Spontan Hipokampal Ağ Aktivitesini Araştırmak için Akut Fare Beyin Dilimlemeyi

Canlı hipokampal dilimlerden in vitro elektrofizyolojik ölçüm, sayısız avantajı olan güçlü bir deneysel yaklaşımdır. Deneyci, dokudaki bireysel nöronlardan ölçümleri doğrudan görselleştirmek ve toplamak için bir mikroskop, mikromanipülatörler ve bir kayıt sistemi kullanabilir. Doku dilimleri ayrıca optogenetik, kemogenetik veya farmakolojik deneyler için fotostimülasyon veya ilaç teslimatı için çok erişilebilir.

Hipokampal ağ, hücredışı yerel alan potansiyeli 1 ,²,^3,4,5’tesalınımlar olarak görülebilen vivo yüksek senkron nüfus aktivitesi oluşturur. Beyin dilimi yöntemleri, bu nöronal ağ salınımlarının altında kalan hücresel ve devre mekanizmaları hakkında fikir edinmek için yararlanmıştır. Maier ve ark.’ın temel çalışmaları, keskin dalga dalga komplekslerinin (SWR’ ler) ventral hipokampus^6,7dilimlerinde kendiliğinden ortaya çıkabileceğini göstermiştir. Birden fazla araştırmacının sonraki çalışmaları, hipokampus⁸,^9,10’un ağ durumunu düzenlemede nöromodülatörlerin rolü ve daha önce in vivo^11’deki davranış sırasında aktif olan nöronal toplulukların in vitro yeniden aktasyonlarını yönlendiren sinaptik mekanizmalar da dahil olmak üzere SWR’lerin birçok yönünü yavaş yavaş aydınlattı. Beyin dilimi deneyleri ayrıca gama aralığı salınımı (30-100 Hz), bellek kodlamasını desteklediğine ve^{12 , 13}‘ü geri çağırdığına inanılan ayrı bir hipokampal ağ durumu hakkında fikir sağlamıştır. Son olarak, hipokampüsün ve ilişkili yapıların temporal lob epilepsisinin patofizyolojisyolojislerindeki merkezi rolünü kabul eden^14,15, araştırmacılar epileptiform aktivitenin neslini ve yayılmasını araştırmak için hipokampal dilim preparatlarını kullanmıştır. Carter ve arkadaşları, kronik epileptik hayvanlardan hazırlanan kombine hipokampal-entorhinal korteks dilimlerinin kendiliğinden in vitro^16’daepileptikform akıntılar oluşturabileceğini göstermiştir. Daha sonra Karlócai ve arkadaşları, hipokampal dilimlerde epileptiform deşarjların altında yatan mekanizmaları, değiştirilmiş iyon konsantrasyonlarına sahip modifiye yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) (mg²⁺ veya yükseltilmiş K⁺azaltılmış) veya eklenen ilaçlar (4AP veya gabazin)¹⁷kullanarak araştırdı.

Araştırmacılar anahtar şekillerde farklılık gösteren çok sayıda hipokampal dilim yaklaşımı geliştirmiştir: (1) dilimde bulunan hipokampüsün bölgesi (dorsal, orta veya ventral); (2) entorhinal korteks gibi ekstrahippocampal dokuların varlığı veya yokluğu; (3) dilimleri kesmek için kullanılan yönlendirme (koronal, sagittal, yatay veya eğik); ve (4) dilimlemeden sonra dokunun tutulduğu koşullar (ACSF’ye tamamen batırılmış veya ACSF ve nemlendirilmiş, karbojen bakımından zengin hava arayüzünde tutulur).

Hangi dilimleme yaklaşımının kullanılacağı deneysel amaç tarafından belirlenmelidir. Örneğin, sualtı koşullarında tutulan dorsal hipokampüsün enine veya koronal dilimleri intrahippocampal devre ve sinaptik plastisitenin araştırılması için çok etkili bir şekilde kullanılmıştır^18,19,20. Bununla birlikte, bu tür preparatlar kendiliğinden ventral hipokampus 21^,22,23’tendilimler kadar kolay ağ salınımları oluşturmaz. Kalıcı SWR aktivitesi durumu dorsal ve ventral hipokampus^24’tenenine dilimlerde tetanik stimülasyon ile indüklenebilir, spontan SWR’ler ventral dilimlerde daha kolay gözlenir^7,25.

