JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chimie

מיקרוסקופיה של כוח אטומי בשילוב עם ספקטרוסקופיית אינפרא אדום ככלי לחקירת כימיה של חיידק יחיד

Published: September 15, 2020
doi:
10.3791/61728
, , ,
1Centre for Biospectroscopy and School of Chemistry,Monash University, 2Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute and Department of Microbiology,Monash University, 3Department of Infectious Diseases, The Alfred Hospital and Central Clinical School,Monash University

Summary

ספקטרוסקופיית מיקרוסקופיה-אינפרא אדום של הכוח האטומי (AFM-IR) מספקת פלטפורמה רבת עוצמה למחקרים חיידקיים, המאפשרת להשיג רזולוציה ננומטרית. שניהם, מיפוי של שינויים תת-תאיים (למשל, על חלוקת תאים) כמו גם מחקרים השוואתיים של הרכב כימי (למשל, הנובעים עמידות לתרופות) יכולים להתבצע ברמת תא אחד בחיידקים.

Abstract

ספקטרוסקופיה מיקרוסקופיה-אינפרא אדום של הכוח האטומי (AFM-IR) היא טכניקה קומבינטורית חדשנית, המאפשרת אפיון סימולטני של תכונות פיזיות והרכב כימי של מדגם ברזולוציה ננומטרית. על ידי שילוב AFM עם IR, מגבלת הרזולוציה המרחבית של IR קונבנציונלי הוא להתגבר, המאפשר רזולוציה של 20-100 ננומטר כדי להשיג. זה פותח את הדלת למגוון רחב של יישומים חדשים של IR לקראת דגימות חקירות קטנות יותר מכמה מיקרומטרים, בעבר לא ניתן להשמדה באמצעות מיקרוסקופיית אינפרנציונלית קונבנציונלית. AFM-IR מתאים במיוחד למחקר חיידקי, ומספק מידע ספקטרלי ומרחבי הן ברמה התא הבודד והן ברמה התאית. החששות הבריאותיים העולמיים הגוברים והתחזית העתידית השלילית לגבי זיהומים חיידקיים, ובמיוחד, התפתחות מהירה של עמידות מיקרוביאלית, יצרו צורך דחוף בכלי מחקר המסוגל לחקור פנוטיפי ברמה התא הבודד והתת-תאי. AFM-IR מציעה את הפוטנציאל לענות על צורך זה, על ידי מתן אפיון פירוט של הרכב כימי של חיידק יחיד. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מלא להכנת מדגם ורכישת נתונים של ספקטרום יחיד ומודל מיפוי, ליישום של AFM-IR לקראת מחקרים חיידקיים.

Introduction

חיידקים הם אורגניזמים פרוקריוטים של תאים בודדים, המתרחשים בצורות וגדלים שונים, בדרך כלל בטווח של כמה מאות ננומטרים למיקרומטרים. הם קיימים במגוון בתי גידול וחיוניים לקיומם של החיים. בתוך גוף האדם, רוב החיידקים הקיימים במעיים אינם מזיקים ורבים מהם למעשה מועילים1. עם זאת, מספר מינים חיידקיים הם פתוגניים וגורמים למגוון מחלות זיהומיות. זיהומים חיידקיים יכולים להוביל להתפתחות של אלח דם והלם זיהומי: מצב מסכן חיים, הנובע מתגובת הגוף לזיהום2. אלח דם הוא איום בריאותי גדול גלובלי, עם שכיחות גבוהה ברחבי העולם ושיעורי תמותה חמורים. בשנת 2017 לבדה תועדו ברחבי העולם כ-50 מיליון מקרים של אלח דם, כאשר 11 מיליון מתום מתו (כ-20%)2. יתר על כן, ירידה בסיכויי ההישרדות של המטופל, עקב טיפול מאוחר, הוכח להתרחש באופן שעתי3,4.

זיהומים חיידקיים מטופלים באנטיביוטיקה. חומרת ההשלכות הפוטנציאליות של זיהומים במחזור הדם החיידקי (BSIs), יחד עם משמעות ברורה של ייזום מהיר של טיפול מיקרוביאלי, מעוררים את הצורך בניהול אנטיביוטיקה מיידי. עם זאת, כמו גישות האבחון הנוכחי המשמש בפועל קליני (למשל, פולחן הדם) דורשים זמן רב יחסית, ניהול אנטיביוטיקה מתרחשת לעתים קרובות לפני אבחון BSI חיובי5. גורם זה מוביל לשימוש יתר נרחב באנטיביוטיקה, אשר – יחד עם שימוש מופרז באנטיביוטיקה במגזרים אחרים כגון חקלאות – יוצר לחץ אבולוציוני חמור לקראת התפתחות עמידות מיקרוביאלית (AMR)6,7. AMR היא כיום אחת מבעיות הבריאות העולמיות הבוערות ביותר7,8, ועד 2050, צפויה להפוך לסיבת המוות המובילה9. התפתחות ההתנגדות, יחד עם התפשטות זני AMR מתרחשת בקצב מדאיג7,8,9 עולה, ללא ספק, על שיעור גילוי של אנטיביוטיקה חדשה10. פנוטיפים עמידים חדשים מתעוררים ברציפות ברחבי העולם, בעוד
מחקר המוקדש להבנת השינויים הקשורים ל- AMR הוא לעתים קרובות איטי ומוגבל על ידי גישות זמינות11. בנוסף, השיטות הנפוצות, כגון תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ורצף גנים שלם (WGS), מתמקדות רק בשינויים גנוטיפיים. אלה אינם מספיקים כדי לחשוף את המנגנונים של התנגדות11, מה שמעורר צורך דחוף בכלי מחקר המאפשר להבין את ההרכב הכימי של חיידקים.

ספקטרוסקופיית אינפרא אדום (IR) מספקת אפיון מולקולרי של המדגם ולכן היא מועמדת מבטיחה לבדיקת חיידקים פנוטיפיים. מאז היישומים המוקדמים שלה12, גודל גדול של דוגמאות לשימוש בו הודגם בספרות13,14. אלה כוללים זיהוי פנוטיפי מבוסס של חיידקים על סוג15, מינים16, וזן17,18 רמה. עם זאת, הרזולוציה המרחבית של IR קונבנציונאלי מוגבלת למספר מיקרונים בשל מגבלת העקיפה המרחבית אורך הגל19. מאז גודל רוב החיידקים נמצא מתחת לגבול זה (למשל, Staphylococcus aureus ≈ 400 ננומטר קוטר), IR קונבנציונאלי אינו ישים עבור חיקור ברמה תא יחיד או תאי.

מגבלת הרזולוציה המרחבית הוכרעה לאחרונה על ידי שילוב ספקטרוסקופיית IR עם מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM-IR). במקרה זה, ספיגת IR מזוהה בעקיפין, באמצעות התפשטות תרמית של החומר19,20,21,22. בקצרה, ספיגת קרינת IR גורמת לעלייה בטמפרטורה המקומית. זה יכול להימדד או ישירות23 או באמצעות מדידת תנודה של הגשושית cantilever AFM, הנובעת דחף כוח שנוצר על ידי ספיגת IR20,21. טכניקת AFM-IR הקומבינטורית מאפשרת להשיג רזולוציה מרחבית המתקרבת ל- 20 ננומטר, ומספקת מידע סימולטני על תכונות פיזיות מקומיות של מדגם (AFM) וההרכב הכימי שלה (AFM-IR). איסוף של שניהם, ספקטרום יחיד מנקודות נבחרות ומיפוי עוצמת ערכי מספר הגלים שנבחרו בתוך אזור נבחר אפשריים.

