생체 내 신경 회로 연결성 모방을 위한 체외 쐐기 슬라이스 준비

신경 회로의 활동의 관찰은 이상적으로 네이티브 감각 입력 및 피드백, 그리고 뇌 영역 사이의 그대로 연결, 생체 내에서 수행된다. 그러나 신경 회로 기능의 단일 세포 해상도를 제공하는 실험을 수행하는 것은 여전히 뇌의 기술적 과제에 의해 제한됩니다. 생체 외 세포 외 전기 생리학 또는 다광화상 방법은 그대로 신경계에서 활동을 조사하는 데 사용될 수 있지만, 다른 입력이 어떻게 통합되는지 해석하거나 하위 임계 값 시냅스 입력을 측정하는 것은 여전히 어렵습니다. 생체 내 전세포 기록은 이러한 한계를 극복하지만 쉽게 접근 할 수있는 뇌 영역에서도 수행하기가 어렵습니다. 단일 세포 분해 실험의 기술적 과제는 뇌 깊숙이 위치한 특정 뉴런 집단또는 생체 내에서 세포를 찾기 위해 유전 적 도구가 필요한 공간적으로 확산되는 집단(예: 옵트로드 레코딩과 결합된 채널로돕신의 유전적 발현) 또는 기록 사이트 라벨링 후 의학적 식별(예: 신경 전달 마커)에서 더욱 증폭됩니다. 뇌간의 복부 표면 근처에 확산되는 내측 올리고엽아(MOC) 뉴런은 위의 한계^1로인해 생체 내 실험에 액세스하기가 매우 어렵다.

뇌 슬라이스(~100-500 μm 두께)는 동일한 슬라이스^{2,3,4,5,6,7,8,9}내에 포함된 연결된 뉴런의 물리적 분리로 인해 청각 뇌간 회로를 포함한 뇌 회로를 연구하는 데 오랫동안 사용되어 왔다. 훨씬 두꺼운 슬라이스(>1mm)를 이용한 실험은 내측 우수한 올리브^10,11을포함한 우수한 올리보리 복합체(SOC)의 영역에서 양자 입력이 어떻게 통합되는지 이해하기 위해 다른 실험실에서 사용되고 있다. 이러한 슬라이스는 청각 신경(AN)의 축삭이 슬라이스 내에서 그대로 유지되고 CN에서 시냅스 신경 전달 물질 방출을 시작하기 위해 전기적으로 자극되어 소리에 반응할 것처럼 1차 청각 뉴런의 활성을 모방하도록 제조하였다. 이러한 두꺼운 조각의 한 가지 주요 단점은 패치 클램프 전기 생리적 기록 (“패치”)에 대한 뉴런의 가시성입니다. 이 지역의 수많은 축축이^{12세,13세,14세,15세로}발근해지면서 전형적이고 얇은 뇌 슬라이스에서도 조직이 광학적으로 조밀해지고 모호한 뉴런을 만들기 때문에 패치가 점점 더 어려워집니다. 우리의 목표는 생체 내 레코딩의 회로 연결성과 더 밀접하게 유사한 체외 제제를 만드는 것이지만, 뇌 슬라이스에서 시각적으로 유도된 패치 클램프 전기생리학의 고처리량 및 고해상도 레코딩 능력을 가지고 있습니다.

우리의 실험실은 MOC 신경세포를 포함하여 청각 efferent 시스템의 뉴런의 생리학을 조사합니다. 이러한 콜린성 뉴런은 외부 모발 세포(OHCs)^{16,17,18,19,20의}활성을 조절함으로써 달팽이관에 대한 효과적인 피드백을 제공한다. 이전 연구는 이 변조가 달팽이관^{21,22,23, 24,25,26} 및 음향 외상으로부터 의보호^{27,28,29,30,31,32,33에서}이득 제어에 중요한 역할을 한다는^것을보여주었다. 마우스에서, MOC 뉴런은 청각 뇌간^1에서사다리꼴 본체(VNTB)의 복부 핵에 확산적으로 위치한다. 우리 그룹은 tdTomato 리포터 마우스 라인과 교차하는 ChAT-IRES-Cre 마우스 라인을 활용하여 상피 조명 아래 뇌간 슬라이스에서 MOC 뉴런을 표적으로 삼았습니다. 우리는 MOC 뉴런이 트라페조이드 체의 ipsilateral 내측 핵으로부터 발포성 억제 입력을 수신한다는 것을 보여주었습니다 (MNTB), 이는 차례로, 반대로 달팽이관 핵 (CN)^{34,35,36,37, 38에서}구형 부시 세포 (GBC)에서 축삭에 의해 흥분된다. 추가적으로, MOC 뉴런은 아마도 반대로 CN^{39,40,41에서}T-stellate 세포로부터 그들의 흥분^입력을수신합니다. 종합, 이러한 연구는 MOC 뉴런이 동일한 (contralateral) 귀에서 파생된 흥분성 및 억제 입력을 모두 수신하는 것으로 나타났습니다. 그러나, 전시냅스 뉴런, 그리고 MOC 뉴런에 수렴하는 그들의 축축은, 일반적인 관상 슬라이스 준비에서 완전히 손상될 만큼 서로 충분히 가깝지 않습니다. MOC 뉴런에 시냅스 입력의 통합이 그들의 작용 잠재적인 발사 패턴에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기 위하여, 새로 설명한 억제에 초점으로, 우리는 우리가 가능한 가장 생리적으로 현실적인 방법으로 한 귀에서 MOC 뉴런에 다양한 흡수를 자극할 수 있는 준비를 개발했습니다, 그러나 체외 뇌 슬라이스 실험의 기술적 이점.

