Ein mit Fibrin angereichertes und tPA-sensitives photothrombotisches Schlaganfallmodell
Summary
Traditionelle photothrombotische Schlaganfallmodelle (PTS) induzieren hauptsächlich dichte Thrombozytenaggregate mit einer hohen Resistenz gegen eine lytische Behandlung mit Gewebeplasminogenaktivator (tPA). Hier wird ein modifiziertes murines PTS-Modell durch Co-Injektion von Thrombin und lichtempfindlichem Farbstoff zur Photoaktivierung eingeführt. Das Thrombin-verstärkte PTS-Modell erzeugt gemischte Thrombozyten-Fibrin-Gerinnsel und ist hochempfindlich gegenüber tPA-Thrombolyse.
Abstract
Ein ideales thromboembolisches Schlaganfallmodell erfordert bestimmte Eigenschaften, darunter relativ einfache chirurgische Eingriffe mit geringer Mortalität, eine konsistente Infarktgröße und -lokalisation, Ausfällung von Blutplättchen-Fibrin-gemischten Blutgerinnseln, die denen bei Patienten ähneln, und eine ausreichende Empfindlichkeit gegenüber fibrinolytischer Behandlung. Das photothrombotische Schlaganfallmodell auf Basis von Rosen-Bengalen (RB) erfüllt die ersten beiden Anforderungen, ist aber sehr refraktär gegenüber tPA-vermittelter lytischer Behandlung, vermutlich aufgrund seiner plättchenreichen, aber fibrinarmen Gerinnselzusammensetzung. Wir gehen davon aus, dass die Kombination von RB-Farbstoff (50 mg/kg) und einer subthrombotischen Dosis Thrombin (80 U/kg) zur Photoaktivierung auf den proximalen Ast der mittleren Hirnarterie (MCA) fibrinangereicherte und tPA-empfindliche Gerinnsel erzeugen kann. In der Tat löste das kombinierte Photothrombosemodell von Thrombin und RB (T+RB) gemischte Blutgerinnsel aus Thrombozyten und Fibrin aus, wie durch Immunfärbung und Immunablots gezeigt wurde, und behielt konsistente Infarktgrößen und -lokalisationen sowie eine niedrige Mortalität bei. Darüber hinaus verringerte die intravenöse Injektion von tPA (Alteplase, 10 mg/kg) innerhalb von 2 h nach der Photoaktivierung die Infarktgröße bei T+RB-Photothrombose signifikant. Daher könnte das Thrombin-verstärkte photothrombotische Schlaganfallmodell ein nützliches experimentelles Modell sein, um neuartige thrombolytische Therapien zu testen.
Introduction
Die endovaskuläre Thrombektomie und die tPA-vermittelte Thrombolyse sind die einzigen beiden von der U.S. Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Therapien des akuten ischämischen Schlaganfalls, von dem in den Vereinigten Staaten jährlich ~700.000 Patienten betroffen sind1. Da die Anwendung der Thrombektomie auf den Verschluss großer Gefäße (LVO) beschränkt ist, während die tPA-Thrombolyse Verschlüsse kleiner Gefäße lindern kann, sind beide wertvolle Therapien des akuten ischämischen Schlaganfalls2. Darüber hinaus verbessert die Kombination beider Therapien (z.B. Einleitung einer tPA-Thrombolyse innerhalb von 4,5 Stunden nach Beginn des Schlaganfalls, gefolgt von einer Thrombektomie) die Reperfusion und die funktionellen Ergebnisse3. So bleibt die Optimierung der Thrombolyse auch im Zeitalter der Thrombektomie ein wichtiges Ziel für die Schlaganfallforschung.