בהתחשב ברזולוציה המרחבית ברת השגה של AFM-IR, ניכר כי הטכניקה פותחת את האפשרות של בדיקה כימית / פנוטיפית של תא חיידק יחיד ואת הרכב תאיים שלהם24. עד כה, כמה דוגמאות ליישום של AFM-IR עבור חיידקים בודדים הודגמו בספרות19,20,21,22,25,26,27,28. אלה כוללים ניתוח ספקטרלי יחיד19,21,22 ומיפוי ברמה תת-תאית19,22,25,26,27,28. לדוגמה, היכולת לזהות שלל שומנים תאי27 ווירוסים28 בתוך חיידק יחיד תוארה. תוצאות אלה מדגימים את התועלת של AFM-IR למחקרים ננומטריים של חיידקים בודדים ופתוגנים רלוונטיים קלינית19.

לפיכך, אנו מציגים שיטת הכנה ואיסוף מדגם עבור נתוני AFM-IR של דגימות חיידקיות מרובות שכבות, monolayer ותא יחיד. הפרוטוקול המתואר בזאת יושם כדי לחקור מינים שונים של חיידקים22 ואת השינויים בהרכב הכימי שלהם. בפרט, פיתוח in vivo של התנגדות ונקומיצין וחוסר רגישות daptomycin נחקר בזוגות קליניים של S. aureus19. שניהם, התנגדות לסירוגין vancomycin וחוסר רגישות daptomycin ב S. aureus (ויזה ו- DpR) הופיעו יחסית לאחרונה, בעקבות השימוש המוגבר והכנסת אנטיביוטיקה אלה למרפאות, המהווים בעיה רפואית משמעותית. יתר על כן, בפרט, המנגנון של דפטומיצין אי רגישות עדיין נשאר חמקמק, לעכב פיתוח תרופות חלופיות19,29. הפרוטוקול המוצג מתמקד באספקת ספקטרום AFM-IR אמין של חיידקים בודדים, אשר ניתן לנתח עוד יותר באמצעות מגוון רחב של גישות כימותרפיות, על פי המטרות הניסיוניות. הוא כולל בנוסף את גישת המיפוי, החלה על מחקרים פנים-תאיים.

