通过 EFA 去卷和散射分析 SEC-SAXS 数据

1. 蛋白质表达、纯化和SEC-SAXS测量基于已发布的协议13 简言之，遵循内联SEC-SAXS数据收集协议（Brennich等人6）。 将 SEC 列与至少 2 列的 SEC 运行缓冲区（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，100 mM NaCl）进行平衡。 在 8μ u201210 mg/mL 下制备 50 μL 的 E9 exo 减号样本，摩尔超过 20% 的部分 dsDNA（TCAGGAAGATAACAGCGGTTTAGTAGTC 和 GGCTAACCCTTTTTTTTTTT）。E9 exo减与 K D 的 KD为 12 ± 6 nM（参见补充数据）。 将 50 μL 的这种混合物注入与 SAXS 测量的流量单元内联的 SEC 柱 （S200 增加） 上，测量温度为 0.3 mL/min。 收集 1000 帧，每个曝光 1 s。注：在欧洲同步加速器设施（ESRF）的BioSAXS光束线BM29上，各个帧在EDNA框架14中自动独立处理。数据收集后，打开 ISPyB 数据库20， 在 数据采集选项卡 下按 Go 按钮访问数据集和自动分析结果 21。 下载数据。 2. 主要数据分析 打开基于 Java 的程序 散射四 （请参阅 材料表）对大小排除色谱 （SEC） 数据执行背景减法。打开SEC选项卡。将缩减的数据文件 （*.dat）拖到”下面的数据”窗口中。通过单击蓝色标记的输出 Dir 按钮，设置输出目录”输出 Dir ：：”。注：如果数据是在nm-1中收集的，则在将文件放入窗口或减法选项卡时，需要选中转换框（面板左下角）。 编辑实验详细信息，使用 “编辑详细信息 “按钮并填写尽可能多的字段，其中包括用于收集数据的源/光束线、收集参数和示例详细信息的部分。这些将保存在数据中，并允许在将来的出版物中更轻松地填充”数据收集参数”部分。 在”另存为” 框中输入示例 名称。单击 TRACE。注意：这有两个效果。首先，它将为数据创建 一个 *.sec 文件。这是一个文本文件，将整理从单独的 *.dat 观察。此外 ，*.sec 文件包含缓冲区背景的平均值集、平均中使用的所有帧以及整个 SEC-SAXS 实验中的缓冲区背景减法帧。其次，创建一个信号图，该图绘制帧数与整体比的背景。这显示了缓冲区减法的选定帧（灰色）。平均缓冲区的点从整个数据范围确定。但是，建议手动选择平均缓冲帧，因为由于平衡性差或脏柱或毛细管污染22，可能会出现定义不佳的背景。 手动选择缓冲区框架。单击 “清除缓冲区 “，然后在曲线曲线上重新选择具有左键单击拖动的缓冲区区域。理想情况下，这应该是大约 100 帧的 SEC 列空隙体积之前平坦区域。单击 “设置 缓冲区 “， 然后更新以重新计算可能需要几分钟时间的 *.sec 文件。 确定感兴趣的区域 （ROI）。在信号图上，使用左键拖动选择感兴趣峰值区域。注：这将在右侧面板中填充三个绘图。前两个图与它们之间的十字线链接，第二个信号图（右上）仅显示所选的 ROI，每帧的强度为蓝色，每个帧的相应 Rg 以红色显示，下面显示相应的热图，显示根据 Durbin-Watson 自动关联分析着色的每帧的残差。高度相似的区域是彩色青色（Durbin-Watson，d = 2），而不同的帧将遵循深蓝色到粉红色，最后是红色，具体取决于差异的严重性 （d > 2）。底部图是中央选定帧的减去I与q曲线（也由垂直线表示）。