Akutt mus hjerne slicing å undersøke spontan hippocampal nettverksaktivitet

Elektrofysiologiske målinger fra levende hippocampal skiver in vitro er en kraftig eksperimentell tilnærming med mange fordeler. Eksperimentereren kan bruke et mikroskop, mikromanipulatorer og et opptakssystem for å visualisere og samle målinger direkte fra individuelle nevroner i vevet. Vevskiver er også svært tilgjengelige for fotostimulering eller legemiddellevering for optogenetiske, kjemiskogenetiske eller farmakologiske eksperimenter.

Hippocampal nettverket genererer svært synkron befolkningsaktivitet in vivo, synlig som svingninger i det ekstracellulære lokale feltet^{potensial 1,2,3,4,5}. Brain slice metoder har blitt utnyttet for å få innsikt i cellulære og krets mekanismer underliggende disse nevronale nettverk svingninger. Grunnleggende arbeid fra Maier et al. viste at skarpe bølge-krusning komplekser (SWRs) kan dukke opp spontant i skiver av ventral hippocampus^6,7. Etterfølgende studier fra flere forskere har gradvis belyst mange aspekter av SWRs, inkludert rollen som nevromodulatorer i å regulere nettverkstilstanden til hippocampus^{8,9,10 og} de synaptiske mekanismene som driver in vitro reaktivering av nevronale ensembler som tidligere var aktive under atferd in vivo¹¹. Hjerneskiver eksperimenter har også gitt innsikt i gamma rekkevidde oscillasjon (30-100 Hz), en distinkt hippocampal nettverkstilstand antas å støtte minne koding og tilbakekalling^12,13. Til slutt, gjenkjenne den sentrale rollen hippocampus og tilhørende strukturer i patofysiologien til temporal lobe epilepsi^14,15, forskere har brukt hippocampal skive preparater for å undersøke generering og forplantning av epileptiform aktivitet. Carter et al. demonstrerte at kombinerte hippocampal-entorhinal cortex skiver tilberedt av kronisk epileptiske dyr kan spontant generere epileptiform utslipp in vitro¹⁶. Deretter utforsket Karlócai et al. mekanismene underliggende epileptiform utslipp i hippocampal skiver ved hjelp av modifisert kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) med endrede isjonskonsentrasjoner (redusert Mg^{2 + eller} forhøyet K⁺) eller lagt narkotika (4AP eller gabazine)¹⁷.

Etterforskere har utviklet mange hippocampal skive tilnærminger som varierer på viktige måter: (1) regionen av hippocampus som finnes i stykket (dorsal, middels, eller ventral); (2) tilstedeværelse eller fravær av ekstrahippocampal vev som entorhinal cortex; (3) orienteringen som brukes til å kutte skiver (koronar, sagittal, horisontal eller skrå); og (4) forholdene der vevet opprettholdes etter kutting (nedsenket fullt ut i ACSF eller holdt i grensesnittet til ACSF og fuktet, karbagenrik luft).

Valget av hvilken kutte tilnærming til bruk bør bestemmes av det eksperimentelle målet. For eksempel har tverrgående eller koronale skiver av den dorsale hippocampus opprettholdt under nedsenket forhold blitt brukt svært effektivt for undersøkelse av intrahippocampal kretser og synaptisk plastisitet^18,19,20. Imidlertid genererer slike preparater ikke spontant nettverkssvingninger så lett som skiver fra ventral hippocampus^21,22,23. Selv om en tilstand av vedvarende SWR-aktivitet kan induseres ved tetanisk stimulering i tverrgående skiver fra dorsal og ventral hippocampus^24,observeres spontane SWRs lettere i ventrale skiver^7,25.

