Infektion av neonatal möss med bioluminescerande E. coli O1:K1:H7 resulterar i en septisk infektion med betydande pulmonell inflammation och lung patologi. Här beskriver vi förfaranden för att modellera och ytterligare studera neonatal sepsis med hjälp av längsgående intravital imaging parallellt med uppräkning av systematiska bakteriebördor, inflammatorisk profilering och lung histopatologi.
Nyfödda löper en ökad risk för bakteriell sepsis på grund av den unika immunprofil de visar under de första månaderna av livet. Vi har upprättat ett protokoll för att studera patogenesen av E. coli O1:K1:H7, en serotyp som ansvarar för hög dödlighet i nyfödda. Vår metod utnyttjar intravital imaging av neonatal pups vid olika tidpunkter under utvecklingen av infektion. Denna avbildning, parallellt med mätning av bakterier i blodet, inflammatorisk profilering och vävnad histopatologi, innebär en rigorös strategi för att förstå infektionsdynamik under sepsis. I den aktuella rapporten modellerar vi två infektiösa inokulat för jämförelse av bakteriebelastningar och sjukdomens svårighetsgrad. Vi finner att subscapular infektion leder till spridas infektion genom 10 h post-infektion. Genom 24 h, infektion av luminescent E. coli var rikligt i blodet, lungor och andra perifera vävnader. Expression av inflammatoriska cytokiner i lungorna är signifikant vid 24 h, och detta följs av cellulär infiltration och bevis på vävnadsskador som ökar med smittsam dos. Intravital avbildning har vissa begränsningar. Detta inkluderar en luminescent signal tröskel och några komplikationer som kan uppstå med nyfödda under anestesi. Trots vissa begränsningar, finner vi att vår infektion modell erbjuder en insikt för att förstå longitudinella infektion dynamik under neonatal murine sepsis, som inte har undersökts noggrant hittills. Vi förväntar oss att denna modell också kan anpassas för att studera andra kritiska bakterieinfektioner under det tidiga livet.
Bakteriell sepsis är ett betydande bekymmer för nyfödda som uppvisar en unik immunprofil under de första dagarna av livet som inte ger tillräckligt skydd mot infektion1. Neonatal sepsis fortsätter att vara en betydande amerikanska hälso-och sjukvårdsproblem står för större än 75.000 fall årligen i USA ensam2. För att studera dessa infektioner på djupet krävs nya djurmodeller som rekapitulerar aspekter av sjukdomar hos människor. Vi har etablerat en neonatal mus infektion modell med hjälp av Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli är den näst vanligaste orsaken till neonatal sepsis i USA, men ansvarig för majoriteten av sepsis-associerade dödlighet4,5. Det är dock den främsta orsaken när pre-term och mycket låg födelsevikt (VLBW) spädbarn anses självständigt5. Den K1 serotyp är oftast förknippas med invasiva blodomloppet infektioner och hjärnhinneinflammation hos nyfödda6,7. För närvarande finns det inga andra behandlingsalternativ utöver antibiotika och stödjande vård. Samtidigt fortsätter andelen antibiotikaresistens att stiga för många patogena bakterier, med vissa stammar av E. coli resistenta mot en mängd antibiotika som vanligen används vid behandling8. Således är det absolut nödvändigt att vi fortsätter att generera metoder för att studera mekanismerna för sepsis och värdsvaret hos nyfödda. Dessa resultat kan bidra till att förbättra nuvarande behandlingar och infektionsresultat.
