EFAデコンボリューションとスキャッタによるSEC-SAXSデータの分析

1. タンパク質発現、精製およびSEC-SAXS測定は、公表されたプロトコル13に基づいています インライン SEC-SAXS データ収集プロトコル (Brennich ら6)に簡単に従ってください。 SEC 実行バッファーの少なくとも 2 つの列ボリューム (20 mM Tris-HCl、pH 7.5、100 mM NaCl) を使用して SEC 列を平衡化します。 E9エキソマイナス のサンプル50 μLを8\u201210 mg/mLで調製し、部分的なdsDNAのモル過剰が20%(TCAGGAAGAACAGCGGTTTAGCCとGGCTAAACCACCGCTTATCTTTTCTT)E9 exoマイナスは 、12 ± 6 nM の KD と結合します ( 補足データを参照)。 このミックスの50 μLをSECカラム(S200増加)にインラインで注入し、SAXS測定用のフローセルを0.3 mL/minで測定します。 1 s 露出で 1000 フレームを収集します。注意: BioSAXSビームラインBM29では、欧州シンクロトロン施設(ESRF)で個々のフレームがEDNAフレームワーク14内で自動的かつ独立して処理されます。データ収集後、ISPyBデータベース20 を開き、 データ取得 タブの下で [Go] ボタンを押して、データセットと自動分析21の結果にアクセスします。 データをダウンロードします。 2. 一次データ分析 Java ベースのプログラムを開く スキャッタIV (を参照してください。 資料表)をクリックし、サイズ除外クロマトグラフィー(SEC)データのバックグラウンド減算を実行します。 実験の詳細を編集し、[ 詳細を編集] ボタンを使用して、できるだけ多くのフィールドに記入し、これらは、データを収集するために使用されたソース/ビームライン、収集パラメータとサンプルの詳細にセクションが含まれています。これらはデータと共に保存され、今後のパブリケーションで「データ収集パラメータ」セクションに簡単にデータを入力できるようになります。 [ 名前を付けて保存 ] ボックスにサンプル名を入力します。 [トレース] をクリックします。注: これには 2 つの効果があります。まず、データの *.sec ファイルを作成します。これは、個別の *.dat ファイルからすべての実験観測を照合する単一のテキスト ファイルです。さらに 、*.sec ファイルには、バッファバックグラウンドであるフレームの平均セット、平均化で使用されるすべてのフレーム、およびSEC-SAXS実験全体でのバッファバックグラウンド減算フレームが含まれます。次に、フレーム数対積分比を背景にプロットするシグナルプロットが作成されます。バッファ減算で平均化された選択したフレーム(灰色)が表示されます。平均バッファのポイントは、データの全範囲から決定されます。しかし、不十分に平衡化またはダーティカラムまたは毛細血管汚れ22のために、不十分に定義された背景として平均化するためのバッファフレームを手動で選択することをお勧めします。 バッファー フレームを手動で選択します。[ バッファのクリア ]をクリックし、トレースカーブ上で左クリック/ドラッグでバッファ領域を再選択します。理想的には、これは約100フレームのSECカラムのボイド体積の前のフラットな領域でなければなりません。[ バッファの設定 ] をクリックし、[ 更新] をクリックして、数分かかる可能性がある *.sec ファイルを再計算します。 関心のある地域 (ROI) を特定します。シグナルプロットで、左クリック&ドラッグで、対象のピークの領域を選択します。注: 右側のパネルに 3 つのプロットが表示されます。上の 2 つのプロットは、それらの間を移動する十字線とリンクされ、2 番目の信号プロット (右上) は選択した ROI のみを示し、各フレームの強度は青、対応する Rg は赤、対応するヒート マップはダービン-Watson 自動相関分析に従って色付けされた各フレームの残差を示します。類似性の高い領域はシアン(ダービン・ワトソン、d = 2)を着色し、異なるフレームは暗い青色からピンク色に続き、最後は異なる類似性の重症度に応じて赤に続きます(d> 2)。下のプロットは、中央で選択されたフレームの(垂直線でも示される)の、引いた I 対 q 曲線です。矢印キーを使用して、減算されたフレーム間を移動できます。 I 対 q プロットは、SEC 実験から減算されたフレームの品質を示します。 マージするフレームを選択します。ヒート マップ プロットのクロスヘアをクリックして、マージに使用するフレームのサブセットを選択します。十字線は、主に十字の右下に落ちる主にシアンの三角形の領域を識別します。これらのフレームを選択済みに設定し、上の信号プロットの対応する領域でフレームをハイライトするには、マウスクリックを使用します。