Protocol

כל העבודה המבוצעת עם חיידקים פתוגניים צריכה להתבצע עם אמצעי בטיחות מתאימים במקום. אלה כוללים עבודה במעבדה עם רמת בטיחות ביולוגית נאותה ובתא בטיחות ביולוגית (PC2) וכן טיהור זהיר של אזור עבודה עם חומר חיטוי מתאים, למשל, פתרון אתנול 80%. PPE מתאים חייב להיות משוחק כל הזמן. 1. הכנת ממיסים וחומרים ממיסים: יש להשתמש במים אולטרה-טעם כממס. השתמש במים מטוהרים, autoclaved לפני הניסוי כדי למנוע כל זיהום צולב פוטנציאלי. מצע: השתמש בכל אחד מהמצעים האלה עבור AFM-IR, למשל, ZnSe, CaF2, BaF2,וכו ‘. מאז AFM-IR היא, באופן עקרוני, טכניקה לא הרסנית, אפשר ליישם מגוון של כלי מחקר אחרים על אותו מדגם לאחר ניתוח AFM-IR. לדוגמה, מתאם של התוצאות עם ספקטרוסקופיית Raman יכול להתבצע אם רמאן כיתה CaF2 או שקופיות BaF2 משמשים. השתמש בקבוקוני זכוכית במקום צינורות פלסטיק כמו פלסטיק יכול לזהם את המדגם. 2. הכנה לדוגמה עבור AFM-IR צמיחה/דגירה של מדגם לגדל חיידקים במדיה נוזלית או על לוחות מוצקים. בחר את סוג תנאי הצמיחה הבינוניים (למשל, טמפרטורה, זמינות חמצן) וזמן הצמיחה בהתאם לדרישות הספציפיות של מיני החיידקים הנחקרים. לדוגמה, עבור S. aureus הלב עירוי (HI) צלחות אגר ניתן להשתמש, עם צמיחה עבור 16 שעות ב 37 °C בתנאים אירוביים.הערה: כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, הצמיחה / הדגירה צריך להניב מספיק חיידקים שיאפשרו איסוף של מיקרו גלולה של מדגם. המספר הספציפי של יחידות יוצרות מושבה או תאים חיידקיים תלוי בסוג ובגודל החיידק. תצהיר לדוגמה באמצעות לולאה סטרילית, לאסוף בזהירות חיידקים מהמושבות על צלחת אגר ולהעביר אותם צינור זכוכית. לאסוף חיידקים רק מראש המושבות. אם אוספים דגימות מתרבית נוזלית, באמצעות פיפטה, מעבירים כ-1 מ”ל של ההשעיה החיידקית לצינור זכוכית. ניתן לשנות את הנפח בהתאם לעומס החיידקי.הערה: חשוב לנסות לא לאסוף (או למזער ככל האפשר את האוסף של) כל מדיום מתחת למושבה. השלבים הבאים של הכנת מדגם שואפים להסיר כל שיורית פוטנציאלית של מדיה. מזעור השיוריות הבינוניות הפוטנציאליות מההתחלה מאפשר רכישה ספקטרלית של נתונים מתאי חיידקים מטוהרים. שלבים 2.2.2 ו-2.2.3 חלים על דגימות שהוכנו מלוחות אגר. עבור דוגמאות שהוכנו ממדיה נוזלית, עבור לשלב 2.2.4. הוסף 1 מ”ל של מים אולטרה-תול לצינור. מערבולת עד גלולה חיידקית שנאספה כבר לא נראים בתחתית הצינור (בדרך כלל 1-2 דקות). להעריך את העקשנות הגסה של הפתרון באמצעות, למשל, תקני מקפרלנד על ידי השוואה חזותית30 בין הפתרון המוכן לתקני מקפרלנד. אם עכוז של השעיית חיידקים נראה נמוך מאוד, להוסיף חיידקים נוספים מהצלחת באמצעות לולאה סטרילית מערבולת שוב. חזור על הפעולה עד שהערפול המחוספס של הפתרון דומה לתקני מקפרלנד 0.5 ו-1. זה בדרך כלל יניב כמות טובה של גלולה חיידקית. צנטריפוגה השעיה חיידקית ב 3, 000 x g במשך 5 דקות כדי להשיג גלולה.הערה: ניתן לשנות פרמטרים של צנטריפוגה כדי להשיג גלולה חיידקית. יש לנקוט זהירות אם מגבירים את כוח הג’י, כדי לא לגרום לשבירה של חיידקים (במיוחד במקרה של חיידקים גרם שלילי). בעזרת פיפטה, הסירו בעדינות את הסופר-טבעי מעל הכדור. הוסף 1 מ”ל של מים אולטרה-תול לצינור ומערבולת כדי להשעות מחדש את הכדור. לאחר מכן, צנטריפוגה המדגם כפי שנעשה בשלב 2.2.4. חזור על הליך הכביסה (שלבים 2.2.2 ו- 2.2.4) לפחות שלוש פעמים. במקרה של איסוף המדגם הראשוני ממדיה נוזלית, חזור על ההליך לפחות ארבע פעמים (הסרת מדיה ואחריו שלוש שטיפות). לאחר השטיפה הסופית, להסיר את supernatant, להוסיף מים אולטרה-pure מערבולת לפחות 2 דקות. לאחר מכן, הפקדה 5 μL של המדגם על המצע (למשל, כיתה Raman CaF2). אם העובי הרצוי של המדגם הוא רב שכבתי של חיידקים, להשאיר את המדגם לייבוש אוויר. אם העובי הרצוי הוא monolayer או חיידקים בודדים, מיד לאחר הפקדת המדגם (שלב 2.2.7) להוסיף בין 20-100 μL של מים אולטרה-pure ומערבבים בעדינות עם קצה pipette. השאירו לייבוש אוויר.הערה: נפח המים המדויק יכול להשתנות בין ניסויים כפי שהוא תלוי בגורמים רבים (למשל, גודל האורגניזם, צפיפות הכדור, וכו ‘) ולכן, נקבע בצורה הטובה ביותר אמפירית. הכנת סדרה של דגימות עם כמויות שונות של מים אולטרה-תפותיים שנוספו מאפשרת לבחור מדגם עם העובי /הצפיפות הרצויה של חיידקים. ניתן לדמיין בקלות את עובי /צפיפות החיידקים באמצעות AFM בשלבים הבאים. דוגמאות לתמונות AFM מדגימות של מונו-שכבתיות ותאים בודדים מוצגות באיור 1A–H. הר את המצע על דיסק דגימת מתכת AFM באמצעות סרט דבק דו-צדדי. 3. הכנת מכשירים הערה: ההליכים האינסטרומנטליים המתוארים כאן מיועדים לכלי המופיע בטבלת החומרים. הליך הפירוט האינסטרומנטלי עשוי להיות שונה במקצת מזה המתואר כאן אם משתמשים בדגם חדש יותר של מכשיר AFM-IR. הפעלה ואתחל של הכלי על-ידי לחיצה על לחצן אתחל. ודא כי תריס הלייזר נמצא במצב פתוח עבור בדיקת הלייזר. אם מערכת טיהור מוגדרת, לטהר את המכשיר עם N2 על ידי הפעלת הזרימה של N2. התאם את טיהור החנקן כדי להשיג רמת לחות יציבה (לדוגמה, 20%). ודא שהלחות אינה משתנה במהלך המדידות ובין איסוף נתונים ברקע לדגימה. מומלץ לאפשר כ-20 דקות לייצב את רמות הלחות. טען את הדגימה לתא הדגימה על-ידי לחיצה על לחצן טען. טעינה לדוגמה מתבצעת באמצעות אשף התוכנה. בעת הפעלת אשף התוכנה, תחילה להתמקד בקצה, באמצעות חצים כדי להזיז את שלב המיקרוסקופ בכיוון Z ולחץ על הבא. שנית, התאם את נקודת איסוף הנתונים, באמצעות חצים המנחים את התנועה במטוס ויישר את גלאי הלייזר וה- AFM של AFM באמצעות הכפתורים בחלק העליון של ראש ה- AFM. לאחר מכן, להתמקד על פני השטח מדגם על ידי הזזת שלב המיקרוסקופ בכיוון Z.הערה: איורים מפורטים של כל שלב של טעינה לדוגמה מסופקים במדריך התוכנה31. התמקדות במדגם צריכה להתבצע בזהירות. כאשר מתקרבים למשטח המדגם בכיוון Z, השתמש במהירות מוטורית איטית. גש לדוגמה מבלי לעסוק על-ידי לחיצה על לחצן גישה. 4. איסוף נתונים רקע לפני רכישת נתונים, לאסוף את הרקע. לאיסוף רקעים, ודא שתריס הלייזר נמצא במצב Open. בחר את הטווח והרזולוציה הספקטרליים (בהתאם למטרה של הניתוח) ואת מספר הסריקות ומספר הממוצעים המשותפים של הרקע. אלה מומלצים בדרך כלל להיות גבוה (למשל, 1024 סריקות ו 3 ממוצעים משותפים).הערה: באופן כללי, רזולוציה ספקטרלית של 4 ס”מ-1 או 8 ס”מ-1 וטווחים ספקטרליים של 3,200 ס”מ-1-2,800 ס”מ-1 ו 1,800 ס”מ- 1-900 ס”מ-1 מומלץ. לאחר רכישת הרקע, שמור את קובץ הרקע. הקובץ אינו מאוחסן באופן אוטומטי. שנה את מיקום תריס הלייזר לסגירה. דוגמה – ספקטרום יחידלחץ על לחצן לעסוק כדי ליצור קשר עם המדגם. המערכת תתחיל להתקרב למשטח המדגם, עד לזיהוי מגע ישיר.