In Vitro Клин Фрагмент Подготовка для имитации In Vivo Нейрональной цепи подключения

Наблюдение за активностью нейронных цепей идеально выполняется с помощью местных сенсорных входов и обратной связи, а также нетронутой связи между областями мозга, in vivo. Тем не менее, выполнение экспериментов, которые дают одноклеточное разрешение функции нейронной цепи по-прежнему ограничивается техническими проблемами в нетронутом мозге. В то время как экстрацеллюлярная электрофизиология in vivo или многофотонные методы визуализации могут быть использованы для исследования активности в нетронутой нервной системе, интерпретация того, как различные входные данные интегрируются или измеряют синаптические входы подразводки, остается трудной. In vivo цельноклеточные записи преодолевают эти ограничения, но являются сложными для выполнения, даже в областях мозга, которые легко доступны. Технические проблемы одноклеточного разрешения экспериментов еще более усиливаются в определенных популяциях нейронов, которые расположены глубоко в головном мозге, или в пространственно диффузных популяциях, которые требуют либо генетических инструментов для обнаружения клеток in vivo (например, генетическое выражение channelrhodopsin в паре с optrode записи) или пост-специальной гистохимической идентификации после записи сайта маркировки (например, с нейротрансмиссии конкретных маркеров). Находясь диффузно вблизи брюшной поверхности ствола мозга, медиальные оливокохлеарные (MOC) нейроны страдают от^{вышеуказанных ограничений 1}, что делает их чрезвычайно трудно получить доступ для in vivo экспериментов.

Мозг ломтики (толщиной 100-500 мкм) уже давно используются для изучения схем мозга, в том числе слуховой ствол мозга схемы, из-за физической сегрегации подключенных нейронов, которые содержатся^{в том же ломтик 2,3,4,5,6,7,8,9}. Эксперименты с использованием гораздо толще ломтиками (Nogt;1 мм) были использованы в других лабораториях, чтобы^{понять,}как двусторонние входы интегрировать в областях высшего оливариального комплекса (SOC), включая медиальный превосходный^{оливковый 10},¹¹. Эти ломтики были подготовлены таким образом, что аксоны слухового нерва (АН) остались нетронутыми в ломтик и были электрически стимулировали инициировать синаптический нейромедиатор релиз в CN, имитируя активность первого порядка слуховых нейронов, как они будут реагировать на звук. Одним из основных недостатков этих толстых ломтиков является видимость нейронов для патч-зажим электрофизиологических записей (“патч”). Патчирование становится все более^{трудным,}как многочисленные аксоны в этой области становятся myelinated^{с возрастом 12,13,14},¹⁵, что делает ткань оптически плотной и заслоняющих нейронов даже в типичный, тонкий срез мозга. Наша цель состоит в том, чтобы создать в пробирке препараты, которые больше напоминают цепи подключения in vivo записей, но с высокой пропускной способностью и высоким разрешением записи способности визуально управляемых патч-зажим электрофизиологии в мозге ломтиками.

