Genetischer Variantennachweis im CALR-Gen mittels hochauflösender Schmelzanalyse
Summary
Die hochauflösende Schmelzanalyse (HRM) ist eine empfindliche und schnelle Lösung für den genetischen Variantennachweis. Es hängt von Sequenzunterschieden ab, die dazu führen, dass Heteroduplexe die Form der Schmelzkurve verändern. Durch Kämmen von HRM und Agarosegelelektrophorese können verschiedene Arten von genetischen Varianten wie Indels identifiziert werden.
Abstract
Die hochauflösende Schmelzanalyse (HRM) ist eine leistungsstarke Methode für die Genotypisierung und das Scannen genetischer Variationen. Die meisten HRM-Anwendungen hängen von sättigenden DNA-Farbstoffen ab, die Sequenzunterschiede erkennen, und Heteroduplexen, die die Form der Schmelzkurve verändern. Eine ausgezeichnete Instrumentenauflösung und eine spezielle Datenanalysesoftware sind erforderlich, um die kleinen Schmelzkurvenunterschiede zu identifizieren, die eine Variante oder einen Genotyp identifizieren. Verschiedene Arten von genetischen Varianten mit unterschiedlichen Häufigkeiten können im Gen speziell für Patienten mit einer bestimmten Krankheit, insbesondere Krebs, und im CALR-Gen bei Patienten mit Philadelphia-Chromosom-negativen myeloproliferativen Neoplasmen beobachtet werden. Einzelne Nukleotidveränderungen, Insertionen und/oder Deletionen (Indels) im interessierenden Gen können durch die HRM-Analyse nachgewiesen werden. Die Identifizierung verschiedener Arten von genetischen Varianten basiert hauptsächlich auf den Kontrollen, die im qPCR-HRM-Assay verwendet werden. Mit zunehmender Produktlänge wird der Unterschied zwischen Wildtyp- und Heterozygotenkurven jedoch kleiner und die Art der genetischen Variante ist schwieriger zu bestimmen. Wenn Indels die vorherrschende genetische Variante sind, die im interessierenden Gen erwartet wird, kann daher eine zusätzliche Methode wie die Agarosegelelektrophorese zur Klärung des HRM-Ergebnisses verwendet werden. In einigen Fällen muss ein nicht schlüssiges Ergebnis durch Standard-Sanger-Sequenzierung erneut überprüft / erneut diagnostiziert werden. In dieser retrospektiven Studie wandten wir die Methode auf JAK2 V617F-negative Patienten mit MPN an.
Introduction
Somatische genetische Varianten im Calreticulin-Gen (CALR) wurden 2013 bei Patienten mit myeloproliferativen Neoplasmen (MPN) wie essentieller Thrombozythämie und primärer Myelofibrose erkannt1,2. Seitdem wurden mehr als 50 genetische Varianten im CALR-Gen entdeckt, die eine +1 (−1+2) Frameshift3induzieren. Die beiden häufigsten CALR-Genvarianten sind eine 52 bp Deletion (NM_004343.3 (CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), auch Typ-1-Mutation genannt, und eine 5 bp Insertion (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), auch Typ-2-Mutation genannt. Diese beiden genetischen Varianten machen 80% aller CALR-Genvarianten aus. Die anderen wurden als Typ 1-ähnlich oder Typ 2-ähnlich klassifiziert, wobei Algorithmen verwendet wurden, die auf der Erhaltung einer α Helix in der Nähe des Wildtyps CALR4basieren. Hier stellen wir eine der hochempfindlichen und schnellen Methoden zum CALR-Genvariantennachweis vor, die Hochauflösende Schmelzanalysemethode (HRM). Diese Methode ermöglicht den schnellen Nachweis genetischer Varianten vom Typ 1 und Typ 2, die die Mehrheit der CALR-Mutationen ausmachen5. HRM wurde 1997 in Kombination mit der Echtzeit-»Polymerase-Kettenreaktion« (qPCR) als Werkzeug zum Nachweis der Mutation im Faktor V Leiden6eingeführt. Im Vergleich zur Sanger-Sequenzierung, die die goldene Standardtechnik darstellt, ist HRM eine empfindlichere und weniger spezifische Methode5. Die HRM-Methode ist eine gute Screening-Methode, die eine schnelle Analyse einer großen Anzahl von Proben mit einem großen Kosten-Nutzen-Verhältnis ermöglicht5. Es ist eine einfache PCR-Methode, die in Gegenwart eines Fluoreszenzfarbstoffs durchgeführt wird und keine spezifischen Fähigkeiten erfordert. Ein weiterer Vorteil ist, dass das Verfahren selbst die analysierte Probe nicht beschädigt oder zerstört, so dass wir die Probe für die Elektrophorese oder Sanger-Sequenzierung nach dem HRM-Verfahren wiederverwendenkönnen 7. Der einzige Nachteil ist, dass es manchmal schwierig ist, die Ergebnisse zu interpretieren. Darüber hinaus erkennt HRM die genaue Mutation bei Patienten mit Nicht-Typ-1- oder Typ-2-Mutationen nicht8. Bei diesen Patienten sollte eine Sanger-Sequenzierung durchgeführt werden (Abbildung 1).