Dorsal ve ventral hipokampus arasındaki doğal fizyolojik ve anatomik ayrım, hem in vivo hem de in vitro²⁶yapılan çalışmalarla desteklenmektedir. Sıçanlardaki kayıtlar, sırt ve ara hipokampus boyunca güçlü bir şekilde tutarlı teta ritimleri ortaya çıkardı, ancak ventral bölge ile hipokampüsün geri kalanı arasında zayıf tutarlılık²⁷. Vivo’daki SWR’ler sırt ve ara hipokampus arasında kolayca yayılırken, ventral hipokampustan kaynaklanan SWR’ler genellikle yerel kalır²⁸. Sırt ve ara hipokampusta bulunan CA3 piramidal nöronlardan kaynaklanan ilişkisel projeksiyonlar, hipokampüsün boyuna ekseni boyunca uzun mesafeler yansıtır. Ventral bölgelerden kaynaklanan CA3 projeksiyonları nispeten yerel kalır ve bu nedenle dilimleme işlemi sırasında kopma olasılığı daha düşüktür^29,30. Bu nedenle ventral dilimler, popülasyon senkron oluşturmak için gerekli yinelenen ağı daha iyi koruyabilir. Ventral dilimlerin in vitro spontan ağ aktiviteleri üretme eğilimi, daha dorsal bölgelere kıyasla piramidal nöronların daha yüksek içsel uyarılmazlığını veya ventral hipokampusta daha zayıf GABAerjik inhibisyonu yansıtabilir³¹. Gerçekten de, ventral hipokampal dilimler epileptiform aktiviteye daha duyarlıdır^32,33. Bu nedenle, spontan fizyolojik^8,9,11,24 veya patolojik^16,34,35,36 ağ salınımlarının birçok çalışması geleneksel olarak yatay bir dilimleme yaklaşımı kullanmıştır, bazen fronto-oksipital yönde hafif bir açı ile, ventral hipokampus enine düzlemine paralel doku dilimleri verir.

Dilimdeki birçok hücre kesileceği için ağ bağlantısı, dilimleme yordamı tarafından kaçınılmaz olarak etkileniyor. Dilim ve hazırlıkta tutulan dokunun açısı ve kalınlığı, ilgi çekici devrelerdeki bağlantıyı optimize etmek için düşünülmelidir. Birçok çalışma, fizyolojik veya patolojik ağ salınımları bağlamında iki yapı arasındaki etkileşimleri araştırmak için yatay kombine hipokampal-entorhinal korteks dilimlerini (HEC) kullanmıştır. Roth ve arkadaşları, SWR aktivitesinin HEC dilimi³⁷aracılığıyla yayılmasını göstermek için hipokampüsün CA1 alt alanı ve medial entorhinal korteksin V katmanından çift kayıt gerçekleştirdi. Epileptiform aktivitenin birçok çalışması, epileptiform deşarjların corticohippocampal ağ 16^,35 ,^36,38üzerinden nasıl yayıldığını araştırmak için HEC dilim hazırlığını kullanmıştır. Bozulmamış corticohippocampal döngünün korunmasının spontan SWR’ler, epileptikform deşarjlar veya gama salınımları için bir ön koşul olmadığını belirtmek önemlidir; ağ salınımları, dorsal veya ventral hipokampüsün enine dilimlerinde, bağlı parahippocampal dokular^{21 , 22 , 23,25,39, 40,41}ile üretilebilir. Hipokampal dilimlerdeki ağ salınımlarının spontan üretimi için daha önemli bir faktör, daha kalın bir dilim (400-550 μm) CA2 / CA3 tekrarlayan ağ²¹, 22 ,²⁵‘te daha fazla bağlantıyı^{koruyacağından,}her dilimin kalınlığı olabilir.

Açılı yatay HEC dilimleri (fronto-oksipital yönde yaklaşık 12 ° açı ile kesilmiş) corticohippocampal döngü^{11, 16,}34^,35,42fonksiyonel bağlantısını incelemek için kullanılmış olsa da, bu tür açılı preparatlar spontan ağ aktivitesi için gerekli değildir^43,44,45. Bununla birlikte, açılı bir dilimleme düzleminin kullanılması, araştırmacının aşağı veya yukarı doğru bir açı uygulanıp uygulanmadığına bağlı olarak, ventral veya ara hipokampüsün enine yönelimli lamelini en iyi şekilde koruyan dilimleri seçici olarak yapmasına izin verir (Şekil 1). Bu yaklaşım kavramsal olarak papatheodoropoulos ve ark., 2002 tarafından kullanılan benzerdir, kim her hipokampus ücretsiz parçaladı ve daha sonra tüm dorsal-ventral eksen boyunca enine dilimler oluşturmak için bir doku helikopteri kullandı²¹. Ventral ve dorsal-ara hipokampus arasındaki yukarıda belirtilen fonksiyonel ayrımlar ışığında, araştırmacılar deneyler tasarlarken veya sonuçları yorumlarken dilimlerin anatomik kökenini göz önünde bulundurmalıdır. Dilimleme işlemi sırasında bir agar rampası kullanmak, tercihen ara veya ventral hipokampustan dilimler üretmenin basit bir yoludur.