箭头键可用于在减法帧中导航。I 与q图将演示 SEC 实验中减去的帧的质量。 选择要合并的帧。单击热图图中的十字线，选择将用于合并的帧子集。十字线将识别一个三角形区域，以青色为主，落在十字线右下角。使用鼠标单击将这些帧设置为选定，并突出显示上面信号图相应区域中的帧。理想情况下，这些帧应突出显示具有稳定 Rg 的区域。注：根据需要，使用左键单击拖动放大热图，然后向左单击向右轻扫缩小。 当对所选帧满意时，单击 MERGE。这将合并减去的帧，并将其呈现在”分析 “选项卡 中。 3. 数据去卷 打开去卷积程序（例如，BioXTAS 原始 2.0.0）。 在”去卷积”程序中，在” 控制 面板”中的”文件” 选项卡下加载数据集，使用折叠符号来定位数据或复制该位置并将其粘贴到地址栏中。注意：确保文件夹仅包含原始 *.dat 文件，没有处理或平均数据文件。 突出显示所有 *.dat， 点击 “绘图系列” 按钮，将在”系列图”中绘制集成强度与帧数的绘图。 在” 控制面板 “中选择 “系列 “选项卡，然后单击以突出显示曲线。使用控制面板底部的按钮打开 LC 分析弹出窗口。此窗口提供多种选择，例如选择不同的分子类型（蛋白质或RNA）。它还允许用户为绘图选择缓冲区。在第一个实例中 单击”自动 “;这应该选择合适的缓冲区。注：如果此操作失败，可能是因为基线不稳定，则”添加区域”以优化缓冲区区域。这将用较小的框填充缓冲区框，其中可以手动添加帧编号以用于缓冲区。或者，单击”选择”以选择在绘图上的区域。找到该区域，左键单击一次开始位置，将光标移到下一个位置，然后再次左键单击。可能需要添加多个缓冲区位置。单击”设置缓冲区”，曲线将减去，并在 SEC 峰值中计算 Rg。如果出现弹出框，请单击”确定”。 要开始演化因子分析 （EFA），请右键单击 控制面板 然后选择 Efa 从菜单。检查弹出窗口中打开，该窗口显示数据集的单个值分解 （SVD）。在”控制”框中， 选中” 使用帧”框，以便强度图中覆盖整个要解变的峰值区域。”单数值”图（右上方）显示基线上方的奇异值（单独的峰值/物种）的强度。注：基线上方的点数表示存在散射物种的数量。需要注意的是，重要的是单数值对平面区域/基线的相对大小。 若要帮助验证单个值的数量，请使用底部 的自动关联 图。这显示了左右单相关向量。单击下 一步。注：这些基本上表示溶液中矢量的散射或浓度配置文件。其中绝对大小表示矢量的重要性。重要组件的自相关关系接近 1（经验法规则截止值为 >0.6\u20120.7）。RAW 有助于计算此值，显示在左#Significant SVs 框中，但如有必要，您可以更改此值。如果存在多个单个值（例如 4+），则可能只需要查看 2 个或 3 个组件，从而更改使用的数据范围。组件数量越小，EFA 分析就越容易，但代价是使用更少的数据。在复杂情况下，在左侧和右侧奇异矢量（应相似）不匹配时，会减少大量 SV 数，并减少使用的帧数，直到左右奇异矢量相似。 检查 EFA 是否通过在每个矢量的前进和后退方向中生成绘图来计算 EFA。这些绘图显示组件何时开始（前进图）和退出（向后绘图）所选 SEC-SAXS 数据的解决方案配置文件。RAW 尝试识别这些范围;使用计数器旁边的箭头更改这些，以便每个圆位于从基线上升或下降到基线的拐点的起点。单击下 一步。注：EFA 的最后阶段将 SVD 矢量重新转换为散射曲线。在窗口的左侧，以前定义的范围绘制在顶部。这些范围是用于定义将奇异矢量旋转回散射曲线的参数的约束。