Isolierung von Histon von Sorghum Blattgewebe für Top Down Mass Spektrometrie Profilierung von potenziellen epigenetischen Markern
Summary
Das Protokoll wurde entwickelt, um intakte Histone effektiv aus Sorghumblattmaterialien für die Profilierung von histonenposttranslationalen Modifikationen zu extrahieren, die als potenzielle epigenetische Marker dienen können, um die Konstruktion von dürreresistenten Kulturen zu unterstützen.
Abstract
Histone gehören zu einer Familie von hochkonservierten Proteinen in Eukaryoten. Sie packen DNA als funktionelle Chromatineinheiten in Nukleosomen ein. Posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Histonen, die hochdynamisch sind und durch Enzyme hinzugefügt oder entfernt werden können, spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Genexpression. In Pflanzen stehen epigenetische Faktoren, einschließlich Histon-PTMs, im Zusammenhang mit ihren adaptiven Reaktionen auf die Umwelt. Das Verständnis der molekularen Mechanismen der epigenetischen Kontrolle kann beispiellose Chancen für innovative Bioengineering-Lösungen mit sich bringen. Hierin beschreiben wir ein Protokoll, um die Kerne zu isolieren und Histone aus Sorghumblattgewebe zu reinigen. Die extrahierten Histone können in ihren intakten Formen durch Top-Down-Massenspektrometrie (MS) gekoppelt mit der Online-Rektokphase (RP) Flüssigchromatographie (LC) analysiert werden. Kombinationen und Stoichiometrie mehrerer PTMs auf demselben Histonproteoform können leicht identifiziert werden. Darüber hinaus kann Histonschwanzclipping mit dem Top-Down-LC-MS-Workflow erkannt werden, wodurch das globale PTM-Profil von Kernhistonen (H4, H2A, H2B, H3) entsteht. Wir haben dieses Protokoll zuvor angewendet, um Histon-PTMs aus Sorghumblattgewebe zu profilieren, das aus einer groß angelegten Feldstudie gesammelt wurde, um epigenetische Marker der Dürreresistenz zu identifizieren. Das Protokoll könnte möglicherweise für die Chromatin-Immunpräzipationssequenzierung (ChIP-seq) oder für die Untersuchung von Histon-PTMs in ähnlichen Pflanzen angepasst und optimiert werden.
Introduction
Die zunehmende Schwere und Häufigkeit der Dürre dürfte sich auf die Produktivität der Getreidepflanzenauswirken 1,2. Sorghum ist eine Getreidenahrungs- und Energiepflanze, die für ihre außergewöhnliche Fähigkeit bekannt ist, wasserbegrenzenden Bedingungen standzuhalten3,4. Wir verfolgen ein mechanistisches Verständnis des Zusammenspiels von Dürrestress, Pflanzenentwicklung und Epigenetik von Sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench] Pflanzen. Unsere bisherige Arbeit hat starke Verbindungen zwischen Pflanzen- und Rhizosphärenmikrobiom bei der Dürreakklimatisierung und Reaktionen auf molekularer Ebene5,6,7gezeigt. Diese Forschung wird den Weg für die Nutzung epigenetischer Technik bei der Anpassung von Pflanzen an zukünftige Klimaszenarien ebnen. Als Teil der Bemühungen um das Verständnis der Epigenetik wollen wir Proteinmarker untersuchen, die die Genexpression innerhalb des Pflanzenorganismus beeinflussen.
Histone gehören zu einer hochkonservierten Familie von Proteinen in Eukaryoten, die DNA als grundlegende Chromatineinheiten in Nukleosomen verpacken. Posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Histonen werden dynamisch reguliert, um die Chromatinstruktur zu steuern und die Genexpression zu beeinflussen. Wie andere epigenetische Faktoren, einschließlich DNA-Methylierung, spielen Histon-PTMs eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen8,9. Antikörperbasierte Assays wie Western Blots wurden häufig verwendet, um Histon-PTMs zu identifizieren und zu quantifizieren. Darüber hinaus kann die Wechselwirkung von Histon-PTMs und DNA durch Chromatin-Immunpräzipitation – Sequenzierung (ChIP-seq)10effektiv untersucht werden. In ChIP-seq wird Chromatin mit spezifischem gezielten Histon PTM durch Antikörper gegen diese spezifische PTM angereichert. Dann können die DNA-Fragmente aus dem angereicherten Chromatin freigesetzt und sequenziert werden. Regionen von Genen, die mit dem gezielten Histon PTM interagieren, werden aufgedeckt. Alle diese Experimente sind jedoch stark auf hochwertige Antikörper angewiesen. Bei einigen Histonvarianten/Homologen oder Kombinationen von PTMs kann die Entwicklung robuster Antikörper (besonders bei mehreren PTMs) äußerst anspruchsvoll sein. Darüber hinaus können Antikörper nur entwickelt werden, wenn der gezielte Histon PTM bekannt ist. 11 Daher sind alternative Methoden für eine ungezielte, globale Profilierung von Histon-PTMs erforderlich.