Immuntillståndet hos nyfödda kännetecknas av både fenotypiska och funktionella skillnader jämfört med vuxna. Till exempel, förhöjda nivåer av antiinflammatoriska och regulatoriska cytokiner, såsom interleukin (IL)-10 och IL-27, har visat sig produceras av navelsträngen blod-härledda makrofager och är närvarande på högre nivåer i serum av murine nyfödda9,10,11. Detta är förenligt med lägre nivåer av IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 och TNF-α som ofta rapporteras från neonatalceller jämfört med vuxna motsvarigheter10. Dessutom är neonatal immunsystemet skev mot en Th2 och reglerande T cell svar jämfört med vuxna12. Förhöjda antal neutrofiler, T-celler, B-celler, NK-celler och monocyter finns också i nyfödda, men med betydande funktionsnedsättningar. Detta inkluderar defekter i uttryck av cellytan markörer och antigen presentation som tyder på omognad13,14,15. Dessutom är neonatal neutrofiler väsentligt bristfälliga i sin förmåga att migrera till chemotactic faktorer16. Myeloida-härledda suppressorceller (MDSCs) finns också på förhöjda nivåer hos nyfödda och nyligen visat sig vara en källa till IL-2711. MDC är mycket suppressiv mot T-celler17. Tillsammans visar dessa data begränsningar i neonatal immunitet som lånar ut till ökad mottaglighet för infektion.
För att studera utvecklingen av bakteriebördan och dissekera skyddande värd immunsvar under neonatal sepsis, har vi utvecklat en ny infektion modell. Neonatal möss vid dag 3-4 i livet är svåra att injicera i intraperitoneal utrymme eller svans ven. I vår modell, dag 3 eller 4 ungar administreras den bakteriella inokulat eller PBS subkutant in i scapular regionen. En systemisk infektion utvecklas och med hjälp av självlysande E. coli O1:K1:H7, kan vi längsgående bild enskilda neonatal möss att följa den spridas bakteriebördan i perifera vävnader. Detta är den första rapporterade modellen att utnyttja intravital avbildning för att förstå kinetiken av spridning av bakterier under sepsis i murine nyfödda3.
Här beskriver vi ett protokoll för att inducera septiska E. coli infektioner i neonatal möss3. Vi beskriver hur man förbereder bakteriell inokulat för injektion, och hur man skörda vävnad för bedömning av patologi, mätning av inflammatoriska markörer genom genuttryck analys och uppräkning av bakteriebördan. Dessutom beskrivs också användning av luminescent E. coli för intravital avbildning av infekterade nyfödda och kvantifiering av bakteriellt dödande av neonatal immunceller. Dessa protokoll kan också anpassas för att studera andra viktiga bakteriella infektioner hos nyfödda. De data som presenteras här representerar en övergripande roman strategi för att förstå infektion dynamik i en översättlig neonatal sepsis modell.
Vår subscapular infektion modell för att inducera bakteriell sepsis i neonatal möss är en ny metod för att studera den longitudinella spridningen av bakteriella patogener i realtid. Intravital avbildning ger möjlighet att utforska bakteriespridning i realtid hos nyfödda. Detta är avgörande för att förstå kinetiken vid bakteriespridning och att ytterligare studera värdresponsen och -skadan vid lämplig fas av sjukdom. Musungar administreras en subkutan, subscapular injektion av bakteriell inokulat. Denna inje…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av institutionella medel till C.M.R.
1 mL Insulin Syringe | Coviden | 1188128012 | Inoculum or PBS injection |
10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370-094 | Histopathology |
ACK Lysis Buffer | Gibco | LSA1049201 | Bacterial clearance assay |
Animal Tattoo Ink Paste | Ketchum | KI1482039 | Animal identification |
Animal Tattoo Ink Green Paste | Ketchum | KI1471039 | Animal identification |
Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Cell isolation |
Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) | N/A | N/A | Constructed in-house at WVU |
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bacterial growth |
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Real-time quantitative PCR |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
Isolation Buffer | Miltenyi Biotec | N/A | Bacterial clearance assay |
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Intravital imaging |
LB Broth, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bacterial growth |
EASYstrainer (Nylon Basket) | Greiner Bio-one | 542 040 | Cell strainer |
SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Plate reader |
Pellet Pestle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Tissue homogenization |
Polypropylene Pellet Pestles | Grainger | 6HAY5 | Tissue homogenization |
Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |