Острый мышь мозга нарезки для расследования спонтанной деятельности гиппокампа сети

Электрофизиологические измерения из живых ломтиков гиппокампа in vitro является мощным экспериментальным подходом с многочисленными преимуществами. Экспериментатор может использовать микроскоп, микроманипуляторы и систему записи для непосредственной визуализации и сбора измерений от отдельных нейронов в ткани. Ткань ломтики также очень доступны для фотостимуляции или доставки препарата для оптогенетических, химиогенетических или фармакологических экспериментов.

Гиппокампная сеть генерирует высокосинхронизациозную активность популяции in vivo,видимую как колебания в внеклеточном локальном полевом^{потенциале 1,2,3,4,5.} Методы среза мозга были использованы, чтобы получить представление о клеточных и цепных механизмов, лежащих в основе этих колебаний нейрональной сети. Основопокоительная работа Майера и др. показала, что острые волнообразные комплексы (SWRs) могут возникать спонтанно в ломтиках брюшного^{гиппокампа 6,7}. Последующие исследования от нескольких исследователей постепенно разъяснили многие аспекты SWRs, в том числе роль нейромодуляторов в регулировании сетевого состояния^{гиппокампа 8,9,10 и}синаптических механизмов, которые управляют в пробирке реактивации нейрональных ансамблей ранее активны во время поведения in vivo¹¹. Эксперименты с ломтиками мозга также предоставили представление о колебаниях гамма-диапазона (30-100 Гц), отчетливом состоянии сети гиппокампа, которое, как полагают, поддерживает кодирование^{памяти и напоминает 12,13}. Наконец, признавая центральную роль гиппокампа и связанных с ним структур в патофизиологии эпилепсии^{височной доли 14,15}, исследователи использовали гиппокампа ломтик препаратов для исследования поколения и распространения эпилептиформной активности. Картер и др. продемонстрировали, что комбинированные ломтики гиппокампа-энторинной коры, приготовленные из хронически эпилептических животных, могут спонтанно генерировать эпилептические выделения в пробирке¹⁶. Впоследствии, Карлокай и др. исследовали механизмы, лежащие в основе эпилептиформных разрядов в ломтиках гиппокампа с помощью модифицированной искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) с измененными концентрациями ионов (снижение Mg^{2 или повышенный}K ) или добавленных препаратов (4AP или^{габазин) 17}.

Исследователи разработали многочисленные подходы гиппокампа ломтик, которые отличаются в ключевых отношениях: (1) области гиппокампа, содержащиеся в ломтик (спинной, промежуточный, или брюшной); (2) наличие или отсутствие экстрагиппокампальных тканей, таких как энторинальная кора; (3) ориентация, используемая для разреза срезов (корональный, sagittal, горизонтальный или косой); и (4) условия, при которых ткань поддерживается после нарезки (полностью погружена в ACSF или проводится на стыке ACSF и увлажненной, богатой карбогеном воздуха).

Выбор подхода к использованию нарезки должен определяться экспериментальной целью. Например, поперечные или корональные ломтики спинного гиппокампа, поддерживаемые в затопленных условиях, были использованы очень эффективно для исследования внутригиппокампальной схемы и^{синаптической пластичности 18,19,20}. Тем не менее, такие препараты не спонтанно генерировать сетевые колебания так же легко, как ломтики из брюшного^{гиппокампа 21,22,23}. Хотя состояние постоянной активности SWR может быть вызвано тетаной стимуляции поперечных ломтиков из спинного и брюшного^{гиппокампа 24}, спонтанные SWRs более легко наблюдается в брюшной^{ломтиками 7,25}.

Врожденное физиологическое и анатомическое различие между спинным и желудочковым гиппокампом подтверждается исследованиями, проведенными как in vivo, так и in vitro^26. Записи у крыс показали сильно когерентные ритмы темы по всей спинной и промежуточный гиппокамп, но плохая согласованность между брюшной области и остальной части^{гиппокампа 27}. SWRs in vivo легко размножаются между спинным и промежуточным гиппокампом, в то время как SWRs, которые происходят в брюшном гиппокампе, часто^{остаются местными 28}. Асциальные проекции, происходящие из пирамидальных нейронов CA3, которые находятся в спинном и промежуточном гиппокампе, проецируют большие расстояния вдоль продольной оси гиппокампа. Прогнозы CA3, происходящие из вентальных регионов, остаются относительно локальными, и, таким образом, менее вероятно, будут разорваны^{в процессе нарезки 29,30}. Таким образом, вентальные ломтики могут лучше сохранить повторяющуюся сеть, необходимую для создания синхронности популяций. Склонность желудочков к генерации спонтанной сетевой активности в пробирке может также отражать более высокую внутреннюю возбудимость пирамидальных нейронов или более слабое ГАМК ингибирование в брюшном гиппокампе по сравнению с более спинными^{областями 31}. Действительно, вентрал гиппокампа ломтики более восприимчивы к эпилептиформной^{активности 32,33}. Так, во многих^{исследованиях спонтанных физиологических 8,9,11,24} или патологических^16,34,35,36 сетевых колебаний традиционно использовался горизонтальный нарезной подход, иногда с небольшим углом в передне-затылочной направлении, что дает ломтики тканей параллельно поперечной плоскости брюшного гиппокампа.