הערה: נקודת הסט המשמשת בעבודה זו נעה בין 0.15-2 V ורווחי המשוב (I Gain ו- P Gain) יוגדרו בדרך כלל ל- 3 ו- 10. בדיקות מגע NIR2 משמשות בדרך כלל עם מערכת nanoIR2 (דגם: PR-EX-nIR2-10, תדר תהודה (kHz): 13 +/−4 kHz, קבוע קפיץ (N/מ’): 0.07−0.4 Nm-1). אסוף תמונת AFM כדי להציג את פני השטח באופן חזותי. במקרה הראשון, סרוק שטח גדול יותר (לדוגמה, 50 x 50 מיקרומטר) ברזולוציה מרחבית נמוכה יותר (לדוגמה, 200 x 200 נקודות) (איור 1I).הערה: נתוני AFM-IR נאספים תמיד במצב איש קשר, עם זאת, ניתן לאסוף את נתוני AFM במצב מגע או הקשה. מתמונת הגובה/הסטה של AFM, בחרו אזור עניין מסוים ודמותו אותו מחדש ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר(איור 1J–K). ודא שמהירות איסוף הנתונים מתאימה, עם תנועת קצה איטית (למשל, קצב סריקה 0.2-0.4 הרץ). בחר את נקודת המדידה (למשל, חיידק יחיד) והזז את הקצה למקום. יישר את לייזר ה- IR. לשם כך, השתמש במספר גלים שבו המדגם יספוג. עבור חומרים ביולוגיים זה יכול להיות, למשל, amide I (1655 ס”מ-1). ודא שמסנן מעבר הרצועה כבוי ולחץ על התחל IR. הגרף הימני במד nanoIR (FFT של הסטה המוצגת כמשרעת לעומת תדר) צריך להראות לפחות פסגה ברורה אחת והגרף השמאלי (הסטה לעומת זמן) צריך להיות צורת גל תקופתית. אם זה לא המקרה, המשך למטב את כתמי אינזרה-זמניים.הערה: גם אם התמרת פורייה מהירה (FFT) וההסטה מציגות פרופיל צפוי, מומלץ לבצע אופטימיזציה של נקודות אינפרא-סם לפחות למספר גלים, שם צפויות להקות. מטב את הנקודות החמות עבור איסוף נתוני אינם-זמניים באמצעות ערכי מספר הגלים שנבחרו. זה יכול להיות מועיל להשתמש בספקטרום IR קונבנציונלי של החיידקים (למשל, ספקטרום ATR של כדורי חיידקים) כדי לזהות את המיקום של הרצועות ולהשתמש בהם כדי לייעל את הנקודות החמות. בחר ערכי מספר גל שונים (למשל, 8-10) מאזורים ספקטרליים שונים.הערה: אם ספקטרום IR קונבנציונלי של חיידקים מעניינים לא ניתן היה לאסוף לפני איסוף נתונים AFM-IR, ספקטרום חיידקי זמין בספרות יכול לשמש הדרכה גסה. התוצאה של אופטימיזציה של נקודת IR היא תמונה, המציגה מפה של אות סדר הגודל של FFT בכל מיקום x ו- y. המיקום עם האות הגדול ביותר נבחר באופן אוטומטי. דוגמאות לתמונות כאלה ניתנות במדריךהתוכנה 31. לאחר מיטוב כתמי ה- IR עבור ערכי wavenumber נבחרים, הגדר את הפרמטרים של איסוף נתונים ספקטרליים: אזור ספקטרלי, רזולוציה ספקטרלית, מספר סריקות, וכוח להחיל ולהכניס אותם לתוך החלונות המתאימים בתוכנה. הרזולוציה הספקטרלית צריכה להתאים לרזולוציית הרקע והאזור הספקטרלי צריך להיות בתוך האזור הספקטרלי שעבורו נאסף הרקע.הערה: קבוצה ראשונית כללית של פרמטרים יכולה להיות: טווח ספקטרלי: 3200 ס”מ-1-2800 ס”מ-1 ו 1800 ס”מ-1-900 ס”מ-1,רזולוציה ספקטרלית: 4 ס”מ-1 או 8 ס”מ-1,מספר הסריקות: 512-2048. במידת הצורך, להתאים את כוח הלייזר בהתאם לאות. באופן כללי, ערכים בין 8%-10% מכוח הלייזר צריכים להספיק לאיכות טובה של האות. ניתן להשתמש בערכים גבוהים יותר בזהירות, שכן הם עלולים לגרום לנזק לדוגמה.הערה: עוצמת הלייזר באחוזים יכולה להשתנות בהתאם לסוג לייזר IR. ערכי האחוזים שניתנו כאן הם עבור לייזר OPO. לחץ על רכישה כדי לאסוף ספקטרום AFM-IR. לאסוף מחדש את נתוני AFM מאותו אזור לאחר איסוף ספקטרום AFM-IR. מומלץ מאוד שכן הוא יחשוף כל סחף פוטנציאלי ו/או השפעה הרסנית על המדגם. אם ספקטרום AFM-IR משביע רצון ולא נצפתה השפעה הרסנית על המדגם, המשך באיסוף נתונים. במידת הצורך, הגדר סידרה של נקודות לאיסוף נתונים באמצעות האפשרות Array ונאספו בגובה AFM או בתמונת הסטה. אפשרות זו מאפשרת לאסוף ספקטרה ברציפות מכל נקודה עם אותם פרמטרים ספקטרליים כפי שהוגדרו עבור ספקטרום יחיד. אם תמונת AFM שנאספה לאחר איסוף ספקטרום AFM-IR חושפת השפעה הרסנית על המדגם (בדרך כלל נקודה שרופה), להפחית את הכוח; בחר נקודה אחרת וחזור על שלבים 4.3.8–4.3.11. אם האות בספקטרום AFM-IR אינו משביע רצון, בדוק את נכונות האופטימיזציה של כתמי אינפרא-אר (שלב 4.3.6). אם זה נכון, להגדיל את כוח הלייזר מעט ולחזור על שלבים 4.3.7–4.3.11. זה יכול לחזור על עצמו עד אות משביע רצון מושגת. דוגמה – גישת הדמיההערה: מומלץ מאוד להקליט ספקטרום AFM-IR יחיד של החיידק לפני איסוף תמונת הפצת עוצמה עבור ערך מספר גל נבחר. הקלט תמונת AFM של אזור המדגם שנבחר. כדי לעשות זאת, תחילה אסוף תמונת AFM של שטח גדול יותר עם רזולוציה מרחבית נמוכה יותר (לדוגמה, 50 x 50 מיקרומטר, 200 x 200 נקודות), ולאחר מכן בחר אזור עניין ואסוף תמונת AFM ברזולוציה מרחבית מוגברת (כפי שממחיש באיור 1I–K). בחר את ערכי מספר הגל עבור הדמיית AFM-IR. ודא שנקודת ה- IR של הלייזר ממוטבת לערכי מספר הגלים שנבחרו (שלב 4.3.6). אם נקודת ה- IR אינה ממוטבת למספרי גלים מסוימים (ללא מקסימום ברור), מיטוב אותה עבורם. הגדר את הפרמטרים של האזור בתמונה: הרוחב והגובה, מספר נקודות הנתונים בכיוון X ו- Y.הערה: אם הבחירה העוקבת של כתמים מתמונות AFM הקודמות מוחלת (כפי שהודגם באיור 1I–K),שדות הרוחב והגובה יתמלאו באופן אוטומטי, בעת סימון האזור. הגדר את הפרמטרים של רכישת אותות ספקטרליים: אורך הגל, מספר הסריקות וכוח הלייזר.הערה: יש לשמור את מספר הסריקות בתוך ההיגיון. 64 או 32 סריקות בדרך כלל יאפשרו כמות מספקת של אות. הגדר את הפרמטרים של תנועת טיפ AFM על ידי לחיצה על קצב הסריקה. מספר הסריקות בשלב הקודם ומספר נקודות הנתונים בכיוון X גבוה יותר, כך תנועות הקצה צריכות להיות איטיות יותר. חוסר התאמה בין פרמטרים אלה יגרום לתנועה מהירה מדי של הקצה, וימנע רכישה בפועל של מספר מוגדר של סריקות מכל נקודה.הערה: לדוגמה, עבור אוסף מתאים של אות אינפרה-שעה עם 64 תוספות משותפות ו- 200 נקודות, הגדר את קצב הסריקה כ- 0.07 קילו-הרץ. ודא שתיבת ההדמיה אפשרת IR מסומנת. תתחילו להדמיה. AFM-IR של עוצמת האות במספר הגלים שנבחר ייאסף בו זמנית עם נתוני AFM מאזור זה.הערה: כאשר נעשה שימוש בלייזר OPO, ניתן גם לאסוף בו-זמנית תמונת תדר שיא תהודה ליצירת קשר. זה יכול לשמש כדי לקבל מידע על נוקשות יחסית של המדגם במקומות שונים. השתמש בחלון רצף לכידה כדי להגדיר אוסף רציף של נתוני AFM-IR מאותו אזור עם אותם פרמטרים, אך עבור ערכי מספר גלים שונים. כדי לעשות זאת, פתח את החלון רצף לכידה, הקלד כל מספר גלים והגדר את עוצמת הלייזר המוחלת (עבור כל מספר גלים). יצא את הנתונים שנאספו (AFM ו- AFM-IR, ספקטרום יחיד והדמיה) לפורמטים שונים וניתח אותם בשיטות המתאימות למטרות מחקר ספציפיות.