Thromboembolische Modelle sind ein wesentliches Werkzeug für die präklinische Schlaganfallforschung mit dem Ziel, thrombolytische Therapien zu verbessern. Dies liegt daran, dass mechanische Gefäßverschlussmodelle (z. B. intraluminaler Naht-MCA-Verschluss) keine Blutgerinnsel erzeugen und die schnelle Wiederherstellung des zerebralen Blutflusses nach der Entfernung des mechanischen Verschlusses übermäßig idealisiert ist 4,5. Zu den wichtigsten thromboembolischen Modellen gehören bisher die Photothrombose 6,7,8, die topische Anwendung von Eisenchlorid (FeCl3)9, die Mikroinjektion von Thrombin in den MCA-Zweig 10,11, die Injektion von ex vivo (Mikro-)Embolien in das MCA oder die Arteria carotis communis (CCA)12,13,14 und die transiente Hypoxie-Ischämie (tHI)15,16, 17,18. Diese Schlaganfallmodelle unterscheiden sich in der histologischen Zusammensetzung der nachfolgenden Gerinnsel und der Sensitivität gegenüber tPA-vermittelten lytischen Therapien (Tabelle 1). Sie unterscheiden sich auch in den chirurgischen Anforderungen der Kraniotomie (erforderlich für die In-situ-Thrombininjektion und die topische Anwendung von FeCl3), der Konsistenz der Infarktgröße und -lokalisation (z. B. führt die CCA-Infusion von Mikroembolien zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen) und den globalen Auswirkungen auf das kardiovaskuläre System (z. B. erhöht tHI die Herzfrequenz und das Herzzeitvolumen, um die Hypoxie-induzierte periphere Vasodilatation zu kompensieren).
Das RB-Farbstoff-basierte photothrombotische Schlaganfallmodell (PTS) hat viele attraktive Merkmale, darunter einfache kraniotomiefreie chirurgische Eingriffe, eine niedrige Mortalität (typischerweise < 5 %) und eine vorhersagbare Größe und Lokalisation des Infarkts (im MCA-liefernden Bereich), aber es hat zwei wesentliche Einschränkungen. 8 Der erste Vorbehalt ist das schwache bis Null-Ansprechen auf eine tPA-vermittelte thrombolytische Behandlung, was auch ein Nachteil des FeCl-3-Modells ist 7,19,20. Der zweite Vorbehalt von PTS- und FeCl-3-Schlaganfallmodellen besteht darin, dass die nachfolgenden Thromben aus dicht gepackten Thrombozytenaggregaten mit einer geringen Menge Fibrin bestehen, was nicht nur zu ihrer Widerstandsfähigkeit gegenüber der tPA-lytischen Therapie führt, sondern auch vom Muster der gemischten Thrombozyten:Fibrin-Thromben bei akuten ischämischen Schlaganfallpatienten abweicht 21,22. Im Gegensatz dazu besteht das in situ Thrombin-Mikroinjektionsmodell hauptsächlich aus polymerisiertem Fibrin und einem unsicheren Gehalt an Thrombozyten10.
Vor diesem Hintergrund stellten wir die Hypothese auf, dass die Beimischung von RB und einer subthrombotischen Dosis Thrombin zur MCA-gezielten Photoaktivierung durch einen ausgedünnten Schädel die Fibrinkomponente in der resultierenden Thrombe erhöhen und die Empfindlichkeit gegenüber tPA-vermittelter lytischer Behandlung erhöhen kann. Wir haben diese Hypothese bestätigt,23 und hier beschreiben wir detaillierte Prozeduren des modifizierten (T+RB) photothrombotischen Schlaganfallmodells.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der traditionelle photothrombotische RB-Schlaganfall, der 1985 eingeführt wurde, ist ein attraktives Modell der fokalen zerebralen Ischämie für einfache chirurgische Eingriffe, niedrige Mortalität und hohe Reproduzierbarkeit des Hirninfarkts. 5 In diesem Modell aktiviert der photodynamische Farbstoff RB die Blutplättchen bei Lichtanregung schnell, was zu dichten Aggregaten führt, die das Blutgefäß verschließen 5,8,23.<sup class="x…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse unterstützt (NS108763, NS100419, NS095064 und HD080429 an C.Y. K. und NS106592 an Y.Y.S.).
Materials
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Meloxicam SR | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
References
- Lyden, P. D. . Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , (2015).
- Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
- Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
- Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
- Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
- Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
- Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
- Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
- Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
- Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
- Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
- Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
- Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
- Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
- Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
- Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
- Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
- Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
- Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
- McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
- Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
- Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).
