базовые линии, в то время как ломтики мозга с нестабильным базовым не могут быть использованы для дальнейших протоколов кондиционирования для изучения синаптической пластичности схем мозга(рисунок 3G, верхняя панель). базовые записи fEPSP также могут быть полезны для того, чтобы контролировать воздействие препарата на синаптической передачи себя(рисунок 3G, нижняя панель). Среднее количество зарегистрированных базовых сигналов fEPSP обычно используется для нормализации курса времени fEPSP и стандартно устанавливается на уровне 100%. Синаптическая пластичность может быть изучена путем применения конкретных протоколов кондиционирования к ломтикам мозга. Эти протоколы зависят от исследуемой схемы мозга и механизма интереса (например, LTP или LTD). Для того, чтобы вызвать LTP в MPP из зубной извилины, сильный протокол кондиционирования необходимо из-за сильного ГАМК ингибирования, который присутствует на MPP синапсы38. Сообщается, что ГАМК-ингибирование еще более выражено в ломтиках мозга, приготовленных с высокой сахарозой нарезки решений39. Здесь мы используем протокол, состоящий из четырех стимуляций 1 с длинными 100 Гц импульсов применяется в 5 мин интервал во время лечения срецептором антагониста ГАМК рецептора Bicuculline (Рисунок 3H). Совместное добавление NMDA и Bicuculline в период кондиционирования приводит к увеличению LTP (Рисунок 3H). Низкое качество среза и нестабильная синаптическая передача (базовый уровень FEPSP) могут привести к изменению или неудачной индукции LTP и LTD. Таким образом, важно работать с высококачественными препаратами ломтика и использовать строгие критерии исключения (низкая амплитуда fEPSP к соотношению залпового волокна (lt;3), небольшой наклон fEPSP (lt;0.5 mV/ms) или амплитуду (lt;0.5 mV) и нестабильную базовую линию fEPSP (изменение более чем на 5%) для неприкосновенных срезов при расследовании синаптических процессов. Микрофториметрические измерения кальция в слое гранулных клеток извилиныПосле выздоровления, ломтик мозга был инкубирован при комнатной температуре с 2 МКМ кальция чувствительных красителя в течение 1 ч в карбогенированных ASCF, защищены от света. Срез был передан в камеру записи (рисунок3A) на вертикальном флуоресцентном микроскопе, оснащенном многоканальной гравитационно-управляемой системой перфузии. Изображения флуоресценции были получены каждые 500 миллисекунд после освещения на 488нм (рисунок 4A,B). Возбуждение было сделано с ксеноновой лампой и сканером, установленным монохроматором дифракционной решетки, и приобретение изображения было выполнено с помощью управляемой компьютером камеры CCD. Во время измерений, ломтик был обработан с NMDA рецептор антагонист APV, что привело к снижению внутриклеточной концентрации кальция. Стимуляция ломтика внеклеточным раствором, содержащим высокую концентрацию калия (50 мМ), привела к массовому притоку внеклеточного кальция из-за деполяризации нейронов и открытия ионных каналов с напряжением(рисунок 4C). соединение Концентрация (mM) Молекулярный вес (г/мол) Сумма (г) KCl 25 74.55 1.86 CaCl2 и 2H2O 20 147.01 2.94 MgSO4 и 7H2O 10 246.48 2.46 KH2PO4 12.5 136.08 1.7 Таблица 1: 10 x ломтик предварительного решения (1 л). соединение Концентрация (mM) Молекулярный вес (г/мол) Сумма (г) NaCl 125 58.44 7.3 KCl 2.5 74.55 0.19 CaCl2 и 2H2O 2 от решения 1 M CaCl2 2 мл MgSO4 и 7H2O 1 от 1 M MgSO4 решение 1 мл 2PO4 и 2H2O 1.25 156.02 0.2 НаХКО3 26 84.01 2.18 Глюкоза NoH 2O 25 198.17 4.95 Таблица 2: 1x ACSF (1 l) (осмолярность между 305-315 mOsm). соединение Концентрация (mM) Молекулярный вес (г/мол) Сумма (г) 10x ломтик