Наша лаборатория исследует физиологию нейронов слуховой эфферентной системы, включая нейроны MOC. Эти холинергические нейроны обеспечивают эфферентную обратную связь с улиткой, модулируя активность наружных волосковых клеток (OHCs)^{16,17,18,19,20}. Предыдущие исследования показали, что эта модуляция играет определенную роль в^{усилении контроля в улитке 21,22,23,24,25,26 и}защите^{от акустической травмы 27,28,29,30,31,32,33.} У мышей, MOC нейроны диффузно расположены в брюшном ядре трапециевидного тела (VNTB) в слуховой ствол^{мозга 1}. Наша группа использовала chAT-IRES-Cre мыши линии пересекли с tdTomato репортер мыши линии для целевой MOC нейронов в ствол мозга ломтиками под эпифлуоресцентным освещением. Мы показали, что нейроны MOC получают афферентный ингибильный вход от ипсилатерального медиального ядра трапециевидного тела (MNTB), который возбуждается, в свою очередь, аксонами из шаровых густых клеток (GBC) в контралатерального кохлеарного ядра (CN)^{34,35,36,37,38.} Кроме того, нейроны MOC, вероятно, получают их возбудительный вход от Т-стеллат клеток в контралатеральной CN^39,40,41. Взятые вместе, эти исследования показывают, MOC нейроны получают как возбуждательные и ингибирующие входы, полученные из того же (контралатерального) уха. Тем не менее, пресинаптические нейроны, и их аксоны сходятся на нейронах MOC, не совсем достаточно близко друг к другу, чтобы быть полностью нетронутыми в типичной подготовки корональной ломтик. Чтобы исследовать, как интеграция синаптических входов в нейроны MOC влияет на их действия потенциальных моделей стрельбы, с акцентом на недавно описанные ингибирования, мы разработали препарат, в котором мы могли бы стимулировать различные афференты MOC нейронов из одного уха в наиболее физиологически реалистичным способом возможно, но с техническими преимуществами in vitro мозга ломтик экспериментов.

Срез клина является модифицированным толстым ломтиком подготовки, предназначенной для исследования цепи интеграции в нейронах MOC (схематизирована на рисунке 1A). На толстой стороне ломтика, клин содержит отрубленные аксоны слухового нерва (так называют “корень слухового нерва” в дальнейшем), как они входят в ствол мозга с периферии и синапса в CN. Корень слухового нерва можно электрически стимулировать, чтобы вызвать высвобождение нейромедиатора и синаптической активации клеток полностью нетронутыми CN^{42,43,44,45,46}. Этот формат стимуляции имеет ряд преимуществ для анализа схемы. Во-первых, вместо того, чтобы непосредственно стимулировать T-stellate и GBC аксоны, которые обеспечивают афферентный вход в нейроны MOC, мы стимулируем AN, чтобы позволить активацию внутренних цепей, обильных в CN. Эти схемы модулировать выход нейронов CN к своим целям по всему мозгу, в том числе MOC^{нейронов 46,47,48,49,50,51}. Во-вторых, полисинаптическая активация афферентных цепей от AN через CN вверх по течению нейронов MOC позволяет более естественное время активации и для пластичности происходить на этих синапсах по мере того как они in vivo во время слуховой стимуляции. В-третьих, мы можем изменять наши модели стимуляции, чтобы имитировать активность АН. Наконец, как возбуждательные, так и ингибирующие монауральные проекции на нейроны MOC не повреждены в срезе клина, и их интеграция может быть измерена в нейроне MOC с точностью электрофизиологии патч-зажима. В целом, эта схема активации обеспечивает более нетронутой цепи нейронов MOC по сравнению с типичной подготовки ломтик мозга. Этот срез клина ствола мозга также может быть использован для исследования других слуховых^{областей,}которые получают ингибирующие входы от ипсилатерального MNTB, включая боковое превосходное оливковое, превосходное оливариальное ядро и медиальное превосходное^{оливковое 10,11,52,53,54,55,56.} Помимо нашей конкретной подготовки, этот метод нарезки может быть использован или изменен для оценки других систем с преимуществами поддержания подключения дальнего ввода и улучшения визуализации нейронов для различных одноклеточного разрешения электрофизиологии или методов визуализации.

Этот протокол требует использования вибромной сцены или платформы, которые могут быть наклонены примерно на 15 градусов. Здесь мы используем коммерчески доступные 2-кусок магнитной стадии, где “этап” является металлический диск с изогнутым дном помещены в вогнутой магнитной “стадии базы”. Этап может быть сдвинут для регулировки угла разреза. Концентрические круги на сценической базе используются для оценки угла воспроизведения. Этапная и сценическая основа помещаются в камеру нарезки, где также может вращаться основание магнитной сцены.