Et iboende fysiologisk og anatomisk skille mellom dorsal og ventral hippocampus støttes av studier utført både in vivo og in vitro²⁶. Opptak hos rotter avslørte sterkt sammenhengende theta rytmer gjennom dorsal og mellomliggende hippocampus, men dårlig sammenheng mellom ventral regionen og resten av hippocampus²⁷. SwRs in vivo forplanter seg lett mellom dorsal og mellomliggende hippocampus, mens SWRs som stammer fra ventral hippocampus ofte forblir lokale²⁸. De assosiasjonelle projeksjonene stammer fra CA3 pyramidale nevroner som bor i den dorsale og mellomliggende hippocampus prosjektet lange avstander langs den langsgående aksen av hippocampus. CA3-projeksjoner som kommer fra ventrale regioner forblir relativt lokale, og dermed er mindre sannsynlig å bli kuttet under^{kuttingsprosessen 29,30}. Ventrale skiver kan derfor bedre bevare det tilbakevendende nettverket som er nødvendig for å generere befolkningssynkronisering. Tilbøyeligheten til ventrale skiver for å generere spontane nettverksaktiviteter in vitro kan også gjenspeile høyere iboende spenning av pyramidale nevroner eller svakere GABAergic hemming i ventral hippocampus sammenlignet med mer dorsale regioner³¹. Ventrale hippocampalskiver er faktisk mer utsatt for epileptiform aktivitet^32,33. Dermed har mange studier av spontane^{fysiologiske 8,9,11,24} eller^{patologisk 16,34,35,36} nettverkssvingninger tradisjonelt brukt en horisontal kutting tilnærming, noen ganger med en liten vinkel i fronto-occipital retning, som gir vevskiver parallelt med det tverrgående planet av ventral hippocampus.

Nettverkstilkobling påvirkes uunngåelig av kuttprosedyren, da mange celler i stykket vil bli kuttet. Vinkelen og tykkelsen på skiven og vevet som beholdes i preparatet, bør vurderes for å optimalisere tilkoblingen i kretsene av interesse. Mange studier har benyttet horisontale kombinerte hippocampal-entorhinal cortex skiver (HEC) for å utforske interaksjoner mellom de to strukturene i sammenheng med fysiologiske eller patologiske nettverkssvingninger. Roth et al. utførte to opptak fra CA1-underfeltet i hippocampus og lag V av den mediale entorhinale cortex for å demonstrere forplantning av SWR-aktivitet gjennom HEC-skive³⁷. Mange studier av epileptiform aktivitet har brukt HEC skive forberedelse til å undersøke hvordan epileptiform utslipp forplanter seg gjennom kortikohippocampal nettverk^16,35,36,38. Det er viktig å merke seg at bevaring av intakt kortikohippocampal sløyfe ikke er en forutsetning for spontane SWRs, epileptiform utslipp, eller gamma svingninger; nettverkssvingninger kan genereres i tverrgående skiver av dorsal eller ventral hippocampus uten vedlagte parahippocampal vev^{21,22,23, 25,39,40,41}. En viktigere faktor for spontan generering av nettverkssvingninger i hippocampal skiver kan være tykkelsen på hver skive, som en tykkere skive (400-550 μm) vil bevare mer tilkobling i CA2 / CA3 tilbakevendende^{nettverk 21,22,25}.

Selv om vinklede horisontale HEC skiver (kuttet med en ca 12° vinkel i fronto-occipital retning) har blitt brukt til å studere funksjonell tilkobling av kortikohippocampal loop^{11,16,34,35,42}, slike vinklede preparater er ikke nødvendig for spontan nettverksaktivitet^43,44,45. Imidlertid tillater bruk av et vinklet skjæreplan utprøver å selektivt lage skiver som best bevarer den tverrgående orienterte lamelleren av enten ventral eller mellomliggende hippocampus, avhengig av om en nedadgående eller en oppadgående vinkel påføres (figur 1). Denne tilnærmingen er konseptuelt lik den som brukes av Papatheodoropoulos et al., 2002, som dissekerte hver hippocampus fri og deretter brukte et vevshelikopter for å lage tverrgående skiver langs hele dorsal-ventral^{aksen 21}. I lys av de nevnte funksjonelle forskjellene mellom ventral og dorsal-intermediate hippocampus, bør etterforskerne vurdere den anatomiske opprinnelsen til skiver når de utformer eksperimenter eller tolker resultater. Ved hjelp av en agarrampe under kuttingsprosedyren er en enkel måte å fortrinnsvis produsere skiver fra enten mellomliggende eller ventral hippocampus.