HRM basiert auf der Amplifikation der spezifischen DNA-Region in Gegenwart von sättigendem DNA-Fluoreszenzfarbstoff, der in doppelsträngige DNA (dsDNA) eingebaut wird. Der Fluoreszenzfarbstoff emittiert Licht, wenn er in die dsDNA eingebaut wird. Nach einem fortschreitenden Temperaturanstieg zerfällt dsDNA in einzelsträngige DNA, die auf der Schmelzkurve als plötzliche Abnahme der Fluoreszenzintensität nachgewiesen werden kann. Die Form der Schmelzkurve hängt von der DNA-Sequenz ab, die zum Nachweis der Mutation verwendet wird. Schmelzkurven von Proben werden mit Schmelzkurven bekannter Mutationen oder Wildtyp-CALR verglichen. Unterschiedliche Schmelzkurven stellen eine andere Mutation dar, die nicht Typ 1 oder Typ 2ist 9.
Der Algorithmus für den somatischen genetischen Variantennachweis im CALR-Gen durch HRM, Agarosegelelektrophorese und Sequenzierungsmethode ( Abbildung 1 ) wurde in der vor10veröffentlichten retrospektiven Studie verwendet und validiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hochauflösende Schmelzen von DNA ist eine einfache Lösung für die Genotypisierung und das Scannen genetischer Varianten14. Es hängt von Sequenzunterschieden ab, die zu Heteroduplexen führen, die die Form der Schmelzkurve verändern. Verschiedene Arten von genetischen Varianten mit unterschiedlichen Häufigkeiten können in dem Gen beobachtet werden, das für eine bestimmte Gruppe von Patienten mit Krebsspezifisch ist 1,2,</su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken allen akademischen Experten und Mitarbeitern des Spezialisierten Hämatologielabors, Abteilung für Hämatologie, Abteilung für Innere Medizin, Universitätsklinikum Ljubljana.
Materials
| E-Gel EX 4% Agarose | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Optical adhesive film | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | Gel documentation systems |
| Primer CALRex9 Forward | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| Primer CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution. |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp. |
| ViiA7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| Water nuclease free | VWR, Life Science | 436912C | RNase, DNase and Protease free water |
References
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).
- Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
- Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
- Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
- Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) – More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
- Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
- Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
- Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. . QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (2015).
- Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. . High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (2011).
- Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. . High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , (2010).
- Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
- Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
- Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
- Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
- Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
- Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
- Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
- Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
- Voytas, D. Agarose Gel Electrophoresis. Current Protocols in Immunology. 2, (1992).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).