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר מאפשר להשיג מגוון סוגים של התפלגות תאים של חיידקים על המצע, בהתאם לריכוז הראשוני של הדגימה וכמות המים שנוספה. איור 1 ממחיש את הדוגמאות של תמונות AFM (גובה הסטה) שנרשמו משכבות מונו-שכבתיות ודגימות חד-תאיות שהוכנו באמצעות הפרוטוקול המתואר מחיידקי גראם-חיובי(S. aureus) ו- Gram-negative (Escherichia coli). הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש להדמיית AFM-IR של מבנים פנים-תאיים ואקסטרה-תאיים של חיידקים בודדים. דוגמה ליישום זה מוצגת באיור 2, המדגים את התוצאות של ניטור השינויים הכימיים המותאמים לשפות שמים במהלך חלוקת תא S. aureus. למרות ייבוש אוויר נחשב בדרך כלל כגישת קיבעון להכנת חיידקים, חיידקים, מטבעם, מראים עמידות גבוהה מאוד לגורמים חיצוניים כגון טמפרטורה ודווחו כדי לשרוד התייבשות32. התוצאות המוצגות כאן נרכשו מדגם מיובש באוויר. היווצרות מחיצה, שהתרחשה לפני חלוקת התאים נצפתה ונצפתה באמצעות הדמיית AFM (איור 2A-D) על ידי איסוף של 12 תמונות מאותו אזור ברציפות (אוסף של תמונה אחת ≈ 20 דקות). איור 2A–D מציג 4 תמונות AFM נבחרות, עם זמן בין אוסף של כל תמונה של כ-40 דקות. המבנה שנוצר (מחיצה) הוא 45 ננומטר גבוה. המחיצה שנוצרה נראית בבירור בגובה AFM ובתמונות הסטה(איור 2E-F). ספקטרום AFM-IR שנרשם מאזור התא והמחוץ (איור 2G,נקודות מוצא המסומנות באיור 2F) נוטרלו את רצועת האמיד I לפני ההשוואה, כדי למזער את ההשפעה של עובי מדגם משתנה בין נקודות איסוף נתונים. ספקטרום AFM-IR של המחיצה מאופיין בעוצמה יחסית גבוהה יותר של רצועות ב 1240 ו 1090 ס”מ-1 לעומת ספקטרום AFM-IR שנאסף מאזור התא. אלה מיוחסים פחמימות וקבוצות זרחן של רכיבי דופן התא (כולל למשל, פפטידוגליקן וחומצה טיכואית)22. הפרוטוקול המתואר יכול לשמש גם להשוואה של ספקטרום יחיד בין מספר דגימות שונות. דוגמה ליישום זה יחד עם התוצאות מוצגות באיור 3 ובאיור 4. מטרת המחקר היא לקבוע את השינויים הכימיים המתרחשים כתוצאה מהתפתחות ויוו של התנגדות לסירוגין של ונקומיצין ב- S. aureus (VISA). לשם כך נאספו זוגות קליניים של דגימות מחולים, כאשר זן ההורה מבודד עם האשפוז לבית החולים ולפני טיפול אנטיביוטי (vancomycin רגיש S. aureus, VSSA) ואת זן הבת מבודד מאותו חולה לאחר הודאה של אנטיביוטיקה וכישלון קליני. הדגימות גדלו עוד יותר על אגר בינוני והוכן על פי הפרוטוקול (איור 3A–B). ספקטרום AFM-IR נאסף מחיידקים בודדים מרובים (ודגימות מרובות) עבור VSSA ו- VISA ולאחר מכן נותח באמצעות מספרגישות כימותרפיות (איור 3C). לא נצפו הבדלים מורפולוגיים בין תאי VSSA ו-VISA(איור 4A–C). עם זאת, ספקטרום AFM-IR (איור 4D, F) ונגזרותיהם השניות ( איור4E,G) הדגימו הבדל ברור בהרכב הכימי בין זנים עמידים לרגישים. העוצמה היחסית של הרצועות הקשורות לקבוצות פחמימות וזרחן מרכיבי דופן התא (בפרט, הרצועה ב 1088 ס”מ-1) גדל בבירור בזן עמיד, לעומת המקבילה רגישה. ראוי לציין כי כל ספקטרום מקודד מחדש (ויזה: 81, VSSA: 88) להראות סטיית תקן קטנה. זה מדגים שחזור טוב של נתונים שנרשמו מדגימות שונות שהוכנו מאותו זן, שכן לא הייתה אפליה בין ספקטרום שנרשם מדגימות שונות של אותו זן. ההבדלים שנצפו הצביעו על עובי מוגבר של דופן התא בזנים עמידים, לעומת המקבילה רגישה, אשר נשאר בהסכמה עם דוחות ספרות אחרים33,34. איור 1: תמונות AFM מייצגות של דגימות חיידקים שונות למדידות AFM-IR. בהתאם לדילול על המצע, הפרוטוקול מאפשר אחד להשיג multilayers ו monolayers של חיידקים, כמו גם דגימות תא יחיד. תמונות AFM מייצגות של: (A-D)monolayer ו -( E-H) מדגם תא יחיד עבור (A,B,E,F)גרם חיובי (S. aureus) ו (C, D, G,H) גרם שלילי (E. coli) חיידקים. (A,C,E,G)מדגימים תמונות גובה ו -( B, D, F,H) מציגות תמונות הסטה מתאימות. גודל האזורים בתמונה: (A-D, G,H) 20 x 20 מיקרומטר, (E,F) 50 x 50 מיקרומטר. (I-K) בחירה רצופה של אזור עבור מיפוי AFM-IR. זה מושג באמצעות הדמיית AFM עם רזולוציה מרחבית גוברת בדוגמה של תא S. aureus יחיד. כל תמונה נאספה על-ידי דגימה של 200 x 200 נקודות, עם רזולוציה מרחבית הולכת וגדלה בשל הירידה בגודל השטח שהתמונה. גודל האזורים בתמונה: (I) 40 x 40 מיקרומטר, (J) 20 x 20 מיקרומטר ו -( K) 2.24 x 2.24 מיקרומטר. הריבוע השחור ב- (I) מסמן את האזור בתמונה (J). הריבוע השחור ב-( J) מסמן את האזור בתמונה (K). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: ניטור חלוקת תאי S. aureus באמצעות AFM-IR. (A-D)תמונות AFM של תא S. aureus המציגות היווצרות של מחיצה לפני חלוקת התא. גודל השטח בתמונה: 2 x 2 מיקרומטר. התמונות נבחרו מסדרה גדולה יותר (12 תמונות שנרשמו כל 20 דקות) ומייצגות נתונים שנרשמו כל 40 דקות. (E-F) גובה ותמונת הסטה שנרשמו בסוף היווצרות מחיצת תאים עם נקודות איסוף מסומנות של ספקטרום AFM-IR. גודל האזור בתמונה 1.17 x 1.15 מיקרומטר. גובה המבנה החדש הוא 45 ננומטר. (G)ספקטרום AFM-IR שנרשם מאזור התא (שחור) ואזור מחיצה (אדום) (מסומן ב-( F)),בטווח 1400-900 ס”מ-1. שתי הספקטרום מנורמלו לרצועת האמיד I והפגינו עלייה בעוצמה היחסית של רכיבי דופן התא מהמחיץ. נתון זה שונה מ ק. קוצ’אן ואח ’22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: סקירה כללית של העיצוב הניסיוני למחקר AFM-IR של עמידות מיקרוביאלית. (א)מקור מדגם והכנה ראשונית: זן הורה רגיש נאסף מחולה לפני טיפול אנטיביוטי והזן העמיד לבתו הגיע מאותו מטופל לאחר טיפול אנטיביוטי וכישלון קליני (בהתפתחות עמידות ל- vivo). חיידקים היו מבודדים ותרבית על אגר עירוי לב (HI) במשך 16 שעות ב 37 °C (50 °F). (B)הכנת מדגם לאחר מכן עבור AFM-IR, כולל איסוף של המדגם ואחריו שטיפת משטח חיידקים (3×) ותצהיר מדגם. (C)איסוף וניתוח נתונים AFM-IR: גובה AFM וספקטרום AFM-IR (1800-900 ס”מ-1). גודל האזור בתמונה של AFM: 1.7 x 1.4 מיקרומטר. ספקטרום AFM-IR נאסף מאמצע התא. הנתונים נותחו לאחר מכן באמצעות גישות כימותרפיות, כולל ניתוח אשכול הירארכי. נתון זה שונה מ ק. קוצ’אן ואח ’19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: תוצאות AFM ו- AFM-IR של מחקר שינויים כימיים בוונקומיצין ביניים S. aureus (VISA) בהשוואה לוונקומיצין רגיש S. aureus (VSSA) בזוגות קליניים. תמונות AFM של (A-B) ויזה ו – (C) VSSA דגימות תא יחיד. גודל האזורים המדוונים: (A,C) 40 x 40 מיקרומטר, (B) 2.56 x 2.45 מיקרומטר. (D-E) ספקטרום AFM-IR ממוצע ונגזרות השניות שלהם (F-G) עבור: (D, F) ויזה ו -( E,G) VSSA תאים, בטווח הספקטרלי 1800-900 ס”מ-1. הספקטרום המוצג הוא בממוצע 81 (ויזה) ו 88 (VSSA) ספקטרום אישי ומוצגים יחד עם סטיית תקן (SD). הממוצע נערך לאחר נורמליזציה של כל הספקטרום האישי יחד. הלהקות הגדולות מסומנות ב-( F-G). נתון זה שונה מ ק. קוצ’אן ואח ’19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: התמונה נסחפת מעל רישום רציף של מפות AFM-IR בערכי מספר גלים נבחרים עבור תא S. aureus.  (שורה עליונה):תמונות AFM נרשמו בו-זמנית עם מפות AFM-IR המתאימות(שורה תחתונה)בהתבסס על עוצמת אות ה- IR בערכי מספר הגלים שנבחרו. ערכי מספר הגלים (966, 1055, 1079, 1106, 1234, 1398, 1454, 1540, 1656, 1740 ס”מ-1) מובאים מעל השורה התחתונה. כל ערכה (תמונת AFM ומפת AFM-IR) נרשמה מיד לאחר התמונה הקודמת (כ-40 דקות לכל ערכה). גודל האזור בתמונה/ממופה: 1.54 x 1.57 מיקרומטר. נסחף ברור נראה בין התמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