右面板显示每个分离的峰值的这些相应的散射曲线轮廓。每个峰值的浓度图，应代表洗脱配置文件，以及平均误差加权 chi2 的绘图。chi2 图正在测量到原始数据集的去卷积数据集。理想情况下，这将是平的，但尖峰经常可以看到。 尝试通过更改”组件范围控件”来 减少或消除峰值，首先确定大约哪个帧对应于峰值（从 chi2 图），然后在 范围控件 中，哪个组件包含此帧（它可能不止一个），使用箭头，向上或向下移动相应的范围。注意：这应该会产生响应，增加或减少峰值。如果尖峰帧存在于多个组件中，则可能需要在每个组件之间进行一些试验和错误。 当达到最小 chi2 时，通过单击”返回”执行验证 检查，上一个窗口似乎允许验证所做的更改是否已彻底改变原始 EFA 图。如果它们看起来仍然有效，请单击”下一步 “。单击 “保存 EFA 数据 “以保存绘图，然后单击”完成 “;关闭 Efa 窗口。注：第二个验证是按每个组件范围旁边的复选框进行又一次。它们为每个组件提供正浓度约束，关闭将检查这些约束是否显著影响数据集。如果在浓度图中未看到任何更改，则数据有效。 回到 RAW 窗口中，单击”控制面板”中的”配置文件”选项卡以查看曲线，并在”控制面板的操作”选项卡中查看曲线，进一步操作曲线或通过右键单击文件并选择从菜单中弹出的保存选定文件来将曲线另存为 *.dat 文件。保存文件。使用散点 IV 进行进一步分析。注：有关去卷积和 EFA BioXTAS RAW 的进一步信息和说明https://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/ 4. 确定 SAXS 属性 注：在”分析”中找到有关 SAXS 测定的Bioisis.net。在这里，我们展示一个基本的分步方法，突出显示散点中最有用的按钮。 在”散点分析”选项卡中，按每个示例文件右侧的手动 Guinier 分析工具的 G 按钮。打开的绘图显示顶部框中的 ln=I（q）与 q2和底部框中的相应残差。添加或删除点，使残差没有”微笑”或”皱眉”功能。Guinier 拟合中的选定数据不应超过 1.3 的最大q x Rg 限制。 按 规范化的克拉特基 按钮;弹出的地块提供了对大分子结构状态的半定量评估，对质量和浓度进行规范化。注：十字线指定吉尼尔-克拉茨基点（√3，1.1）19。一个紧凑的球形蛋白质将显示一个峰值，在吉尼尔-克拉茨基点具有最大值。内在紊乱或圆柱形生物聚合物的最大大于十字线，不会减少。具有折叠域和长拉长非结构化区域的蛋白质可能通过十字线增加最大值，但在较高的 q x Rg 时也会表现出明显的下降趋势。 单击 Vc 按钮 （关联量），该按钮将显示两个绘图，即总散射强度和总散射强度的集成区域，作为 q 的函数。这些绘图用作验证散射曲线质量的快速参考。注：总散射强度对 I（0） 敏感，如果测量不正确，则绘图不会显示连续线。理想情况下，集成区域图应显示每个 SAXS 曲线的延伸高原的 sigmoid 线。如果样品中存在缓冲区不匹配/减法、聚合或粒子间干扰，则在较高的 q 值下将观察到锐斜率。 按 “灵活性 “按钮开始灵活性分析。这将打开一个窗口，底部有四个面板和一个滑块。每个打开的面板显示一个情节，利用权力-法律之间的关系，存在于紧凑和拉长/灵活的生物聚合物23。要使用，请按住鼠标左键，将框底部的滑块从右向左移动。继续缓慢地向左移动，直到到达其中一个地块中的高原。注：如果在波罗德-德拜图中可以看到高原，则样本的性质是紧凑的，这应该与规范化的克拉茨基图中的吉尼尔-克拉茨基点的单峰一致。