웨지 슬라이스는 MOC 뉴런의 회로 통합을 조사하도록 설계된 수정된 두꺼운 슬라이스 제제입니다(도 1A에서스키마화). 슬라이스의 두꺼운 측면에, 웨지는 청각 신경의 절단 된 축삭을 포함 (이하 “청각 신경 뿌리”라고) 그들은 CN에서 주변과 시냅스에서 뇌간을 입력으로. 청각 신경 근은 완전히손상된 CN^{42,43,44,45, 46의}세포의 신경 전달물질 방출 및 시냅스 활성화를 연상시키는 전기적으로 자극될 수 있다. 이 자극 형식은 회로 분석에 몇 가지 이점이 있습니다. 첫째, MOC 뉴런에 대한 포심 입력을 제공하는 T-stellate 및 GBC 축축을 직접 자극하는 대신 CN에 풍부한 본질회로의 활성화를 허용하도록 AN을 자극합니다. 이러한 회로는 MOC 뉴런^{46,47,48,49,50,51을}포함하여 뇌 전체의 표적에 CN 뉴런의^출력을조절한다. 둘째, MOC 뉴런의 CN 업스트림을 통해 AN으로부터 포퍼런트 회로의 다형성 활성화를 통해 청각 자극 중에 생체 내에서와 마찬가지로 이러한 시냅스에서 보다 자연스러운 활성화 타이밍과 가소성이 발생할 수 있습니다. 셋째, 자극 패턴을 다양하게 하여 AN 활동을 모방할 수 있습니다. 마지막으로, MOC 뉴런에 대한 흥분성 및 억제 모년 투영은 쐐기 조각에 그대로 있으며, 이들의 통합은 패치 클램프 전기생리학의 정밀도로 MOC 뉴런에서 측정될 수 있다. 전체적으로, 이 활성화 계획은 일반적인 두뇌 슬라이스 준비에 비해 MOC 뉴런에 더 온전한 회로를 제공합니다. 이러한 뇌간 쐐기 슬라이스는 측면 우수한 올리브, 우수한 올리보리 핵 및 내측 우수한 올리브^{10,11,52,53,54,55,56을}포함하는 ipsilateral MNTB로부터 억제 입력을 받는 다른 청각^영역을조사하는 데 에도 사용될 수^있다. 우리의 특정 준비를 넘어, 이 슬라이스 방법은 장거리 입력의 연결을 유지하고 다양한 단세포 해상도 전기 생리학 또는 이미징 기술에 대한 뉴런의 시각화를 개선하는 이점을 가진 다른 시스템을 평가하기 위해 사용하거나 수정할 수 있습니다.

이 프로토콜은 진동 단계 또는 플랫폼을 사용하여 약 15°기울어질 수 있어야 합니다. 여기서 우리는 “스테이지”가 오목한 자기 “스테이지 베이스”에 구부러진 바닥이있는 금속 디스크인 상업적으로 사용 가능한 2 피스 자기 단계를 사용합니다. 그런 다음 스테이지를 이동하여 슬라이스 각도를 조정할 수 있습니다. 스테이지 베이스의 동심 원은 각도를 재현적으로 추정하는 데 사용됩니다. 스테이지 및 스테이지 베이스는 자력 스테이지 베이스를 회전할 수 있는 슬라이싱 챔버에 배치됩니다.