presolution N/A N/A 25 мл сахароза 252 342.3 21.57 НаХКО3 26 84.01 0.55 Глюкоза NoH 2O 10 198.17 0.49 Таблица 3: 1x раствор с высокой сахарозой (250 мл) (осмоляность между 320-325 мОсм). Рисунок 2: Подробная информация о подготовке горизонтальных ломтиков мозга гиппокампа. a)изображение инструментов, необходимых для вскрытия и нарезки мозга грызунов: а) ±2 см в длину и ±0,5 см в ширину ремней фильтровальной бумаги (например, класс 413); b) лезвие; c) суперклей; d) наконечник пипетки; e) пластина образца (поставляется с вибромой); f) 35 мм культурное блюдо; g) тонкая кисть; h) шпатель; i) изогнутые типсы; j) ножницы для вскрытия; k) сильные ножницы (длина лезвия выше 10 см); l) пластиковая пипетка Pasteur с широким отверстием (от 0,6 до 0,8 см в диаметре); м) восстановительная камера (самодельная с стаканом 250 мл, пластиковое кольцо, нейлоновая сетка, кусок серологического пипетки 10 мл); n) 90 мм культурная тарелка, наполненная льдом и (о) квадратом фильтровальной бумаги поверх охлажденного блюда культуры. (B)Изображение вибромы с а) держателем нарезанной камеры, наполненной льдом; b) срез камеры; c) карбогенная линия и d) нарезка лезвия бритвы. C)Мультфильм, иллюстрирующий ориентацию разреза спинной стороны одного полушария, чтобы подготовить мозг к горизонтальной нарезке (см. шаг 3.9). (D)Изометрическая проекция мозговой ориентации на образцовой пластине вибромы. (E)Мультфильм, иллюстрирующий вид сверху положения двух полушарий на пластине образца. (F)Мультфильм, показывающий положение гиппокампа в горизонтальном срезе мозга. Показаны зубные извилины (DG) и Cornu Ammonis (CA)-Subiculum (SB) областей гиппокампа. (G)Изображение восстановительной камеры с карбогенированным ACSF, содержащим десять свеженарезанные горизонтальные ломтики мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Электрофизиологические записи ломтиков мозга гиппокампа. (A)Изображение камеры записи с перфузией и всасыванием, используемой под вертикальным микроскопом. Кусочек мозга будет помещен в камеру и обездвижен кложки перед началом записи. (B)Яркий полевой снимок ломтика мозга гиппокампа под вертикальным микроскопом (10x цель). Показаны зубная извилина (DG) и область CA3, а также стимуляция (внизу слева) и записывающие (внизу справа) электроды, нацеленные на медиальный перфорантный путь во время записей fEPSP. (C) Слева: представление низкого качества ломтик пример записи fEPSP с надежной залп волокна и небольшой амплитуды. Справа: пример высококачественного среза записи fEPSP. Серая линия указывает базовый уровень. Пунктирные линии указывают на амплитуду выреза 0,5 мВ. (D)Участок наклона fEPSP по сравнению с Амплитудой FV для высокого качества (черный; n’10) и низкого качества ломтиков мозга (серый; n’4). Данные, представленные как среднее ± SEM.(E) Входно-выходной участок (наклон fEPSP) для различных интенсивностей стимуляции (ЗА) для высококачественных ломтиков (черный; n No 10) и низкого качества ломтиков (серый; n No 4)). (F) То же самое,как в( E ), но и для Амплитуд FV по сравнению с стимулом интенсивности. (G)Курс времени трех различных базовых записей fEPSP (наклон fEPSP в %; нормализованный до среднего наклона fEPSP первых 5 минут). Верхняя панель представляет собой положительный (черный) и отрицательный (красный) пример, где последний имеет нестабильную базовую линию из-за бездействия карбогена во время записи. Нижняя панель показывает две стабильные базовые записи в лечении (после 20 мин стабильного базового уровня, рецепторы АМРА были заблокированы применением антагониста рецепторов АМРА DN’X (10 