如果在克拉茨基-德拜图中首先到达高原，则样本很可能是拉长或灵活的。如果 SIBYLS 图是首先稳定，那么样本很可能包含紧凑性和灵活性的区域，即具有混合状态的粒子。兰博等人对与波罗德-德拜定律的这种灵活性关系的理论非常有研究。 单击 音量。在从上面进行灵活性分析后，应立即进行卷确定。在灵活性分析后打开时，将生成一个包含三个图形的弹出窗口。在底部，左角的Porod-Debye绘图记得从灵活性图中离开滑块的位置，显示稳定区域。 要计算粒子的体积，请使用箭头按钮移动起点和端点或在框中键入，以便绘图上的蓝线适合稳定区域。对于一个公正的结果，在右上波罗德-德拜指数权力定律拟合的残差，不应显示任何模式。 按 P（r） 选项卡。实际空间分布位于左侧面板中，右侧面板中样本的散射曲线。目标是从倒数空间 SAXS 曲线创建样本的实际空间表示。理想情况下，分布曲线将是平滑的，没有波存在，应该只是轻轻地亲吻x轴。注：由于缓冲液匹配、聚合、辐射损伤、曝光时间次次及颗粒浓度低，仪器的测量 q 范围可能不完全可用。P（r） 确定步骤将从根本上确定SAXS数据集的可用q最小值和 q 最大值范围，并且该范围的数据应用于任何后续建模或拟合。 右键单击示例名称，然后单击 “查找 DMAX” 以打开新窗口。d 最大值的限制预先 设置了建议的q 最大值（使用的最大数据点）、下限和上限 d最大值限制 以及下部和上限阿尔法分数。可以选择三个模型（L1 规范、传奇和摩尔）以及包含背景的使用。首先保持这些不变。 按”开始 ” 按钮。在左侧面板中创建复合分布，下面写入建议的 d 最大值 和 Alpha 级别。如果这看起来可以接受，则关闭窗口并返回到 P（r） 选项卡。倒数空间图将被裁剪，以匹配建议的 q最大值。 选择模型 摩尔，单击 背景 ，然后设置阿尔法水平和d最大值 到建议值从弹出框。按细化 按钮 。将弹出一个交叉验证图，显示是否必须拒绝任何点，以红色标记。如果只有几个点被拒绝，并且分布看起来不错，那么模型是好的。注：交叉验证图将突出显示与确定的 P（r） 分布不一致的数据区域。如果被拒绝区域主要位于低 q 区域，即 y 轴附近的区域，这可能表示 d最大值 太短，存在聚合或高阶寡聚物。它突出了高分辨率和较低分辨率信息之间的不一致。在这里，应 使用手动、 试错方法调整最大和 q 最小值（增加开始值）。同样，如果被拒绝区域主要位于高 q 区域，这可能表示背景减法的问题，或者信号太弱，无法由确定的 P（r）分布进行有意义的解释。在这种情况下，qmax 应截断（递减结束），直到没有拒绝其他数据。理想情况下，被拒绝的点应随机分布，并占可用数据的不到 5%。正确定义的 qmin、q最大值和 “dmax”将产生平滑的分布，其中 d最大值 亲吻 x 轴。但是，不要增加此值太多，以完全删除 Guinier 区域。通过检查 q x l（q） 框（ 在表上方的面板左侧），很容易找到此点。散射曲线被”总散射强度图”所取代，在此曲线上，最大拐点之前的所有点都是吉尼尔区域的一部分。移除点后，请重试增加/减少”d最大值”，然后再次优化。如果问题仍然存在，特别是当许多点从验证曲线开始时被拒绝时，这强烈地表明数据不适合结构建模。 要打印报表，请导航回 “分析” 选项卡，左键单击以突出显示示例，然后右键单击示例名称，然后 从菜单中的单个数据集移动到”创建 报表”。将打开一个文本框，以允许添加注释。将生成一个 PDF 文档，显示生成的所有数字和值。