חריף המוח עכבר חותכת לחקור פעילות רשת היפוקמפוס ספונטנית

מדידה אלקטרופיזיולוגית מפרוסות היפוקמפוס חיות במבחנה היא גישה ניסיונית רבת עוצמה עם יתרונות רבים. הנסיין יכול להשתמש במיקרוסקופ, מיקרומניפולטורים ומערכת הקלטה כדי לדמיין ולאסוף מדידות ישירות מתאי עצב בודדים ברקמה. פרוסות רקמות נגישות מאוד גם לצילום או משלוח תרופות לניסויים אופטוגנטיים, כימוגנטיים או תרופתיים.

רשת ההיפוקמפוס מייצרת פעילות אוכלוסין סינכרונית מאוד ב vivo, גלוי כמו תנודות בפוטנציאל השדה המקומי חוץ תאי^1,2,3,4,5. שיטות פרוסת המוח כבר ממונפות כדי לקבל תובנה לתוך מנגנוני הסלולר והמעגלים שבבסיס תנודות רשת עצביות אלה. עבודת יסוד של מאייר ואח ‘הוכיחה כי מתחמי גלים חדים (SWRs) יכולים לצוץ באופן ספונטני בפרוסות של ההיפוקמפוס הגחוני^6,7. מחקרים מאוחרים יותר של חוקרים מרובים הבהירו בהדרגה היבטים רבים של SWRs, כולל תפקידם של נוירומודולטורים בוויסות מצב הרשת של ההיפוקמפוס^8,9,10 והמנגנונים הסינפטיים המניעים את ההפעלה מחדש במבחנה של הרכבים עצביים שהיו פעילים בעבר במהלך התנהגות ב vivo¹¹. ניסויים בפרוסות מוח סיפקו גם תובנה על תנודות טווח הגמא (30-100 הרץ), מצב רשת היפוקמפוס מובהק האמין לתמוך קידוד זיכרון להיזכר^12,13. לבסוף, הכרה בתפקיד המרכזי של ההיפוקמפוס ומבנים הקשורים בפתופיזיולוגיה של אפילפסיה של האונה הרקתית^14,15, חוקרים השתמשו בהכנות פרוסת היפוקמפוס כדי לחקור את הדור ואת התפשטות פעילות אפילפטיפורם. Carter et al. הוכיחו כי פרוסות קליפת המוח ההיפוקמפוס-entorhinal בשילוב שהוכנו מבעלי חיים אפילפטיים כרוניים יכול ליצור באופן ספונטני הפרשות אפילפטיפורם במבחנה¹⁶. לאחר מכן, Karlócai et al. חקר את המנגנונים שבבסיס הפרשות אפילפטיפורם בפרוסות היפוקמפוס באמצעות נוזל שדרתי מלאכותי שונה (ACSF) עם ריכוזי יון שונה (מופחת Mg²⁺ או גבוה K⁺) או תרופות נוספות (4AP או gabazine)¹⁷.

חוקרים פיתחו גישות רבות של פרוסות היפוקמפוס השונות בדרכים מרכזיות: (1) אזור ההיפוקמפוס הכלול בפרוסה (גב, ביניים או גחון); (2) נוכחות או היעדר רקמות חוץ-פימפו-קמפליות כגון קליפת המוח האנטורינלית; (3) הכיוון המשמש לחיתוך פרוסות (קורנל, קשת, אופקי או אלכסוני); ו-(4) התנאים שבהם נשמרת הרקמה לאחר ההחתמה (שקועה במלואה ב- ACSF או מוחזקת בממשק של ACSF ואוויר לח ועשיר קרבוגן).

הבחירה באיזו גישה חותכת להשתמש צריכה להיקבע על ידי המטרה הניסיונית. לדוגמה, פרוסות רוחביות או קורנליות של ההיפוקמפוס הגבי המתוחזק בתנאים שקועים שימשו ביעילות רבה לחקירת מעגלים תוך-פיוקמפוסים ופלסטיות סינפטית^18,19,20. עם זאת, הכנות כאלה אינן יוצרות באופן ספונטני תנודות ברשת בקלות כמו פרוסות מההיפוקמפוס הגחוני^21,22,23. למרות מצב של פעילות SWR מתמשכת ניתן לגרום על ידי גירוי tetanic בפרוסות רוחביות מן ההיפוקמפוס הגבי הגחוני²⁴, SWRs ספונטניים נצפו בקלות רבה יותר פרוסות הגחון^7,25.