МКМ)) (синий) и необработанные условия (черный). (H)Время курса записей LTP для различных условий лечения (показано в нижней панели). Черный цвет для применения бикукуллина (20 МКМ) во время кондиционирования и синий для совместного применения бикукуллина (20 МКМ) и NMDA (10 МКМ) во время кондиционирования. Стрелки в верхней панели указывают точки времени, где была применена высокочастотная стимуляция (4 x 1s 100 Гц). График бара в нижней панели представляет средние склоны fEPSP (%) в течение 50-60 минут после индукции LTP экспериментов, показанных в верхней панели (единая репрезентативная запись для каждого состояния). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: Кальций-микрофториметрия ломтиков мозга гиппокампа. (A и B) Флуоресценция изображения (возбужденный на 488нм)( A ) и соответствующаякарта тепла( B ) горизонтального гиппокампа мозга ломтик мозга мыши. Зубчатая извилина (DG), регион CA3, и пример области интереса (ROI) показаны в панели A. (C) Время курса реакций кальция (F488 nm) от рентабельности инвестиций в зубчатой извилины острого ломтика мозга гиппокампа во время лечения с антагонистом nmDA рецептора APV (50 МКМ) и раствор, содержащий высокий внеклеточный калий(K)(K) ( След нормализуется до наивысшего количества кальция во времявысокой перфузии K и является базовым исправленным для фотоотвержения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Хотя широко используется среди неврологии сообщества, мозга ломтик препаратов также сталкиваются с несколькими недостатками. Например, входные и выходные соединения с областями мозга, представляющими интерес, больше не связаны в срезе мозга. Кроме того, после изоляции, ткань начинает медленно деградировать с течением времени, и этот процесс может изменить физиологические условия мозга ломтик. Эта тема, в частности, очень относительно, потому что большинство записей ломтик мозга принимают от нескольких минут до часов, что приводит к долгим экспериментальным дней с записями, выполненными на ткани, которая была изолирована до 6-8 ч до начала эксперимента. Кроме того, спинномозговая жидкость и кровообращение прерываются во время срезных препаратов, что может привести к отсутствию важных эндогенных соединений в ломтике мозга. И, самое очевидное, сама процедура нарезки может привести к повреждению механической ткани, что может поставить под угрозу полученные результаты. Тем не менее, фактические преимущества препаратов ломтик мозга по-прежнему перевешивают свои недостатки, поэтому они представляют такие высоко ценится и используется техника в неврологии исследований.

Острые ломтики мозга гиппокампа представляют собой мощную и, следовательно, широко используемую технику для исследования нейронных процессов от молекулярного уровня до сложных исследований цепи мозга. Это основано на идеальной нейроанатомии гиппокампа, которые могут быть легко сохранены в срез^{подготовки 18}. Следовательно, гиппокампа ломтики мозга используются в самых разнообразных научно-исследовательских проектов,^{в том числе скрининга наркотиков 17}, исследования нейрональных и синаптических свойств, участвующих в^{когнитивных функций 40}^,⁴¹, и исследования патологических состояний мозга¹⁴^,⁴²^,⁴³. Тем не менее, широкий спектр различных приложений также вызывает широкий спектр доступных протоколов подготовки фрагментов, которые могут отличаться по различным параметрам, таким как условия вскрытия и резки плоскости ориентации, среди других. Поэтому для выбора соответствующего протокола подготовки срезов необходимо определить точный исследовательский вопрос научного проекта.

