Изоляция гистона от ткани листьев сорго для Top Down Масс Спектрометрия Профилирование потенциальных эпигенетических маркеров
Summary
Протокол был разработан для эффективного извлечения нетронутыми гистонами из материалов листьев сорго для профилирования гистон пост-переводных модификаций, которые могут служить потенциальными эпигенетическими маркерами для оказания помощи инженерных засухоустойчивых культур.
Abstract
Гистоны принадлежат к семейство высокосхраняемых белков в эукариотах. Они упаковывают ДНК в нуклеосомы как функциональные единицы хроматина. Пост-трансляционные модификации (ПТМ) гистонов, которые являются высокодинамических и могут быть добавлены или удалены ферментами, играют важную роль в регулировании экспрессии генов. В растениях эпигенетические факторы, в том числе гистон ПТМ, связаны с их адаптивной реакцией на окружающую среду. Понимание молекулярных механизмов эпигенетического контроля может принести беспрецедентные возможности для инновационных биоинженерных решений. В этом случае мы описываем протокол изоляции ядер и очистки гистонов от тканей листьев сорго. Извлеченные гистоны могут быть проанализированы в их неповрежденных формах с помощью масс-спектрометрии сверху вниз (MS) в сочетании с онлайн обратной фазой (RP) жидкой хроматографией (LC). Комбинации и стоихиометрия нескольких ПТМ на одной и той же протеоформе гистона могут быть легко идентифицированы. Кроме того, отрезание хвоста гистона может быть обнаружено с помощью рабочего процесса LC-MS сверху вниз, что дает глобальный профиль PTM основных гистонов (H4, H2A, H2B, H3). Ранее мы применяли этот протокол для определения гистоновых ПТМ из тканей листьев сорго, собранных в ходе крупномасштабного полевого исследования, направленного на выявление эпигенетических маркеров засухоустойчивости. Протокол потенциально может быть адаптирован и оптимизирован для хроматина иммунопреципиентации секвенирования (ChIP-seq), или для изучения гистон PTMs в аналогичных растений.
Introduction
Увеличение тяжести и частоты засухи, как ожидается, повлияет на производительность зерновыхкультур 1,2. Сорго является зерновых продуктов питания и энергии культур известен своей исключительной способностью выдерживать ограничения водыусловиях 3,4. Мы преследуем механистическое понимание взаимодействия между засухой, развитием растений и эпигенетикой растений соргои двухцветного сорго (L.) Moench. Наша предыдущая работа продемонстрировала сильную связь между микробиомом растений и корневища при акклиматизации засухи иреакциями на молекулярном уровне 5,6,7. Это исследование проложит путь для использования эпигенетической инженерии в адаптации сельскохозяйственных культур к будущим климатическим сценариям. В рамках усилий по пониманию эпигенетики мы стремимся изучить белковые маркеры, которые влияют на экспрессию генов в организме растения.
Гистоны принадлежат к высоко сохраниваемому семейство белков в эукариотах, которые упаковывают ДНК в нуклеосомы в качестве основных единиц хроматина. Пост-трансляционные модификации (ПТМ) гистонов динамически регулируются для контроля структуры хроматина и влияния на экспрессию генов. Как и другие эпигенетические факторы, в том числе метилирование ДНК, гистон PTMs играют важную роль во многихбиологических процессах 8,9. Анализы на основе антител, такие как западные помарки, широко используются для выявления и количественной оценки гистоновых ПТМ. Кроме того, взаимодействие гистона ПТМ и ДНК может быть эффективно исследовано иммунопреципиентацией хроматина – секвенированием (ChIP-seq)10. В ChIP-seq хроматин с специфическим целевым гистоном PTM обогащается антителами против этого конкретного PTM. Затем фрагменты ДНК могут быть освобождены от обогащенного хроматина и секвенированы. Выявлены области генов, взаимодействующих с целевым гистоном PTM. Однако все эти эксперименты в значительной степени опираются на высококачественные антитела. Для некоторых вариантов гистон / омологов или комбинаций ПТМ, разработка надежных антител может быть чрезвычайно сложной задачей (особенно для нескольких ПТМ). Кроме того, антитела могут быть разработаны только в том случае, если целевой гистон PTM известен. 11 Поэтому необходимы альтернативные методы нецелесохозяемого глобального профилирования Гистоновых ПТМ.