התועלת של ספקטרוסקופיית IR לאפיון מגוון רחב של דגימות ביולוגיות בהקשר של ההרכב הכימי שלהם מבוססת היטב. במהלך העשור האחרון, ספקטרוסקופיית IR הופיעה ככלי מבטיח למחקרי חיידקים12,13,14,15,16,17. זה ממשיך למשוך עניין משמעותי בתחום המיקרוביולוגיה, כאחת הטכניקות הבודדות המאפשרות אפיון פנוטיפי באמצעות ההרכב הכימי. בהקשר זה, החיסרון העיקרי של מיקרוסקופיה FTIR קונבנציונלית טמון ברזולוציה מרחבית מוגבלת, מניעת תאים בודדים ומחקרים תת תאיים של חיידקים. למעשה, הגודל הקטן של חיידקים מייצג מכשול לא רק עבור IR, אבל עבור הרוב המכריע של טכניקות. לפיכך, כלי המחקר הזמינים למחקרים של תאים בודדים ותת-תאיים של חיידקים מוגבלים באופן משמעותי. השילוב של AFM עם IR מאפשר להתגבר על מגבלת הרזולוציה המרחבית של ספקטרוסקופיית IR, ומספק כלי חדשני למחקר חיידקי, המסוגל לחקור ננומטרי של ההרכב הכימי.