Ткань измельчитель представляет собой один из старейших используемых методов для того, чтобы подготовить гиппокампа^{ломтики мозга 44}^,⁴⁵. Основные преимущества этого метода подготовки включают низкую стоимость вертолета и быстрое и легкое использование^46. Тем не менее, тканевых измельчителя вызывают механический стресс, что приводит к морфологическим изменениям и гибели^{клеток 47}. Для сравнения, вибром является довольно дорогой машиной и время для подготовки ломтик значительно увеличивается, которые могут повлиять на качество ломтика. Тем не менее, вибром обычно предлагает более мягкий способ отделения ломтиков от ткани и позволяет сохранить мозг красиво охлаждается и насыщен кислородом в течение всей процедуры изоляции, тем самым улучшая свойства^{ломтика 46}. Таким образом, несколько групп стандартно используют эту технику и выдвинули протоколы для подготовки острых ломтиков мозга гиппокампа с помощью^{виброма 16,}^30,⁴⁸. В то время как некоторые протоколы предоставляют лишь некоторые детали для нарезки себя, а сосредоточиться на конкретном применении такого среза^{подготовки 48}, другие предоставляют подробные протоколы ломтик, которые отличаются в резки плоскости или других деталей протокола (например, агароза встраивания или ломтик / восстановления решений), данных^{в этой статье 27}^,³⁰.

Протокол, описанный здесь представляет собой простой метод для того, чтобы подготовить высокое качество острой горизонтальной гиппокампа мыши ломтики мозга от молодых животных. Протокол особенно полезен для сохранения перфораторного пути (медиальный и боковой), который представляет путь ввода гиппокампа, который проецирует от энторинальной коры к^{гиппокампу 8,}⁴⁹^,⁵⁰. Стрельцы, корональные, а также изолированные препараты поперечного среза гиппокампа не сохраняют должным образом перфораторный путь, который происходит в основном из слоев II и V энторинной коры и проектов в нескольких областях в пределах^{гиппокампа 18}. Из-за анатомического позиционирования энторинной коры по отношению к гиппокампу, горизонтальные ломтики мозга являются необходимостью для того, чтобы поддерживать полностью нетронутыми перфораторные волокна пути в рамках подготовки^{ломтика 31}. Кроме того, горизонтальная нарезка идеально сохраняет мшистые волокна, которые проецируются от зубной извилины до нейронов CA3 в^{гиппокампе 9,}^30,^50. Таким образом, этот метод подготовки имеет высокую ценность для исследований, которые исследуют пути ввода гиппокампа и процессы, связанные с ГД. Кроме того, этот протокол позволяет расследование Шаффер залоговый путь⁵⁰. Тем не менее, sagittal и корональный мозг ломтик подготовки чаще используются при расследовании CA3 CA1 волокна прогнозы, по-видимому, из-за их немного быстрее время подготовки, которые могут увеличить вероятность получения высококачественных ломтиков. Тем не менее, горизонтальные препараты гиппокампа ломтик настоящее мощный инструмент исследования, поскольку она позволяет сохранение и исследование всех гиппокампа волокна пути в пределах одного ломтика полушария. Это может быть особенно полезно при изучении реакций цепи, например, в много электродных записях анализа.

Основной проблемой при подготовке ломтиков мозга является надлежащее сохранение ткани мозга. Это достигается несколькими важными шагами в нашем протоколе, включая быстрое вскрытие, непрерывную и достаточную оксигенацию и охлаждение ткани, а также защиту тканей мозга с помощью защитного метода резки с низким содержанием натрия, высокой сахарозой,^{нарезая раствор 39}^,⁵¹. Несмотря на то, что описанный здесь протокол дает успех около 90%, потенциально дополнительные защитные шаги могут потребоваться при работе с тканями, полученными от старых или генетически разнообразных животных или при попытке сохранить определенную популяцию клеток. Несколько методов уже сообщалось для защиты чувствительных препаратов ткани мозга. Эти методы включают в себя использование NMDG основе нарезки решений для снижения пронизывания^{натрия 52}, использование высоких уровней магния в нарезке раствора для того, чтобы блокировать активность nmDA^{рецепторов 53}, и длительное использование защитных растворов также в период^{восстановления 23}. Все эти меры приведут к снижению excitotoxicity. Кроме того, транскардиальная перфузия с ледяными защитными решениями ACSF часто используется и необходима при работе со старшими животными²⁷.