Massenspektrometrie (MS) ist eine ergänzende Methode zur Charakterisierung von Histon-PTMs, einschließlich unbekannter PTMs, für die Antikörper nicht verfügbar sind11,12. Der etablierte “Bottom-up”-MS-Workflow verwendet Proteasen, um Proteine vor der Flüssigkeitschromatographie (LC) Trennung und MS-Erkennung in kleine Peptide zu verdauen. Da Histone eine große Anzahl von Grundrückständen (Lysin und Arginin) aufweisen, schneidet die Trypsinverdauung (proteasespezifisch für Lysin und Arginin) im Standard-Bottom-up-Workflow die Proteine in sehr kurze Peptide. Die kurzen Peptide sind technisch schwierig zu analysieren von Standard-LC-MS, und bewahren nicht die Informationen über die Konnektivität und Stoichiometrie von mehreren PTMs. Die Verwendung anderer Enzyme oder chemische Etikettierung zur Blockierung von Lysinen erzeugt längere Peptide, die besser für die Charakterisierung von Histon-PTMs13,14geeignet sind.
Alternativ kann der Verdauungsschritt komplett weggelassen werden. Bei diesem “Top-down”-Ansatz werden intakte Proteinionen durch Elektrospray-Ionisation (ESI) nach Online-LC-Trennung in die MS eingeführt, wodurch Ionen der intakten Histonproteoformen entstehen. Darüber hinaus können Ionen (d.h. Proteoformen) von Interesse isoliert und im Massenspektrometer fragmentiert werden, um die Sequenzionen zur Identifizierung und PTM-Lokalisierung zu erhalten. Daher hat MS von oben nach unten den Vorteil, die Informationen auf Proteoform-Ebene beizubehalten und die Konnektivität mehrerer PTMs und Terminalkürzungen auf derselben Proteoform15,16zu erfassen. Top-down-Experimente können auch quantitative Informationen liefern und Einblicke in Biomarker auf dem intakten Proteinlevel17bieten. Hierin beschreiben wir ein Protokoll, um Histon aus Sorghumblatt zu extrahieren und die intakten Histone von oben nach unten LC-MS zu analysieren.
Die in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellten Beispieldaten stammen aus Sorghumblättern, die in Woche 2 nach der Pflanzung gesammelt wurden. Obwohl eine Variation des Ertrags erwartet wird, ist dieses Protokoll im Allgemeinen agnostisch für bestimmte Probenbedingungen. Das gleiche Protokoll wurde erfolgreich für Sorghum Pflanzenblattgewebe von 2, 3, 5, 8, 9 und 10 Wochen nach der Pflanzung gesammelt verwendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorgestellte Protokoll beschreibt, wie Histonen aus Sorghumblattproben (oder allgemeiner Pflanzenblatt) proben extrahiert werden. Die durchschnittliche Histonausbeute wird voraussichtlich 2–20 g pro 4–5 g Sorghumblattmaterial betragen. Die Materialien sind ausreichend rein für die nachgeschaltete Histonanalyse durch LC-MS (meist Histone mit einer ribosomalen Proteinkontamination von 20 %). Aufgrund von Stichprobenvariationen oder möglichen Fehlbehandlungen/Fehlern im gesamten Protokoll kann ein geringerer Ertra…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Ronald Moore und Thomas Fillmore für die Unterstützung bei Massenspektrometrieexperimenten und Matthew Monroe für die Datenabscheidung. Diese Forschung wurde durch Stipendien des US Department of Energy (DOE) Biological and Environmental Research im Rahmen des Epigenetic Control of Drought Response in Sorghum (EPICON) Projekts unter der Nummer DE-SC0014081, vom US Department of Agriculture (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D) und über das Joint BioEnergy Institute (JBEI), eine vom DOE gesponserte Einrichtung (Vertrag DE-AC02-05CH11231) zwischen Lawrence Berkeley National Laboratory und DOE. Die Forschung wurde mit dem Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) (Grid.436923.9) durchgeführt, einer vom Office of Biological and Environmental Research gesponserten DOE Office of Science User Facility.
Materials
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
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