これらのフレームは、理想的には安定したRgを有する領域を強調する必要があります。注: 必要に応じて、左クリックでヒート マップを拡大し、右に左クリックでズーム アウトします。 選択したフレームに問題がなければ 、[MERGE]をクリックします。これにより、減算されたフレームがマージされ、[ 分析 ]タブに表示されます。 3. データのデコンボリューション デコンボリューションプログラムを開きます(例えば、BioXTAS Raw 2.0.0)。 デコンボリューション プログラムで、データセットを読み込み、[ ファイル ] タブの [コントロール パネル]で、データを見つけるか、場所をコピーしてアドレス バーに貼り付けます。注: フォルダーに含まれているのは、生の *.dat ファイルのみで、処理済みまたは平均データ ファイルがないことを確認します。 すべての *.dat ファイルをハイライトし、 プロットシリーズ ボタンを押すと、統合強度対フレーム番号のプロットが「シリーズプロット」に描画されます。 コントロール パネル で[ 系列 ]タブを選択し、クリックして曲線をハイライト表示します。コントロールパネルの下部にあるボタンを使用して 、LC分析 ポップアップウィンドウを開きます。このウィンドウでは、さまざまな種類の分子 (タンパク質または RNA) を選択するなど、いくつかのオプションにアクセスできます。また、ユーザーはプロットのバッファー領域を選択することもできます。最初のインスタンスで [自動 ]をクリックし、適切なバッファ領域を選択します。注: これが失敗した場合、おそらくベースラインが不安定なために、バッファ領域を最適化するために「領域を追加」。これにより、[バッファー] ボックスに小さなボックスが表示され、バッファに使用するフレーム番号を手動で追加できます。または、「ピック」をクリックして、プロット上の領域を選択するオプションを指定します。領域を見つけ、開始位置を左クリックし、カーソルを次の位置に移動し、もう一度左クリックします。複数のバッファ位置を追加する必要がある場合があります。[ バッファを設定 ]をクリックすると、カーブが減算され、SECピークを越えてRgが計算されます。ポップアップ ボックスが表示されたら 、[OK]をクリックします。 進化因子分析(EFA)を開始するには、下部にあるハイライト表示されたファイルを右クリックします。 コントロール パネル を選択し、 Efa メニューから。データ・セットの単一値分解 (SVD) を示すポップアップ・ウィンドウが開くことを確認します。コントロール ボックスで、[フレームを 使用 ]ボックスをオンにして、デコンボルテージするピーク領域全体が強度プロットで覆われるようにします。右上の「単数値」プロットは、ベースライン上の単数形値(別々のピーク/種)の強度を示します。注: ベースラインの上に存在するポイントの数は、存在する散乱種の数を表します。重要なのは、平坦な領域/ベースラインに対する単数形値の相対的な大きさであるという注意点です。 単一値の数を検証するには、最下部の 自己相関 プロットを使用します。これは、右と左の単一相関ベクトルを示しています。[ 次へ] をクリックします。注: これらは、本質的に、解析内のベクトルの散乱または濃度プロファイルを表します。絶対サイズはベクトルの有意性を表します。重要なコンポーネントは、1 の近くに自己相関があります (経験のカットオフの法則は >0.6\u20120.7)。RAW はこれを有益に計算し、必要に応じて変更できますが、左下の#Significant SVボックスに表示されます。単一値が複数ある場合(例えば4+など)、使用されるデータの範囲を変更して、コンポーネントの2つまたは3つだけを見る必要があるかもしれません。コンポーネントの数が少ないほど、EFA分析は簡単になりますが、使用するデータが少なくなります。複雑な状況では、左右の単一ベクトル(類似)が一致しない場合、有意なSV数を減らし、左右の単一ベクトルが類似するまで使用されるフレーム数を減らします。 EFA が各ベクトルの前方方向と後方方向のプロットを生成して計算されることを確認します。これらのプロットは、選択したSEC-SAXSデータの解析プロファイルを、コンポーネントが開始(前方プロット)および終了(逆方向プロット)したときに表示されます。RAW は、これらの範囲を識別しようとします。カウンタの横にある矢印を使用してこれらを変更し、各円がベースラインから上昇またはベースラインに落ちる変曲点の始点になるようにします。[ 次へ] をクリックします。注: EFA の最後の段階では、SVD ベクトルがスキャッタリング カーブに戻ります。ウィンドウの左側には、前に定義した範囲が上部にプロットされます。これらの範囲は、単数形ベクトルを回転させて散乱カーブに戻す場所を定義する拘束です。