הטכניקה אינה מוגבלת למחקרי תאים בודדים ומאפשרת לחקור מגוון דגימות, החל בעובי. ללא ספק, הכנת מדגם נקי וזהיר היא קריטית להשגת תמונות באיכות גבוהה. הפרוטוקול כאן מספק שיטה להכנת דגימות מרובות שכבות, מונונייטר ו/או תאים בודדים של חיידקים שונים(איור 1). המדגם המוכן תלוי במספר גורמים, כולל עומס החיידקים הראשוני, דילול לאחר הכביסה וכן דילול נוסף על המצע. כמות המדגם המתקבלת לאחר דילול הכדורים שנשטפו ולפני התצהיר על המצע בדרך כלל מאפשרת הכנת דגימות רבות. לכן, כדי להשיג את ההתפלגות הרצויה של המדגם על המצע, זה לעתים קרובות מועיל להכין סדרה של דגימות, החל דילול שלהם. עבור מחקרים שמטרתם איסוף ספקטרום AFM-IR ולא הדמיה תת-תאית, שינוי כמות המדגם (למשל, מ monolayer כדי multilayer) עשוי להיות מועיל כדי להגדיל את עוצמת האות.

היבט קריטי נוסף בהכנת המדגם הוא הסרה מתאימה של שיורית בינונית. בהתאם לשיטות פולחן מדגם שנבחר, המדגם נאסף או מדיום נוזלי או מצלחת אגר. בשני המקרים, השיורית הבינונית צפויה להיות נוכחת במדגם, אם כי במידה פחותה בהרבה באיסוף מלוחות אגר. כמו מדיה צמיחה חיידקית מכילים שפע של מרכיבים ביולוגיים שונים, זה קריטי כדי להבטיח הסרה מתאימה של בינוני. אנו ממליצים על שלוש שטיפות עם מים אולטרה-מתאים לדגימות צלחת אגר ולפחות ארבע שטיפות לדגימות שנאספו מבינוני. ניתן להגדיל את מספר הכביסות, במידת הצורך; עם זאת, לשם השוואה בין דגימות שונות, חשוב לשמור אותו עקבי בין דגימות. הפרוטוקול המודגם משתמש במים, ולא בממסים כגון תמיסת חיץ פוספט (PBS) או תמיסת מלח. הן PBS והן מלוחים מובילים להיווצרות גבישים עם ייבוש אוויר, אשר יכול לפגוע בחיידקים. בנוסף, שניהם מקור של רצועות אינפרא-אדום אינטנסיביות, עם PBS, בפרט, המכיל רצועות מרובות באזור טביעת האצבע. חוסר היכולת לשימוש מלוח או PBS, מייצג כיום מגבלה חשובה עבור הטכניקה. בדרך כלל, השימוש במים לשטיפה אינו גורם להשפעה הרסנית על החיידקים; עם זאת, יש לנקוט זהירות, ואם אפשר, זמן החשיפה למים צריך להיות מוגבל. אם פרוטוקול הכנת המדגם צריך להיות מושהה בשלב הכביסה, מומלץ להשאיר את המדגם בצורה גלולה לאחר הסרת המים. זה בעל חשיבות מיוחדת עבור חיידקים גרם שלילי, המכיל קיר תא דק יותר כפי שהם נוטים יותר לקרע.

כדי להבטיח נתוני AFM-IR נאותים ואיכותיים, מספר היבטים בפרוטוקול איסוף הנתונים הם בעלי חשיבות קריטית. ראשית, האוסף הנכון של הרקע חיוני לרכישת נתונים. בפרט, יש צורך בשמירה על רמות לחות יציבות לאורך כל איסוף הרקע, כמו גם בין רקע לאיסוף דוגמאות. כדי להבטיח זאת, אנו ממליצים לטהר את המכשיר עם חנקן ולשמור על רמות הלחות לא גבוהות מ 25%. חוסר טיהור יכול להטיל מגבלה משמעותית, במיוחד במקומות עם לחות גבוהה. שנית, יש להדגיש את החשיבות של אופטימיזציה נכונה של כתמי IR. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, ידע מראש על המיקום של מקסימה הלהקה יכול להיות מועיל. לדוגמה, ספקטרום IR קונבנציונלי של כדורי חיידקים יכול לשמש כדי לקבוע עמדות של רצועות צפויות מדגם. אם זה לא אפשרי לרכוש, כגישה חלופית, המשתמש יכול להשתמש בספקטרום IR זמין בספרות או להתחיל את האופטימיזציה באמצעות עמדת הלהקה כי סביר לצפות בחיידק (למשל, amide I ו amide II). שלישית, לאיסוף נתונים, חשוב להדגיש את המשמעות של בחירת כוח זהירה (המאפשרת להשיג יחס S/ N טוב), שכן היא יכולה להיות בעלת השפעה הרסנית. הכוח המ מומלץ תלוי בעובי המדגם, עם הדרכה גסה הזמינה במדריך המכשיר31. אנו ממליצים לבחון אמפירית את מצב המדגם לאחר המדידה על ידי איסוף תמונת AFM, שכן היא תחשוף כל השפעה הרסנית. יתר על כן, האוסף של תמונות AFM מאותו אזור לפני ואחרי איסוף ספקטרום AFM-IR משמש אישור טוב לכך שלא התרחשה סחיפה והספקטרום אכן מקורו בנקודה שנבחרה בתא. האפשרות להיסחף חשובה במיוחד בעת החלת אודל ההדמיה, באמצעות הדמיה רצופה של עוצמת אינפרקט ב ערכי wavenumber נבחרים. דוגמה לכך מודמחת באיור 5. האזור המוגדר הוגדר בתחילת הניסוי ונועד להיות עקבי עבור כל ערכי מספר הגלים. עם זאת, סחיפה ברורה נראית בין כל תמונת גובה AFM (ועוצמת ה- IR wavenumber המתאימה), עם זמן רכישה של כל מפה של כ -40 דקות. בשל כך, עבור משתמשים האוספים נתוני הדמיה, אנו ממליצים תמיד לבחור אזור מעט גדול יותר מדגם העניין, כדי להבטיח שגם עם קיומו של סחיפה, מדגם העניין יישאר בתוך האזור המדומם.

המגבלות הפוטנציאליות של הפרוטוקול כוללות את חוסר היכולת לאסוף נתונים במצב hydrated בפתרונות פיזיולוגיים (למשל, מלוחים או PBS) המתואר לעיל. יתר על כן, במיוחד באזורי לחות גבוהה, לעתים קרובות יש צורך טיהור חנקן. יתר על כן, הפרוטוקול מאפשר לחקור אורגניזמים עד 100 ננומטר בגודל, למעט האפשרות של השימוש בו עבור מבנים קטנים יותר. למרות שניתן להתגבר על כך באמצעות לייזר אחר (למשל, לייזר מפל קוונטי המאפשר להשיג את הרזולוציה המרחבית של 20 ננומטר), הוא קשור גם לטווח ספקטרלי מוגבל כמו גם לקשיים בהשגת יחס אות לרעש טוב. לבסוף, תבחן משטחים רכים עשויה להוות אתגר כאשר הקצה אינו מזהה את פני השטח כראוי וממשיך מעבר לנקודת המגע, עד שבירה. למרות שזה בדרך כלל לא בעיה עם דגימות חיידקים, זה עלול להתרחש על מדידות של דגימות רכות יותר. במקרים כאלה, מומלץ לנסות לעסוק על משטח נקי של המצע בסמיכות לדגימה.

הפרוטוקול המתואר יכול לשמש עבור סוגים רבים של מחקר חיידקי, כולל מחקרים השוואתיים בין דגימות שונות, כמו גם בדיקה תת תאית. הנתונים ניתן לנתח באמצעות גישות כימותרפיות עבור ספקטרום יחיד ומודלים הדמיה35, בהתאם למטרה של המחקר. יתר על כן, הפרוטוקול יכול להיות שונה גם ליישום לחומר ביולוגי אחר (כגון פטריות, שמרים, תאים, וכו ‘), באמצעות תוספת של קיבעון.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנחנו רוצים להודות לברוקר על תמיכתם. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת מונאש לקידום מענק הצלחת נשים (ק. קוצ’ן). A.Y.P מכיר בתמיכתה של מלגת מתרגלים של המועצה הלאומית לבריאות ולמחקר רפואי באוסטרליה (APP1117940). עבודה זו מומנה על ידי פרויקט דיסקברי של מועצת המחקר האוסטרלית DP180103484. ברצוננו להודות למר פינלי שנקס על תמיכתו האינסטרומנטלית ולגברת קסניה קוסטוליאס על עזרתה הטכנית בדגימות.