Острые ломтики мозга гиппокампа идеально подходят и широко используются для электрофизиологических исследований по таким причинам, как высокая амплитуда сигналы, которые могут быть получены из относительно толстых (300-500 мкм) острый срез мозга, который гарантирует высокий сигнал^{к шуму соотношение 11}. Стандартно используемые электрофизиологические приложения включают внеклеточные полевые записи и внутриклеточные записи в режиме напряжения или тока. Для того, чтобы получить высококачественные электрофизиологические данные, срез здоровья имеет первое значение и может быть гарантировано строго следуя представленного протокола. Однако, поскольку срезовые препараты представляют емкий метод, перед началом каждого эксперимента необходимо регулярно включить проверку качества. Несколько параметров могут быть использованы в качестве проверки качества среза и стандартно оцениваются с помощью кривых ввода-выхода и базовых записей fEPSP или EPSC¹⁹. Тем не менее, следует отметить, что неоптимальные электрофизиологические свойства могут возникнуть в результате экспериментальных ошибок, таких как позиционирование электродов, ориентация или даже повреждение и не только представляют здоровье подготовленного ломтика. Поэтому рекомендуется выполнять дополнительные элементы контроля качества, такие как простая визуализация и оценка клеток под 40-й целью или окрашивание ядра DAPI. Такие проверки качества могут быть использованы для подтверждения постоянного здоровья ломтик в течение нескольких сеансов подготовки ломтик.

Микрофториметрия кальция представляет собой менее часто используемый метод для изучения ломтиков мозга гиппокампа. Тем не менее, этот метод имеет дополнительное значение для стандартных внеклеточных и внутриклеточных записей электродов, так как он позволяет визуализировать и количественно внутриклеточных потоков кальция, которые имеют большое значение в нейронной и синаптической сигнализации. Изменения в внутриклеточных концентрациях кальция участвуют в высвобождении нейромедиатора пузырьков, постсинаптической потенциальной генерации, регуляции синаптической пластичности^{и аксональной нервной проводимости 54,}^55,^56. В качестве иллюстрации этого метода(рисунок 4),мы использовали коммерчески доступный краситель кальция. Бесспорно, лечение ломтиками тканей с красителями кальция может выдать такие трудности, как увеличение экспериментальных сроков, а также неэффективная загрузка нижних расположенных нейронных клеток. Однако для обхода этих технических проблем можно было бы использовать вариации в этом методе. Например, можно сочетать измерения кальция и записи зажима патча в ломтиках гиппокампа. Таким образом, флуоресцентный краситель кальция может быть загружен в конкретную клетку через патч пипетки, что позволяет измерения динамики кальция в одной конкретной клетке^{интереса 57}. Кроме того, генетически модифицированных животных, выражаюющих кальций индикатор, GCaMP⁵⁸, либо во всем мозге, или управляется клеточной конкретных промоутер, могут быть использованы. Интересно, что ткани мозга от GCaMP животных с прямым связующим звеном с интересом белка может предоставить возможность для определения модели выражения нейронов или исследовать участие в искр кальция и волн.

В общей сложности, мы предоставляем руководящие принципы для успешной подготовки здоровых и жизнеспособных горизонтальных ломтиков мозга гиппокампа от мышей для электрофизиологических и изображений записей. Эта методология очень полезна для доступа к неврологическим изменениям, которые происходят в патологиях мозга, которые описаны в зубной извилины.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим электрофизиологическое отделение Центра исследований мозга и болезней VIB-KU Leuven под руководством д-ра Кеймпе Вирды и профессора д-ра Джориса Де Вит за использование их научно-исследовательских объектов. Кроме того, мы благодарим всех членов Лаборатории исследований ионных каналов и лаборатории эндометрия, эндометриоза и репродуктивной медицины в KU Leuven за их полезные обсуждения и комментарии.

Этот проект получил финансирование от Научно-исследовательского фонда-Фландрии (G.084515N и G.0B1819N до J.V.) и Научно-исследовательского совета КУ Левен (C1-финансирование C14/18/106 к J.V.). К.П. является стипендиатом ФВО^{«ПЕГАС» 2} Мари Склодовской-Кюри и получила финансирование от научно-исследовательской и инновационной программы Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения Мари Склодовска-Кюри (665501) с Исследовательским фондом Фландрии (FWO) (12T0317N). К.Х. является докторантом Научно-исследовательского фонда Фландрии, Бельгия (12U7918N).