Hippocampal skiver kan opprettholdes i enten et nedsenket kammer (med vevet fullt nedsenket i ACSF), eller et grensesnitt-stil kammer (f.eks Oslo eller Haas kammer, med skiver dekket bare av en tynn film av flytende medier). Grensesnittvedlikehold forbedrer oksygenering av vevet, noe som fremmer nevronal overlevelse og gir mulighet for vedvarende høye nivåer av internuronal aktivitet. Tradisjonelt bruker nedsenkede opptaksforhold en langsommere ACSF-strømningshastighet som ikke gir tilstrekkelig vevs oksygenering for stabilt uttrykk for svingninger på nettverksnivå. I nedsenket hippocampal skiver carbachol-indusert gamma svingninger er bare observert^{forbigående 46,47}, mens de kan stabilt opprettholdes i grensesnitt opptakskamre^10,48,49. Som sådan har mange studier av kompleks spontan aktivitet in vitro stolt på grensesnittopptakskamre for å undersøke skarpbølgekrustningskomplekser^{6,7,8,9,10,25,37,}gammasvingninger^10,13og epileptiform aktivitet^16,38,45,47.

I et opptakskammer i nedsenket stil kan et mål om nedsenking av mikroskop brukes til å visualisere individuelle celler og selektivt målrette mot friske celler for opptak. Det nedsenkede preparatet gir også fin kontroll over det cellulære miljøet, da nedsenking letter rask diffusjon av narkotika eller andre forbindelser til vevet. Dermed representerer en modifisert metodikk der stabile nettverkssvingninger opprettholdes under nedsenkede forhold en kraftig eksperimentell tilnærming. Denne tilnærmingen er eksemplifisert av arbeidet til Hájos et al., der hippocampal skiver gjenopprette i et forenklet grensesnitt-stil holder kammer i flere timer før overføring til en modifisert nedsenket opptakskammer med en høy strømningshastighet på ACSF (~ 6 ml / min) for å forbedre oksygentilførselen til^{vevet 12,48,49}. Under disse forholdene kan høye nivåer av internuronaktivitet og stabile spontane nettverkssvingninger opprettholdes i et nedsenket opptakskammer. Denne modifiserte tilnærmingen gjør det mulig for etterforskerne å utføre visuelt veiledede helcellede patchklemmeopptak og karakterisere bidraget fra morfologisk identifiserte celletyper til karbachol-induserte gammasvingninger¹². SwRs kan også oppstå spontant i nedsenket hippocampal skiver med en rask strømningshastighet på ACSF^11,48,49. Maier et al. demonstrerte at hippocampal skiver som gjenopprettet i et grensesnittkammer før overføring til et nedsenket opptakskammer pålitelig utstilt spontane SWRs, mens skiver som gjenopprettet nedsenket i et beger før overføring til et nedsenket opptakskammer viste mindre fremkalte feltresponser, lavere nivåer av spontansynaptiske strømmer, og bare svært sjelden utstilt spontane SWRs⁴³. Schlingloff et al. brukte denne forbedrede metodikken til å demonstrere rollen som parvalbumin-uttrykkende kurvceller i generasjonen spontane SWRs⁴⁴.

Følgende protokoll presenterer en skjæremetode der spontant aktive nevroner i horisontale hippocampalskiver kan gjenopprettes under grensesnittforhold og deretter opprettholdes i et nedsenket opptakskammer egnet for farmakologiske eller optogenetiske manipulasjoner og visuelt veiledede opptak.