הבחנה פיזיולוגית ואנטומית אינהרנטית בין ההיפוקמפוס הגבי לבין ההיפוקמפוס הגחוני נתמכת על ידי מחקרים המבוצעים הן ב- vivo והן במבחנה²⁶. הקלטות בחולדות חשפו מקצבי תטא עקביים מאוד לאורך ההיפוקמפוס הגבי והבינוני, אך קוהרנטיות לקויה בין אזור הגחון לשאר ההיפוקמפוס²⁷. SWRs ב vivo מפיצים בקלות בין ההיפוקמפוס הגבי והבינוני, ואילו SWRs שמקורם בהיפוקמפוס הגחוני נשארים לעתים^{קרובות מקומיים 28}. התחזיות האסוציאטיביות שמקורן בנוירונים פירמידליים CA3 המתגוררים בפרויקט ההיפוקמפוס הגבי והבינוני למרחקים ארוכים לאורך הציר האורך של ההיפוקמפוס. תחזיות CA3 שמקורן באזורים גחוני להישאר מקומיים יחסית, ולכן נוטים פחות להיות מנותק במהלך תהליך ההחתכה^29,30. לפיכך, פרוסות גחון עשויות לשמר טוב יותר את הרשת החוזרת הנחוצה ליצירת סנכרון אוכלוסין. הנטייה של פרוסות גחון כדי ליצור פעילויות רשת ספונטניות במבחנה עשויה גם לשקף רגישות פנימית גבוהה יותר של נוירונים פירמידליים או עיכוב GABAergic חלש יותר בהיפוקמפוס הגחוני בהשוואה לאזורים הגביים יותר³¹. ואכן, פרוסות היפוקמפוס הגחוני רגישים יותר לפעילות אפילפטיפורם^32,33. לפיכך, מחקרים רבים של תנודות רשת ספונטניות^8,9,11,24 או פתולוגי^{16,34,35,36 תנודות} רשת השתמשו באופן מסורתי בגישה חתוכה אופקית, לפעמים עם זווית קלה בכיוון הקדמי-עורפי, אשר מניב פרוסות רקמה במקביל למישור הרוחבי של ההיפוקמפוס הגחוני.

קישוריות הרשת מושפעת באופן בלתי נמנע מהליך ההחתכה, שכן תאים רבים בפרוסה ינותק. הזווית ועובי הפרוסה והרקמה שנשמרו בהכנה יש לשקול לייעל את הקישוריות במעגלי העניין. מחקרים רבים השתמשו בפרוסות קליפת המוח האופקית המשולבת של ההיפוקמפוס -entorhinal (HEC) כדי לחקור אינטראקציות בין שני המבנים בהקשר של תנודות רשת פיזיולוגיות או פתולוגיות. Roth et al. ביצע הקלטות כפולות משדה המשנה CA1 של ההיפוקמפוס ושכבה V של קליפת המוח האנטורינאלית המדיאלית כדי להדגים התפשטות של פעילות SWR באמצעות פרוסת HEC³⁷. מחקרים רבים על פעילות אפילפטיפורם השתמשו בהכנת פרוסת HEC כדי לחקור כיצד הפרשות אפילפטיפורם מתפשטות דרך רשת קורטיקוהיפוקאמפל^16,35,36,38. חשוב לציין כי שימור הלולאה קורטיקוהיפוקאמפל שלם אינו תנאי מוקדם עבור SWRs ספונטניים, הפרשות אפילפטיפורם, או תנודות גמא; תנודות רשת יכולות להיווצר בפרוסות רוחביות של ההיפוקמפוס הגבי או הגחוני ללא רקמות פרהיפוקמפוס מחוברות^{21,22,23, 25,39,40,41}. גורם חשוב יותר עבור הדור הספונטני של תנודות רשת בפרוסות היפוקמפוס עשוי להיות עובי של כל פרוסה, כמו פרוסה עבה יותר (400-550 מיקרומטר) ישמור קישוריות יותר ברשת CA2/CA3 חוזרת^21,22,25.

למרות פרוסות HEC אופקי זוויתי (לחתוך עם זווית של כ 12 ° בכיוון הקדמי-עורפי) שימשו כדי ללמוד את הקישוריות הפונקציונלית של לולאת corticohippocampal^{11,16,34,35,42}, הכנות זוויתיות כאלה אינם נדרשים לפעילות רשת ספונטנית^43,44,45. עם זאת, השימוש במישור חתך זוויתי מאפשר לחוקר להכין באופן סלקטיבי פרוסות המשמרות בצורה הטובה ביותר את הלאמלה בעלת הכיוון הרוחבי של ההיפוקמפוס הגחוני או הבינוני, תלוי אם מוחלת זווית כלפי מטה או כלפי מעלה (איור 1). גישה זו דומה מבחינה מושגית לזו המשמשת את Papatheodoropoulos et al., 2002, אשר ניתח כל היפוקמפוס חינם ולאחר מכן השתמש במסוק רקמות כדי ליצור פרוסות רוחביות לאורך כל ציר הגב הגחוני²¹. לאור ההבחנה התפקודית הנ”ל בין ההיפוקמפוס הגחוני והידוכי הגבי, החוקרים צריכים לשקול את המקור האנטומי של פרוסות בעת תכנון ניסויים או פרשנות תוצאות. שימוש ברמפת אגר במהלך הליך ההחתכה הוא דרך פשוטה לייצר פרוסות מההיפוקמפוס הבינוני או הגחוני.