Materials

Anesthesia chamber	home made – Generic	N/A	plexiglas
Anesthesia vaporizer	Dräger & MSS International Ltd	Isoflurane Vapor 19.3 & MSS Isoflurane	to vaporize isoflurane for rodent anesthetization
Barrels for the perfusion system	TERUMO	Hypodermic syringes without needle	https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html
Bicuculline methiodide	hellobio	HB0893	https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html
Borosilcate glass capillaries	Science Products	GB150F-8P	https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished
Calcium chlorid dihydrate	Merck	102382	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Calcium Imaging software	Till Photonics	LiveAcquisition v2.3.0.18
Carbogen tank	Air Liquide	Alphagaz mix B50	Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5
Cluster microelectrode	FHC	CE2C55	https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/
Culture dish (35 mm)	Corning Life Sciences	353001	https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-Cell-Culture-Dishes/p/353001
Culture dish (90 mm)	Thermo Fisher Scientific	101VR20	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20
Curved forceps	Fine Science tools	11270-20	https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20
D-AP5	hellobio	HB0225	https://www.hellobio.com/dap5.html
D-(+)-Glucose monohydrate	Sigma Aldrich	16301	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en&region=BE
Digital CMOS camera	HAMAMATSU	ORCA-spark C11440-36U	https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html
Dissection scissors	Fine Science tools	14058-09	https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut®/14058-09
DNQX	hellobio	HB0262	https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html
EMCCD camera	Andor	iXon TM + DU-897E-CSO-#BV	https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE
EPC10 USB Double Patch Clamp Amplifier	HEKA Elektronik	895278	https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf
Filter paper	VWR	516-0818	grade 413
Fine brush	Raphael Kaerell	8204	Size #1
18G needle	Henke Sass Wolf Fine-Ject	18G X 1 1/2" 4710012040	https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/
Isoflurane	Dechra Veterinary Products	Iso-Vet 1000mg/g	250 ml bottle
Loctite 406	Henkel Adhesive technologies	Loctite 406	Super glue
Magnesium sulfate heptahydrate	Merck	105886	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Micromanipulator	Luigs & Neumann	SM-10 with SM-7 remote control system	https://www.luigs-neumann.org
Microscope (for calcium imaging)	Olympus	BX51WI	https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/
Microscope (for ephys recordings)	Zeiss	Axio Examiner.A1	https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/
Microscope light source	CAIRN Research	dual OptoLed power supply	https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/
Monochromator	Till Photonics	Polychrome V
N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA)	Sigma Aldrich	M3262	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en&region=BE
Oregon Green® 488 BAPTA-1	Invitrogen Molecular Probes	#06807	10x50ug
Osmometer	Wescor	5500 vapor pressure osmometer	to verify osmolarity of salt solutions
Peristaltic pump	Thermo Fisher Scientific	Masterflex C/L 77120-62	https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229
pH meter	WTW	inoLab series pH 720	https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf
Pipette puller	Sutter Instrument	P-1000	https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html
Potassium chlorid	Chem-lab	CL00.1133	https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	104873	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Razor blade to prepare hemispheres	SPI supplies	Safety Cartridge Dispenser – Pkg/10	GEM Scientific Single Edge Razor Blades
Razor blade for vibratome	Ted Pella Inc	121-6	double edge breakable style razor blades (PTFE-coated stainless steel)
Recovery chamber	home made – Generic	N/A	to collect and store brain slices in (see details in manuscript)
Scissors	Any company	N/A	Blade should be well sharpened and at least 15 cm long for easy decapitation
Silver electrode wire	Any company		for recording and reference electrodes
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Merck	106342	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Sodium hydrogen carbonate	Alfa Aesar	14707	https://www.alfa.com/en/catalog/014707/
Sodium chlorid	Fisher Scientific	S/3160/60	https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420
Software for field recordings	HEKA Elektronik	PatchMaster	https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf
Spatula	Sigma Aldrich	S9147-12EA	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en&region=BE
Stimulator	A.M.P.I	ISO-FLEX	http://www.ampi.co.il/isoflex.html
Sucrose	VWR International Ltd.	102745C	https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 1	Warner Instruments	64-0167	Tygon tubing (TY-50) for standard valve systems
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 2	Fisher Scientific	800/100/200 & 800/100/280	Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE Tubing
Vacuum pump	home made – Generic	N/A
8 valve multi-barrel perfusion system	home made	N/A	consists of barrels, tubing and a self-made automated valve control (specifications of all purchased parts can be found in this Table)
Magnetic valves (to control the perfusion lines)	NResearch Inc.	p/n 161P011	https://nresearch.com/
Vibratome	Leica	14912000001	Semi-automatic vibrating blade microomei VT1200
Water bath	Memmert	WNB 7	https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf
Water purification system	Merck	Synergy millipore	to obtain highly purified water
12-well plates	Greiner Bio-One	CELLSTAR, 665180	http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf

References

Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).
