低温样品加载到魔法角度旋转核磁共振光谱仪中，可保持细胞生存能力

1. 哺乳动物细胞的培养和低温保护 培养和收获哺乳动物细胞 解冻冷冻人类胚胎肾细胞（HEK 293）的一个无名小包。 培养 HEK 293 细胞在生长介质 （例如， DMEM 与 10% 胎儿牛血清和 1% 笔链球菌） 在 37 °C 与 5% CO2 在 100 毫米板 2 至三段 （7-10 天）. 将细胞和培养在150毫米的盘子中分裂，直到细胞达到90-95%的汇流。注：150 mm 板在 > 90% 的汇流将足以填充两个直径为 3.2 mm 的蓝宝石转子。 使用 4 mL 的试金石（见材料表）和 10 mL 的介质收集细胞。将悬架以 673 x g（1000 rpm）将悬架转移到无菌的 15 mL 圆锥形离心机中，在室温下 5 分钟。取出超高超。 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4，+CaCl 2，+MgCl 2）清洗细胞颗粒。 细胞的冷冻保护 在微中心管中收集 50 μL 细胞颗粒。在单独的管子中准备 50 μL 的 PBS 和 18 μL 甘油的混合物。 将甘油-PBS混合物加入颗粒顶部，轻轻敲击管侧，直到没有团块，将50微升细胞颗粒与68微升甘油-PBS混合物轻轻混合，并重新吸收颗粒。注意：轻柔的管道也可以用来重新使用细胞，但是，确保细胞完整性不受影响。 2. 在NMR转子中保存哺乳动物细胞 将细胞转移到 3.2 毫米蓝宝石转子中。 要制作漏斗，切开一个 200 μL 移液器尖端，并将切口移液器尖端的窄端插入 3.2 mm 转子中。 将细胞转移到位于转子上的漏斗中。将转子与漏斗一起放入微中心管中，在室温下以 673 x g 离心将细胞颗粒到转子底部 2-3 分钟。 从转子中取出超高音和任何多余的样品。重复这两个步骤，直到转子完全充满细胞。注：可选，在冻结前确定样品的细胞生存能力。在 100 μL 的无 FBS DMEM 中重复 10 μL 的多余细胞颗粒。将悬架的 10 μL 与 0.4% 试穿蓝色解决方案混合，并立即使用自动电池计数器评估可行性。仅使用 FBS 自由介质稀释细胞，因为血清会干扰尝试蓝色染色。 使用市售包装工具用硅塞密封转子。 通过垂直向下按压转子，用陶瓷驱动尖端关闭转子。避免触摸驱动器尖端侧面的细腻鳍。 用银色永久标记标记蓝宝石转子底部边缘的一半，用黑色永久标记标记转子底部边缘的另一半，以便准确监控光谱仪内部转子的旋转。注：转子标记不完善会妨碍对旋转频率的准确计数，导致无法实现稳定的旋转。因为标记不会写在冻结转子上，转子加热会损害样品的完整性，因此在冻结前标记转子是关键步骤。 在 3.2 毫米蓝宝石转子内冷冻保存细胞。 将一块纸巾或纸巾制成的垫子放在盖子下，放在低温小瓶的底部（见 材料表）。注：纸巾保护转子标记免受低温小瓶两侧碰撞造成的损坏。 将 3.2 毫米蓝宝石转子放入用纸巾填充的低温小瓶中，其显著端面向低温小瓶底部。 将低温小瓶放入控制速率（-1 °C/min）冷却容器中，并将容器放入 -80 °C 的冰柜中，至少 3 小时，从而缓慢冻结转子。 将含有冷冻转子的低温小瓶转移到液氮储存处。 3. 冷冻样品低温转移到NMR光谱仪中 将冷冻样品运送到 NMR 设施。 将含有冷冻转子的低温小瓶转移到充满液氮的小排华中，以便输送到 NMR 设施。 将冷冻转子转移到液氮浴中。 用 500 mL – 1 L 液氮填充干燥、隔热的宽嘴泡沫脱瓦尔。 将转子从低温小瓶转移到充满液氮的宽口泡沫脱瓦尔中。 将低温小瓶从手的转移去瓦尔，并举行它正上方的液氮，以保护它免受大气。 一边拿着低温小瓶，嘴稍微向下指向，一边拧开盖子，让转子滑入液氮浴池。注：一旦盖开，转子必须从低温小瓶迅速落入液氮浴（1秒以下），以防止冷凝物收集在转子上。液氮的蒸发在宽口泡沫中形成”氮云”，防止转子凝结，然后再浸入液氮中。转子对空气的长时间暴露会导致转子壁上的水分凝结，从而重新凝结成冰。 转子低温转移至 NMR 样品捕手。 