Hipokampal dilimler, batık bir bölmede (doku tamamen ACSF’ye batırılmış olarak) veya arayüz tarzı bir odada (örneğin, Oslo veya Haas odası, dilimler yalnızca ince bir akan ortam filmiyle kaplanmış olarak) muhafaza edilebilir. Arayüz bakımı, nöronal sağkalımını destekleyen ve yüksek düzeyde internöral aktiviteye izin veren dokunun oksijenlenmesini arttırır. Geleneksel olarak, batık kayıt koşulları, ağ düzeyinde salınımların istikrarlı bir şekilde ifade edilmesi için yeterli doku oksijenasyonu sağlamayan daha yavaş bir ACSF akış hızı kullanır. Batık hipokampal dilimlerde karbachol kaynaklı gama salınımları sadece geçici olarak^46,47, gözlenirken, arayüz kayıt odalarında¹⁰, 48^,49‘ da sıkıca tutulabilirler. Bu nedenle, karmaşık spontan aktivite in vitro ile ilgili birçok çalışma, keskin dalga dalgalanma kompleksleri 6 ,⁷, 8^,9^,10,25,37, gama salınımları 10 , 13 ve epileptiform aktivite^16,38,45,47‘yi araştırmak için arayüz kayıt odalarına güvendi.

Batık tarzdaki bir kayıt odasında, tek tek hücreleri görselleştirmek ve kayıtlar için sağlıklı görünen hücreleri seçici olarak hedeflemek için daldırma mikroskobu hedefi kullanılabilir. Batık preparat ayrıca hücresel milieu üzerinde ince kontrol sağlar, çünkü dalgıçlık ilaçların veya diğer bileşiklerin dokuya hızlı bir şekilde difüzyonunu kolaylaştırır. Bu nedenle, kararlı ağ salınımlarının batık koşullar altında sürdürüldüğü değiştirilmiş bir metodoloji güçlü bir deneysel yaklaşımı temsil eder. Bu yaklaşım, hipokampal dilimlerin dokuya oksijen beslemesini artırmak için yüksek acsf (~ 6 mL / dk) akış hızına sahip değiştirilmiş bir sualtı kayıt odasına transfer etmeden önce birkaç saat boyunca basitleştirilmiş bir arayüz tarzı tutma odasında iyileştiği Hájosve^ark.’ınçalışmasıyla örneklenmiştir. Bu koşullar altında, yüksek düzeyde internöron aktivitesi ve kararlı spontan ağ salınımları su altında bir kayıt odasında tutulabilir. Bu değiştirilmiş yaklaşım, araştırmacıların görsel olarak yönlendirilmiş tam hücre yama kelepçe kayıtları gerçekleştirmelerini ve morfolojik olarak tanımlanmış hücre tiplerinin karbachol kaynaklı gama salınımlarına katkısını karakterize etmelerini sağlar¹². SWR’ler, ACSF^11,48^,49hızlı akış hızına sahip batık hipokampal dilimlerde de kendiliğinden oluşabilir. Maier ve arkadaşları, batık bir kayıt odasına transfer edilmeden önce bir arayüz odasında kurtarılan hipokampal dilimlerin güvenilir bir şekilde spontan SWR’ler sergilediğini, oysa batık bir kayıt odasına transfer edilmeden önce bir behere batırılmış olarak kurtarılan dilimlerin daha küçük uyarılmış alan tepkileri, daha düşük spontan sinaptik akım seviyeleri gösterdiğini ve sadece çok nadiren spontan^SWR’lersergilediğini göstermiştir 43 . Schlingloff ve arkadaşları, parvalbumin ifade eden sepet hücrelerinin spontan SWR^44’ünneslindeki rolünü göstermek için bu geliştirilmiş metodolojiyi kullandı.

Aşağıdaki protokol, yatay hipokampal dilimlerdeki kendiliğinden aktif nöronların arayüz koşullarında kurtarılabileceği ve daha sonra farmakolojik veya optogenetik manipülasyonlar ve görsel olarak yönlendirilmiş kayıtlar için uygun bir su altında kayıt odasında tutulabileceği bir dilimleme yöntemi ssunuyor.