Cavarsan, C. F., Malheiros, J., Hamani, C., Najm, I., Covolan, L. Is mossy fiber sprouting a potential therapeutic target for epilepsy. Frontiers in Neurology. 9, 1023 (2018).
Nadler, J. V. The recurrent mossy fiber pathway of the epileptic brain. Neurochemical Research. 28 (11), 1649-1658 (2003).
Raimondo, J. V., et al. Methodological standards for in vitro models of epilepsy and epileptic seizures. A TASK1-WG4 report of the AES/ILAE translational task force of the ILAE. Epilepsia. 58, 40-52 (2017).
Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurosciences. , 86-98 (2015).
Tohno, Y., et al. Relationships among the hippocampus, dentate gyrus, mammillary body, fornix, and anterior commissure from a viewpoint of elements. Biological Trace Element Research. 140 (1), 35-52 (2011).
Maclean, P. D. The limbic system and its hippocampal formation; studies in animals and their possible application to man. Journal of Neurosurgery. 11 (1), 29-44 (1954).
Petersen, R. P., et al. Electrophysiological identification of medial and lateral perforant path inputs to the dentate gyrus. Neurosciences. 252, 154-168 (2013).
Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in Brain Research. 163, 3-22 (2007).
Szirmai, I., Buzsaki, G., Kamondi, A. 120 years of hippocampal schaffer collaterals. Hippocampus. 22 (7), 1508-1516 (2012).
Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visualized Experiments. (49), e2330 (2011).
Papouin, T., Haydon, P. G. Obtaining Acute Brain Slices. Bio-protocol. 8 (2), 2699 (2018).
Li, Q., Han, X., Wang, J. Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury. Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).
Lo, D. C., McAllister, A. K., Katz, L. C. Neuronal transfection in brain slices using particle-mediated gene transfer. Neuron. 13 (6), 1263-1268 (1994).
Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. 758, 115-134 (2011).
Magalhaes, D. M., et al. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices-a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 203 (2018).
Bliss, T., Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., O’Keefe, J. . The hippocampus book. , 37-114 (2007).
Bortolotto, Z. A., Amici, M., Anderson, W. W., Isaac, J. T. R., Collingridge, G. L. Synaptic plasticity in the hippocampal slice preparation. Current Protocols in Neuroscience. 54 (1), 11-26 (2011).
Al-Osta, I., et al. Imaging calcium in hippocampal presynaptic terminals with a ratiometric calcium sensor in a novel transgenic mouse. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 209 (2018).
McLeod, F., Marzo, A., Podpolny, M., Galli, S., Salinas, P. Evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices. Journal of Visualized Experiments. (128), e56153 (2017).
Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system. Journal of Visualized Experiments. (131), e55936 (2018).
Zhou, Q., Abe, H., Nowak, T. S. Immunocytochemical and in situ hybridization approaches to the optimization of brain slice preparations. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 85-92 (1995).
Koike-Tani, M., Tominaga, T., Oldenbourg, R., Tani, T. Birefringence changes of dendrites in mouse hippocampal slices revealed with polarizing microscopy. Biophysical Journal. 110 (10), 2366-2384 (2020).
Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N-Methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
Hua, Y., Keep, R. F., Hoff, J. T., Xi, G. Brain injury after intracerebral hemorrhage: the role of thrombin and iron. Stroke. 38, 759-762 (2007).
Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1 (4), 2075-2081 (2006).
Paxinos, G., Franklin, K. . The Mouse Brain In Stereotaxic Coordinates. 3 edn. , 256 (2008).
Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Preparation of acute subventricular zone slices for calcium imaging. Journal of Visualized Experiments. (67), e4071 (2012).
Schauer, C., Leinders-Zufall, T. Imaging calcium responses in GFP-tagged neurons of hypothalamic mouse brain slices. Journal of Visualized Experiments. (66), e4213 (2012).
Tetteh, H., Lee, J., Lee, J., Kim, J. G., Yang, S. Investigating Long-term Synaptic Plasticity in Interlamellar Hippocampus CA1 by Electrophysiological Field Recording. Journal of Visualized Experiments. (150), e59879 (2019).
Smith, C. J., et al. Investigations on alterations of hippocampal circuit function following mild traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (69), e4411 (2012).
McNaughton, B. L. Evidence for two physiologically distinct perforant pathways to the fascia dentata. Brain Research. 199 (1), 1-19 (1980).
Colino, A., Malenka, R. C. Mechanisms underlying induction of long-term potentiation in rat medial and lateral perforant paths in vitro. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1150-1159 (1993).
Coulter, D. A., Carlson, G. C. Functional regulation of the dentate gyrus by GABA-mediated inhibition. Progress in Brain Research. 163, 235-243 (2007).
Kuenzi, F. M., Fitzjohn, S. M., Morton, R. A., Collingridge, G. L., Seabrook, G. R. Reduced long-term potentiation in hippocampal slices prepared using sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 117-122 (2000).
Connor, S. A., et al. Loss of synapse repressor MDGA1 enhances perisomatic inhibition, confers resistance to network excitation, and impairs cognitive function. Cell Reports. 21 (13), 3637-3645 (2017).
Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nature Neuroscience. 20 (11), 1434-1447 (2017).
Moodley, K. K., Chan, D. The hippocampus in neurodegenerative disease. Frontiers of Neurology and Neuroscience. 34, 95-108 (2014).
Kong, H., et al. Inhibition of miR-181a-5p reduces astrocyte and microglia activation and oxidative stress by activating SIRT1 in immature rats with epilepsy. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. , (2020).
Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Research. 85 (3), 423-436 (1975).
Wang, T., Kass, I. S. Preparation of brain slices. Methods in Molecular Biology. 72, 1-14 (1997).
Garthwaite, J., Woodhams, P. L., Collins, M. J., Balazs, R. On the preparation of brain slices: morphology and cyclic nucleotides. Brain Research. 173 (2), 373-377 (1979).
Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51706 (2014).
Aydin-Abidin, S., Abidin, &. #. 3. 0. 4. ;. 7,8-Dihydroxyflavone potentiates ongoing epileptiform activity in mice brain slices. Neuroscience Letters. 703, 25-31 (2019).
Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A comparison of different slicing planes in preservation of major hippocampal pathway fibers in the mouse. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 107 (2017).
Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3 (4), 331-338 (1989).
Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the use of brain slices. Progress in Neurobiology. 31 (1), 1-18 (1988).
Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 71 (15), 2787-2814 (2014).
Gleichmann, M., Mattson, M. P. Neuronal calcium homeostasis and dysregulation. Antioxidants & Redox Signaling. 14 (7), 1261-1273 (2011).
Padamsey, Z., Foster, W. J., Emptage, N. J. Intracellular Ca(2+) release and synaptic plasticity: a tale of many stores. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 25 (3), 208-226 (2019).
Chen-Engerer, H. J., et al. Two types of functionally distinct Ca2+ stores in hippocampal neurons. Nature Communications. 10 (1), 3223 (2019).
Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Van Hoeymissen, E., Philippaert, K., Vennekens, R., Vriens, J., Held, K. Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (163), e61753, doi:10.3791/61753 (2020).