Подключение к сети неизбежно влияет на процедуру нарезки, так как многие ячейки в срезе будут разорваны. Угол и толщина ломтика и ткани, сохраненные в препарате, следует учитывать для оптимизации подключения в схемах, представляющих интерес. Во многих исследованиях использовались горизонтальные комбинированные ломтики гиппокампа-энторинальной коры (HEC) для изучения взаимодействий между двумя структурами в контексте физиологических или патологических колебаний сети. Рот и др. выполнили двойные записи с под поля CA1 гиппокампа и слоя V медиальной энторинальной коры, чтобы продемонстрировать распространение активности SWR через срез^{HEC 37}. Многие исследования эпилептиформной активности использовали препарат heC ломтик^{исследовать,}как эпилептиформные разряды распространяются через кортикогиппокампальной^{сети 16,35},^36,38. Важно отметить, что сохранение нетронутой коркикогиппокампальной петли не является необходимым условием для спонтанных SWRs, эпилептиформных разрядов или гамма-колебаний; сетевые колебания могут быть сгенерированы в поперечных ломтиках спинного или брюшного гиппокампа без прикрепленных парагиппокампальных^{тканей 21,22,23, 25,39,40,41.} Более важным фактором для спонтанного поколения сетевых колебаний в гиппокампе ломтиками может быть толщина каждого ломтика, так как более толстый ломтик (400-550 мкм) сохранит больше подключения в повторяющейся сети CA2/CA3^21,22,25.

Хотя угловые горизонтальные ломтики HEC (вырезать с примерно 12 “угол в переднем затылочной направлении) были использованы для изучения функциональной связи кортикогиппокампальной^{петли 11,16,34,35,42}, такие угловые препараты не требуются для спонтанной^{сетевой активности 43,44,45}. Тем не менее, использование угловой нарезки плоскости позволяет следователю выборочно сделать ломтики, которые лучше всего сохранить поперечно ориентированных ламеллы либо брюшной или промежуточный гиппокамп, в зависимости от того, вниз или вверх угол применяется (Рисунок 1). Этот подход концептуально похож на тот, который используется Papatheodoropoulos и др., 2002, который расчленил каждый гиппокамп бесплатно, а затем использовать ткани измельчитель для создания поперечных ломтиков вдоль всей спинно-вентральной^{оси 21}. В свете вышеупомянутых функциональных различий между брюшной и спинной-промежуточный гиппокамп, исследователи должны рассмотреть анатомическое происхождение ломтиков при разработке экспериментов или интерпретации результатов. Использование агар рампы во время процедуры нарезки является простым способом преимущественно производить ломтики либо из промежуточных или брюшной гиппокампа.

Гиппокампальные ломтики можно поддерживать либо в погруженной камере (с тканью, полностью погруженной в ACSF), либо в камере в стиле интерфейса (например, в камере Осло или Хааса, с ломтиками, покрытыми только тонкой пленкой струящихся средств массовой информации). Обслуживание интерфейса повышает оксигенацию тканей, что способствует выживанию нейронов и обеспечивает устойчивый высокий уровень межнейронной активности. Традиционно условия подводной записи используют более медленный уровень потока ACSF, который не обеспечивает адекватной оксигенации тканей для стабильного выражения колебаний сетевого уровня. В погруженных ломтиках гиппокампа карбахол-индуцированных гамма-колебаний^{наблюдаются только переходно 46,47}, в то время как они могут быть стабилико поддерживается в^{интерфейсе записи камер 10,48,49}. Таким образом, многие исследования сложной спонтанной активности in vitro опирались на интерфейс записывающих камер для исследования резковолновых^{волновых волновых комплексов 6,7,8,9,10,25,37,гамма-колебаний 10,13}и эпилептиформной^{активности 16,38,45,47.}

В камере записи в подводном стиле цель микроскопа погружения может быть использована для визуализации отдельных клеток и выборочной целевой здоровых клеток для записи. Подводный препарат также позволяет осуществлять тонкий контроль над клеточной средой, так как погружение способствует быстрому рассеиванию наркотиков или других соединений в ткани. Таким образом, модифицированная методология, при которой стабильные колебания сети поддерживаются в условиях погружения, представляет собой мощный экспериментальный подход. Этот подход является примером работы H’jos et al., в которой ломтики гиппокампа восстанавливаются в упрощенной камере холдинга в стиле интерфейса в течение нескольких часов перед передачей в модифицированную погруженную камеру записи с высокой скоростью потока ACSF (6 мл/мин) для повышения подачи кислорода^{в ткани 12,48,49}. В этих условиях в погруженной камере записи можно поддерживать высокий уровень межнейронической активности и стабильные спонтанные сетевые колебания. Этот модифицированный подход позволяет следователям выполнять визуально управляемые записи зажима цельноклеточного патча и характеризовать вклад морфологически идентифицированных типов клеток в гамма-колебания, вызванные карбахолом^12. SWRs также может произойти спонтанно в погруженных ломтиков гиппокампа с быстрой скоростью потока ACSF^11,48,49. Майер и др. продемонстрировали, что гиппокамп ломтики, которые восстановились в интерфейсной камере перед передачей в погруженную камеру записи надежно выставлены спонтанные SWRs, в то время как ломтики, которые восстановлены погружены в стакан перед передачей в погруженную камеру записи показали меньшие вызванные реакции поля, более низкие уровни спонтанных синаптических течений, и только очень редко выставлены спонтанные SWRs⁴³. Schlingloff et al. использовали эту улучшенную методологию, чтобы продемонстрировать роль парвалбумин-экспрессинговых клеток корзины в генерации спонтанных SWRs⁴⁴.

Следующий протокол представляет собой метод нарезки, с помощью которого спонтанно активные нейроны в горизонтальных ломтиках гиппокампа могут быть восстановлены в условиях интерфейса и впоследствии поддерживаться в погруженной камере записи, пригодной для фармакологических или оптогенетических манипуляций и визуально управляемых записей.