右手パネルは、それぞれの分離されたピークに対応する散乱曲線プロファイルを示しています。各ピークの濃度のプロット、それは溶出プロファイルの代表であり、平均誤差加重chi2のプロットである必要があります。chi2 プロットは、デコンボリューション・データ・セットを元のデータ・セットに測定しています。理想的には、これは平坦ですが、スパイクがしばしば見られます。 コンポーネント範囲コントロールを変更してスパイクを減らすか除去しようとし、まずどのフレームがスパイクに対応するか(chi2プロットから)、次に、どのコンポーネントがこのフレームを含む(複数の可能性がある)、矢印を使用して対応する範囲を上下に移動します。注: これは、スパイクを増減する応答を生成する必要があります。スパイクフレームが複数のコンポーネントに存在する場合は、各コンポーネント間の試行錯誤が必要になる場合があります。 最小の chi2 が達成されたら、 戻るをクリックして検証チェックを実行し、前のウィンドウが表示され、変更が元の EFA プロットを大幅に変更したかどうかを確認できます。それでも有効な場合は、[ 次へ] をクリックします。 [EFA データの保存 ] をクリックしてプロットを保存し、[ 完了] をクリックします。をクリックして EFA ウィンドウを閉じます。注: 2 つ目の検証では、各コンポーネント範囲の横にあるチェックボックスをオフにします。これらの値は、各成分に正の濃度制約を与え、オフにすると、これらの値がデータ セットに大きく影響するかどうかがチェックされます。濃度プロットに変化が見られない場合、データは有効です。 RAW ウィンドウに戻り、コントロール パネルの [プロファイル] タブをクリックして曲線を表示し、コントロール パネルの [操作] タブで、ファイルを右クリックしてメニュー ポップアップから選択したファイルを保存するを選択して、さらにカーブを操作するか、*.datファイルとして保存します。ファイルを保存します。さらに分析するために散布図 IV を使用します。注: デコンボリューションと EFA BioXTAS RAW に関する詳細と説明は、https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/ 4. SAXS プロパティの決定 注: SAXS の決定に関する詳細なチュートリアルは、Bioisis.netにあります。ここでは、スキャッタで最も便利なボタンを強調する基本的なステップバイステップアプローチを示します。 [散布図 分析 ]タブで、各サンプルファイルの右側にある手動Guinier解析ツールの G ボタンを押します。開いたプロットは、上部ボックスにln[I(q)] 対 q2、 下部のボックスに対応する残差を示します。残差に「笑顔」または「眉」機能がないようにポイントを追加または削除します。ギニエフィットで選択したデータは、最大 q x Rg 制限の 1.3 を超えないようにしてください。 正規化されたクラッキーボタンを押します。ポップアップするプロットは、質量と濃度のために正規化された高分子の構造状態の半定量的評価を提供します。注意:十字線は(√3、1.1)19でギニエ・クラツキー点を指定します。コンパクトな球状のタンパク質は、ギニエ・クラツキー点で最大値を持つ単一のピークを示します。本質的に乱れたまたは円筒形の生体高分子は、十字線よりも最大大きく、減少しないであろう。折り畳まれたドメインと長い細長い非構造化領域の両方を持つタンパク質は、十字線を通して最大が増加する可能性がありますが、q x Rgの高い場合にも明らかな減少傾向を示します。 Vcボタン (相関の体積) をクリックすると、2 つのプロット、総散乱強度、および総散乱強度の積分領域が q の関数として表示されます。プロットは、散乱曲線の品質を検証するためのクイック リファレンスとして使用されます。注: 総散乱強度は I(0) に敏感であり、これが正しく測定されていない場合、プロットは連続した線を表示しません。積分面積プロットは、理想的には、各SAXS曲線に対して拡張された高原を有するシグモイド線を示すべきである。バッファーの不一致/減算がある場合、サンプルの凝集または粒子間干渉は、より高い q 値で鋭い傾きを観察します。 柔軟性の分析を開始するには、[ 柔軟性 ] ボタンを押します。ウィンドウが開き、ウィンドウの下部に 4 つのパネルとスライダーが表示されます。開かれた各パネルは、コンパクトと細長い/柔軟なバイオポリマー23の間に存在するパワー・ロー関係を利用するプロットを示しています。使用するには、ボックスの下部にあるスライダーを右から左へ動かし、マウスの左ボタンを押します。プロットの1つに高原が到達するまで、ゆっくりと左に移動し続けます。注: プラトーが Porod-Debye プロットに見られる場合、サンプルは本質的にコンパクトであり、正規化されたクラツキープロットのギニエ・クラツキー点の単一のピークと一致するはずです。プラトーがクラッキー・デバイプロットで最初に到達した場合、サンプルは細長または柔軟である可能性が最も高いです。SIBYLSプロットが最初に高原に対するものである場合、サンプルにはコンパクトさと柔軟性の両方の領域、混合状態の粒子が含まれている可能性が最も高い。この柔軟性とPorod-Debye法との関係の理論は、ランボーで絶妙に取り上げ,他 [ボリューム] をクリックします。ボリュームの決定は、上記からの柔軟性分析の直後に行う必要があります。柔軟性分析後に開くと、さらに3つのグラフを含むポップアップが生成されます。下の左隅のPorod-Debye プロットは、柔軟性プロットからスライダーを離れ、高原領域を示す場所を覚えています。 パーティクルのボリュームを計算するには、矢印ボタンを使用して開始と終点を移動するか、ボックスに入力して、プロット上の青い線が高原領域に合うようにします。公平な結果の場合、右上のポロート・デバイ指数の指数力則適合の残差は、パターンを示さないはずです。 P(r)タブを押します。実際の空間分布は、左側のパネルと右側のパネルのサンプルの散乱曲線にあります。目的は、逆空間 SAXS 曲線からサンプルの実空間表現を作成することです。理想的には、分布曲線は波が存在しない滑らかで、x軸に優しくキスする必要があります。注:測定されたQ範囲は、緩衝性の一致、凝集、放射損傷、最適でない露光時間、粒子濃度の低さにより、完全には使用できない場合があります。P(r)決定ステップは、SAXS データセットの使用できる qmin および qmax 範囲を基本的に決定し、後続のモデリングまたは適合に使用されるこの範囲のデータである必要があります。 サンプル名を右クリックし 、[DMAX の検索 ] をクリックして新しいウィンドウを開きます。dmax の制限は、推奨される qmax (最大データポイントが使用される)、下限と上限 dの上限 、およびアルファスコアの下限と上限があらかじめ設定されています。3つのモデル(L1ノルム、レジェンドレとムーア)と背景の使用が含まれて選択することができます。最初のインスタンスでは、これらの値は変更しません。 [スタート]ボタンを押します。左パネルに複合分布が作成され、その下に推奨される dmaxおよび alpha レベルが書き込まれます。これが許容できると思える場合は、ウィンドウを閉じて P(r) タブに戻ります。相互空間プロットは、提案されたqmaxに合わせてトリミングされます。 モデルムーアを選択し、[背景]をクリックし、アルファレベルとdmaxをポップアップボックスから提案された値に設定します。絞り込みボタンを押します。クロス検証プロットがポップアップ表示され、ポイントが拒否される必要があるかどうかを赤色で示します。少数の点だけが拒否され、分布が良好に見える場合、モデルは良好です。注: クロス検証プロットは、決定されたP(r)分布と矛盾するデータの領域をハイライト表示します。拒否された領域が主に低q領域、つまりy軸付近の領域である場合、これはdmax が短すぎる、凝集または高次オリゴマーの存在を示唆している可能性があります。これは、高い解像度と低解像度の情報の間の不整合を強調しています。ここでは、d max および qmin (開始値の増加) は、手動の試行錯誤アプローチを使用して調整する必要があります。同様に、拒否された領域が主に高q領域にある場合、これはバックグラウンド減算の問題や、決定されたP(r)分布によって意味を持って説明できない信号が弱すぎることを示している可能性があります。この場合、追加のデータが拒否されなくなるまで、qmax は切り捨てられる (終了を減らす) 必要があります。理想的には、拒否されたポイントはランダムに分布し、使用できるデータの5%未満を構成する必要があります。適切に定義された q分、qmax、 および “dmax”は、dmax が x 軸にキスする滑らかな分布を生成します。ただし、この値を大きくして、ギニエリージョンを完全に削除しないでください。この点は 、q x l(q) ボックス(表の上のパネルの左側)をチェックすることで簡単に見つけることができます。このカーブ上の最大変曲がギニエ領域の一部になる前に、この曲線上の散乱曲線は「総散乱強度プロット」に置き換えられます。ポイントを削除した後、もう一度 “dmax”を増減し、もう一度調整してみてください。問題が解決しない場合、特に検証曲線の先頭から多くのポイントが拒否されている場合、データが構造モデリングに適していないことを強く示唆しています。 レポートを印刷するには、[ 分析 ] タブに戻り、サンプルを左クリックしてハイライト表示し、サンプル名を右クリックして、メニューの [単一データ セットからレポートを作成 ] に移動します。テキスト ボックスが開き、コメントを追加できます。生成されたすべての図と値を示す PDF ドキュメントが生成されます。