将 1.5 mL 微中心管浸入液氮浴中，预切一个 1.5 mL 微中心管。不要关闭管子。注：在转移到微中心管之前检查转子。使用钳子，将转子放在液氮表面正下方，检查转子标记是否完好无损，其墙壁上是否形成冰层，驱动尖端是否完好无损。转子壁上的冰晶沉积物显示为白色粉末。小心始终按其身体而不是驱动器尖端按住转子。不要用钳子尖划掉转子上的标记。 在液氮浴的表面下，使用钳子将转子转移到微中心管中，驱动尖端朝向微中心管的底部，标记朝向管的开口。注意：在浸入液氮或接触转子之前，请始终干燥钳子。 使用钳子，将含有转子的管子按住颈部的液氮。 手里拿着第二对钳子，准备将NMR样品捕手浸入液氮浴中，并抓住它，使其与微中心管的尖锐角度倾斜。注意：尽量减少样品捕手与液氮接触的时间，以避免冻结 O 环。如果 O 环冻结，将很难将捕手插入光谱仪。 低温转子从 NMR 样品捕获器传输到 NMR 光谱仪注：这一步骤需要两个人，一个操作冷冻卡比尼，一个将样品从液氮转移到探针中。 将冷冻卡比内特按在柜子上，使冷冻卡比内特处于弹出模式。注：喷射模式清除从探针到大气的高压下干冷氮气流，以防止大气水分进入。 将转子转移到 NMR 样品捕手。 将 NMR 样品捕手的开端插入微中心管中，同时仍处于液氮表面之下。 抬起微中心管和 NMR 样品捕手，让转子落入样品捕手。摇动 NMR 样品捕手和微中心管，以防转子卡在样品捕手的边缘。 将空微中心管放在 NMR 样品捕手顶部，以保护转子不受空气影响。 从探头中取出另一个空的 NMR 样品捕手，并将其放在地板上。 将装有转子的 NMR 样品捕手转移到您的手上，取出微中心管并立即将其插入探针中。注意：如果 O 环冻结，将很难收紧样品捕手。继续使用武力，直到它滑入原位。 将操作冷冻卡比内特的人信号到”停止弹出”和”插入”。注：插入模式将取样器中的转子引导到探针中。 通过调整低温卡比内特控制的轴承和驱动流压力，将样品旋转到所需的旋转速率（例如 12 kHz）。（例如，立即将轴承气体增加到 ±200 mBar，将驱动气体增加到 10 mBar。样品旋转后，将轴承气体增加到 1000 mBar，将气体驱动到 200 mBar。旋转稳定时，将轴承增加到 2400 mBar，然后在几分钟内将驱动气体从 200 mBar 增加到 1700 mBar。VT 冷却气体恒定在 ±1070 L/h.注：将微中心管和NMR样品捕手从液氮浴中取出时，请确保微中心管内有足够的液氮来包围转子。最大限度地缩短将转子转移到 NMR 样品捕手和将 NMR 样品捕手插入光谱仪之间的时间。3.4 中的所有步骤应在 30s 内完成。 4. 从 NMR 光谱仪中低温去除样品 液氮浴和低温小瓶的准备 将 500 mL – 1 L 液氮倒入宽口泡沫脱瓦尔，并将浴缸置于光谱仪下。 预冷低温小瓶。将含有一块纸巾的空低温小瓶浸入液氮浴中。 转子从探针到低温小瓶的低温转移 通过降低驱动和轴承气体流，并通过切换到弹射模式弹出转子，将旋转速率降低到 0 kHz。 保持弹出模式，从探针中取出样品捕手，将转子直接滴入含有液氮的宽口泡沫脱瓦尔中。 使用预冷钳子，将转子转移到液氮表面下的预冷低温小瓶中。 盖上低温小瓶。将低温小瓶盖浸入液氮中，以预切低温小瓶盖。从浴缸中取出含有转子和液氮的低温小瓶，用预切盖盖盖管。不要拧紧盖，以便可以安全地释放蒸发氮。 将低温小瓶重新浸入液氮中。样品可以转移到较长期的液氮储存或立即拆开包装作进一步分析。 5. 拆包转子和可行性测量 拆开转子和测量可行性 预热血清免费介质 （DMEM） 或 PBS 至 37 °C。 从液氮中取出转子。拆下驱动尖端和硅塞。注：蓝宝石是一种优秀的热导体。避免用手指触摸转子，因为传热会导致局部冻结-解冻事件，损害细胞生存能力。 测量可行性 在转子中的冷冻细胞颗粒中加入 20 μL 的加热介质并重新悬回细胞。用移液器取下悬架，将悬架与 100 μL 介质混合。 去除 10 μL 的电池悬架，并与等量的 0.4% 试用蓝色溶液（v/v）混合。在室温下孵育30秒至1分钟。 使用自动电池计数器测量可行性。