Масс-спектрометрия (MS) является дополнительным методом для характеристики гистон PTMs, в том числе неизвестных ПТМ, длякоторых антитела не доступны 11,12. Устоявшийся “снизу вверх” MS рабочий процесс использует протеасы для переваривания белков в небольших пептидов до жидкой хроматографии (LC) разделения и обнаружения MS. Поскольку гистоны имеют большое количество основных остатков (лизин и аргинин), пищеварение трипсина (протеаза, специфичная для лизина и аргинина) в стандартном рабочем процессе снизу вверх разрезает белки на очень короткие пептиды. Короткие пептиды технически трудно анализировать стандартными LC-MS, и не сохраняют информацию о подключении и стоихиометрии нескольких ПТМ. Использование других ферментов или химической маркировки для блокирования лизинов генерирует более длинные пептиды, которые больше подходят для характеристики гистон PTMs13,14.
Кроме того, шаг пищеварения может быть полностью опущен. В этом “сверху вниз” подход, нетронутыми ионов белка вводятся в MS электроспрей ионизации (ESI) после онлайн разделения LC, что дает ионы нетронутыми протеоформов гистона. Кроме того, ионы (т.е. протеоформы), представляющие интерес, могут быть изолированы и фрагментированы в масс-спектрометре для получения последовательности ионов для идентификации и локализации PTM. Таким образом, сверху вниз MS имеет преимущество, чтобы сохранить информацию на уровне протеоформ и захватить подключение нескольких PTMs и терминальных усечений на той жепротеоформы 15,16. Эксперименты сверху вниз могут также предоставить количественную информацию и предложить понимание биомаркеров на нетронутом уровне белка17. В этом случае мы описываем протокол для извлечения гистона из листьев сорго и анализа неповрежденных гистонов сверху вниз LC-MS.
Примерные данные, показанные на рисунке 1 и рисунке 2, являются данными из листьев сорго, собранных на второй неделе после посадки. Хотя ожидается изменение урожайности, этот протокол, как правило, агностик к конкретным условиям выборки. Тот же протокол был успешно использован для тканей листьев растений сорго, собранных из 2, 3, 5, 8, 9 и 10 недель после посадки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный протокол описывает, как извлечь гистоны из листьев сорго (или, в более общем плане, листьев растений) образцов. Средняя урожайность гистона, как ожидается, будет 2-20 мкг на 4-5 г материала листьев сорго. Материалы достаточно чисты для анализа гистона вниз по течению LC-MS (в осн…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Рональда Мура и Томаса Филлмора за помощь в экспериментах по масс-спектрометрии, а Также Мэтью Монро за осаждение данных. Это исследование финансировалось за счет грантов Министерства энергетики США (DOE) биологических и экологических исследований в рамках эпигенетического контроля засухи ответ в Сорго (EPICON) проекта под номером премии DE-SC0014081, от Министерства сельского хозяйства США (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), а также через Объединенный институт биоэнергетики (JBEI), объект, спонсируемый DOE (контракт DE-AC02-05CH11231) между Национальной лабораторией Лоуренса Беркли и Министерством здравоохранения. Исследование проводилось с использованием Лаборатории экологических молекулярных наук (EMSL) (grid.436923.9), Управления научных пользователей, спонсируемого Управлением биологических и экологических исследований.
Materials
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).
- Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock. Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).
- Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. Sorghum bicolor – an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture. Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).
- Xu, L., et al. Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).
- Gao, C., et al. Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities. ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).
- Gao, C., et al. Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses. Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative proteomic analysis of histone modifications. Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies. Methods in Molecular Biology. 1528, 121-148 (2017).
- Maile, T. M., et al. Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).
- Dang, X., et al. The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report. Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).
- Schaffer, L. V., et al. Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry. Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).
- Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. High-throughput quantitative top-down proteomics. Molecular Omics. , (2020).
- Varoquaux, N., et al. Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Zhou, M., et al. Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1507, 153-168 (2017).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- LeDuc, R. D., et al. The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).
- Fornelli, L., et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).
- Sun, R. X., et al. pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification. Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).
- Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).
- Zhou, M., et al. Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation. Methods. , (2019).
- Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells. Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).
- Zheng, Y., et al. Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).
- Tian, Z., et al. Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications. Genome Biology. 13 (10), (2012).
- Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).
- Gargano, A. F. G., et al. Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).