פרוסות היפוקמפוס יכולות להישמר בתא שקוע (עם הרקמה שקועה לחלוטין ב- ACSF), או בתא בסגנון ממשק (למשל, אוסלו או תא האס, עם פרוסות מכוסות רק על ידי סרט דק של מדיה זורמת). תחזוקת ממשק משפר חמצון של הרקמה, אשר מקדם הישרדות עצבית ומאפשר רמות גבוהות מתמשכת של פעילות interneuronal. באופן מסורתי, תנאי הקלטה שקועים משתמשים בקצב זרימה ACSF איטי יותר שאינו מספק חמצון רקמות נאות לביטוי יציב של תנודות ברמת הרשת. בפרוסות היפוקמפוס שקועות תנודות גמא הנגרמות על ידי קרבאכול נצפו רק באופן ארעי^46,47, בעוד שהם יכולים להישמר ביציבות בתאי הקלטה ממשק^10,48,49. ככזה, מחקרים רבים של פעילות ספונטנית מורכבת במבחנה הסתמכו על חדרי הקלטה ממשק לחקור מתחמי גל חד^{אדווה 6,7,8,9,10,25,37}, תנודות גמא^10,13, ופעילות אפילפטיפורם^16,38,45,47.

בתא הקלטה בסגנון שקוע, ניתן להשתמש במטרה של מיקרוסקופ טבילה כדי לדמיין תאים בודדים ולמקד באופן סלקטיבי תאים בעלי מראה בריא להקלטות. ההכנה שקועה גם מאפשר שליטה עדינה על milieu הסלולר, כמו טבילה מקלה על פיזור מהיר של תרופות או תרכובות אחרות לרקמה. לפיכך, מתודולוגיה שונה שבה תנודות רשת יציבות נשמרות בתנאים שקועים מייצגת גישה ניסיונית רבת עוצמה. גישה זו באה לידי ביטוי על ידי העבודה של Hájos et al., שבו פרוסות ההיפוקמפוס להתאושש בתא החזקה בסגנון ממשק פשוט במשך כמה שעות לפני ההעברה לתא הקלטה שקוע שונה עם קצב זרימה גבוה של ACSF (~ 6 mL / min) כדי לשפר את אספקת החמצן לרקמה^12,48,49. בתנאים אלה, ניתן לשמור על רמות גבוהות של פעילות interneuron ותנודת רשת ספונטנית יציבה בתא הקלטה שקוע. גישה זו שונה מאפשרת לחוקרים לבצע הקלטות תיקון תא שלם מונחה חזותית ולאפיין את תרומתם של סוגי תאים שזוהו מורפולוגית לתנודות גמא הנגרמות על ידי carbachol¹². SWRs יכול להתרחש גם באופן ספונטני פרוסות היפוקמפוס שקוע עם קצב זרימה מהיר של ACSF^11,48,49. מאייר ואח ‘ הדגימו כי פרוסות היפוקמפוס שהתאוששו בתא ממשק לפני המעבר לתא הקלטה שקוע הציגו באופן אמין SWRs ספונטניים, ואילו פרוסות שהתאוששו שקועות בכומתה לפני ההעברה לתא הקלטה שקוע הראו תגובות שדה קטנות יותר, רמות נמוכות יותר של זרמים סינפטיים ספונטניים, ורק לעתים רחוקות מאוד הציגו SWRs^{ספונטניים 43}. Schlingloff et al. השתמשו במתודולוגיה משופרת זו כדי להדגים את תפקידם של תאי סל מבטאים parvalbumin בדור של SWRs ספונטני⁴⁴.

הפרוטוקול הבא מציג שיטת חתך שבאמצעותה ניתן לשחזר נוירונים פעילים באופן ספונטני בפרוסות היפוקמפוס אופקיות בתנאי ממשק ולאחר מכן להישמר בתא הקלטה שקוע המתאים למניפולציות תרופתיות או אופטוגנטיות והקלטות מונחות ויזואלית.