Materials

AFM metal specimen disc PST ProSciTech Pty Ltd GA530-15 Recommended 15 mm
Anasys AFM-IR nanoIR2 Anaysys Instruments 0 model: nanoIR2
Contact mode NIR2 Probes for nanoIR 2 Bruker / Anasys Instruments – Model: Model: PR-EX-NIR2
Heraeus Pico 17 Microcentrifuge Thermo Scientific – –
Matlab Mathworks Inc – Multivariate data analysis software
Micro-centrifuge tubes, 1.5 mL Heathrow Scientific  HEA4323 Can be replaced with any other micro-centrifuge tube
NanoIR 2 instrument Bruker / Anasys Instruments – –
PLS toolbox Mathworks Inc – GUI for Matlab
Selected bacterial medium (e.g. HBA Columbia Plates) Thermo Fisher PP2001 Provided type of medium is an example and can be replaced by others, depending on the type of experiment
Selected bacterial strain – – The source depends on the aim of research (patient isolates, ATCC strains, etc.)
Substrate (e.g. Raman grade CaF2) Crystran CAFP13-2R Recommended size: 13 mm Ø x 2.0 mm
Tip pipette 1000 µl Axygen T-1000-B –
Tip pipette 200 µl Axygen T-200-C –
Tip pipette 0.5-10 µl Axygen T-300-R –
Ultrapure water – – –
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sears, C. L. A dynamic partnership: celebrating our gut flora. Anaerobe. 11 (5), 247-251 (2005).
  2. Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
  3. Seymour, C. W., et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. The New England Journal of Medicine. 376 (23), 2235-2244 (2017).
  4. Weiss, S. L., et al. Delayed antimicrobial therapy increases mortality and organ dysfunction duration in pediatric sepsis. Critical Care Medicine. 42 (11), 2409-2417 (2014).
  5. Peker, N., Couto, N., Sinha, B., Rossen, J. W. Diagnosis of bloodstream infections from positive blood cultures and directly from blood samples: recent developments in molecular approaches. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 24 (9), 944-955 (2018).
  6. Aminov, R. I. The role of antibiotics and antibiotic resistance in nature. Environmental Microbiology. 11 (12), 2970-2988 (2009).
  7. Levy, S. B., Marshall, B. Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses. Nature Medicine. 10 (12), 122-129 (2004).
  8. Roca, I., et al. The global threat of antimicrobial resistance: science for intervention. New Microbes and New Infections. 6, 22-29 (2015).
  9. O’Neill, J. The review on antimicrobial resistance. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. Wellcome Trust. , (2016).
  10. Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what’s new. Current Opinion in Microbiology. 21, 45-50 (2014).
  11. Piddock, L. J. Assess drug-resistance phenotypes, not just genotypes. Nature Microbiology. 1 (8), 16120 (2016).
  12. Naumann, D., Helm, D., Labischinski, H. Microbiological characterizations by FT-IR spectroscopy. Nature. 351 (6321), 81-82 (1991).
  13. Zarnowiec, P., Lechowicz, L., Czerwonka, G., Kaca, W. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) as a tool for the identification and differentiation of pathogenic bacteria. Current Medicinal Chemistry. 22 (14), 1710-1718 (2015).
  14. Quintelas, C., Ferreira, E. C., Lopes, J. A., Sousa, C. An overview of the evolution of infrared spectroscopy applied to bacterial typing. Biotechnology Journal. 13 (1), 1700449 (2018).
  15. San-Blas, E., Cubillán, N., Guerra, M., Portillo, E., Esteves, I. Characterization of xenorhabdus and photorhabdus bacteria by Fourier transform mid-infrared spectroscopy with attenuated total reflection (FT-IR/ATR). Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 93, 58-62 (2012).
  16. Sousa, C., et al. Discrimination of the acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex species by Fourier transform infrared spectroscopy. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 33 (8), 1345-1353 (2014).
  17. Rodriguez-Saona, L. E., Khambaty, F. M., Fry, F. S., Calvey, E. M. Rapid detection and identification of bacterial strains by Fourier transform near-infrared spectroscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 49 (2), 574-579 (2001).
  18. Dawson, S. E., et al. Implementation of Fourier transform infrared spectroscopy for the rapid typing of uropathogenic Escherichia coli. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 33 (6), 983-988 (2014).
  19. Kochan, K., et al. Detection of Antimicrobial Resistance-Related Changes in Biochemical Composition of Staphylococcus aureus by Means of Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15397-15403 (2019).
  20. Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and Applications in Nanoscale Infrared Spectroscopy and Chemical Imaging. Chemical Reviews. 117 (7), 5146-5173 (2017).
  21. Dazzi, A., et al. AFM-IR: combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66 (12), 1365-1384 (2012).
  22. Kochan, K., et al. et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria. Journal of the Royal Society, Interface. 15 (140), (2018).
  23. Katzenmeyer, A. M., et al. Mid-infrared spectroscopy beyond the diffraction limit via direct measurement of the photothermal effect. Nanoscale. 7 (42), 17637-17641 (2015).
  24. . Bruker Life Science Applications Available from: https://www.bruker.com/products/surface-and-dimensional-analysis/nanoscale-infrared-spectrometers/nanoscale-ir-spectroscopy-applications/life-sciences.html (2020)
  25. Mayet, C., Dazzi, A., Prazeres, R., Ortega, J. M., Jaillard, D. In situ identification and imaging of bacterial polymer nanogranules by infrared nanospectroscopy. Analyst. 135 (10), 2540-2545 (2010).
  26. Baldassarre, L., et al. Mapping the amide I absorption in single bacteria and mammalian cells with resonant infrared nanospectroscopy. Nanotechnology. 27 (7), 075101 (2016).
  27. Vitry, P., et al. Combining infrared and mode synthesizing atomic force microscopy: Application to the study of lipid vesicles inside Streptomyces bacteria. Nano Research. 9 (6), 1674-1681 (2016).
  28. Dazzi, A., et al. Chemical mapping of the distribution of viruses into infected bacteria with a photothermal method. Ultramicroscopy. 108 (7), 635-641 (2008).
  29. Steenbergen, J. N., Alder, J., Thorne, G. M., Tally, F. P. Daptomycin: a lipopeptide antibiotic for the treatment of serious Gram-positive infections. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 283-288 (2005).
  30. Garcia, L. S. MacFarlan Standards. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 3rd Edition. , (2010).
  31. NanolR-2 System Manual. Anasys Instruments Available from: https://www.anasysinstruments.com/downloadpr/nanoIR2_s_System_Manual.pdf (2020)
  32. Whelan, D. R., et al. Detection of an en masse and reversible B- to A-DNA conformational transition in prokaryotes in response to desiccation. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (97), 20140454 (2014).
  33. McGuinness, W. A., Malachowa, N., DeLeo, F. R. Vancomycin Resistance in Staphylococcus aureus. The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (2), 269-281 (2017).
  34. Howden, B. P., Peleg, A. Y., Stinear, T. P. The evolution of vancomycin intermediate Staphylococcus aureus (VISA) and heterogenous-VISA. Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 21, 575-582 (2014).
  35. Perez-Guaita, D., et al. Multispectral Atomic Force Microscopy-Infrared Nano-Imaging of Malaria Infected Red Blood Cells. Analytical Chemistry. 90 (5), 3140-3148 (2018).

Tags

AI WriterAFM-IRNanoscale AnalysisBacteriaAntimicrobial ResistanceSample PreparationAFM-IR Spectroscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Kochan, K., Peleg, A. Y., Heraud, P., Wood, B. R. Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry. J. Vis. Exp. (163), e61728, doi:10.3791/61728 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image