뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

단일 클론 항체는 주류 의학의 일부가됨에 따라 점점 많은 인간 질환에 대한 선택 요법이되고있다^1,2. 우리는 이전에 마우스 IgH ^constants3,4를 가진 완전히 인간 변수 지역을 항구하는 항체를 능동하게 생성하는 유전자 조작 마우스를 기술했습니다 ^3,4. 가장 최근에, 우리는 뚜렷한 항원 결합5가 있는 항체 같이 분자를 생성하는 유전자 조작한 마우스를 기술했습니다⁵. 항체는 B 세포에 의해 분비되고 적응성 유머 면역의 기초를 형성합니다. B 세포, B-1 및 B-2의 2개의 명백한 모형이 있습니다. 포유동물에서 B-1 세포는 태아 간에서 유래하고 출생 후 점막 조직및 흉막 및 복막 구멍에서 풍부하게 되며, B-2 세포는 출생 전 과 그 이후 골수 (BM)에서 태아 간에서 유래한다. B-2 세포는 비장 과 혈액^6,7,8을 포함하여 이차 림프성 기관에서 농축된다. BM에서, B-2 조혈 선조는 Ig mu 무거운 사슬 재배열^9,10의 개시에 프로 B 세포를 분화하기 시작합니다. Ig 중형 사슬과 조립을 사전 B세포 수용체(pre-BCR)로 성공적으로 재배열하여 시그널링 및 증식 확장과 함께 사전 B 세포로 분화합니다. 사전 B 세포가 Ig kappa(Igθ)를 재배열하거나 비생산적인 경우 Ig lambda(Igλ) 광 사슬을 재배열한 후 μ 무거운 사슬과 결합하여 표면 IgM BCR 발현이 발생합니다. IgM 표면 발현은 자가 반응성 조건하에서 감소되는 것으로 알려져 있으며, 따라서 기능적으로 반응성이 없거나 식욕 부진 B ^cells11,12에서 자기 허용오차에 기여하는 것이 중요하다. 미숙한 B 세포는 전환 단계에 들어가서 IgD를 공동 발현하고 BM에서 비장으로 이동합니다. 비장에서, IgD 발현은 더 증가하고 세포는 과도기 B 세포의 두 번째 단계로 성숙하고, 그들의 성숙 상태 및 한계 영역 (MZ) 또는 여포 (Fol) 세포로 의 발달의 완료에 선행됩니다13,14,15. 성인 마우스에서, 비병 환경에서, 성숙한 B 세포의 수는 BM에서 매일 생성되고 10-20000,000,000미성숙 B 세포에도 불구하고 일정하게 남아 있습니다. 이 중 3%만이 성숙한 B 세포의 풀을 입력합니다. 말초 B 세포 구획의 크기는 세포 사멸에 의해 제한되며, 부분적으로자가 반응성 및 불완전한 성숙을 포함한 여러 가지 요인으로 인해 ^16,17,18. 유동 세포 측정 분석은 인간과 마우스에 있는 많은 면역 세포 하위 구획을 특성화하고 예매하기 위하여 광범위하게 이용되었습니다. 인간과 뮤린 B 세포 구획 사이에 는 몇 가지 유사점이 있지만,이 프로토콜은 뮤린 B 세포의 분석에만 적용됩니다. 이 프로토콜은 유전자 조작이 B 세포 발달을 바꿀 지 여부를 결정하기 위해 유전자 조작 된 마우스를 phenotyping의 목적으로 개발되었습니다. 유동 세포측정은 또한 세포 활성화, 기능, 증식, 사이클 분석, DNA 함량 분석, 세포 분석, 세포 분류 ^19,20을 측정하는 등 많은 추가 응용 분야에서 큰 인기를 끌고 있다.

유동 세포측정은 비장, BM 및 혈액과 같은 복잡한 장기를 포함하여 마우스와 인간에서 다양한 림프구 구획을 특성화하는 데 선택하는 도구입니다. 유세포측정을 위한 마우스 특이적 항체 시약으로 인해, 이 기술은 세포 표면 단백질뿐만 아니라 세포내 인포단백질 및 사이토카인뿐만 아니라 기능적인 ^readouts21을 조사하는 데 사용될 수 있다. 본명 우리는 이차 림프구 기관에서 성숙하고 분화할 때 B 세포 하위 집합을 식별하는 데 어떻게 유동 세포 측정 시약을 사용할 수 있는지 보여줍니다. 염색 조건, 시료 처리, 올바른 계측기 설정 및 데이터 수집, 마지막으로 데이터 분석의 최적화 후, 마우스내 B 세포 구획의 포괄적인 유량 세포 측정 분석을 위한 프로토콜을 활용할 수 있다. 이러한 포괄적인 분석은 BM B-2 세포를 개발하는 것이 B220, CD43, BP-1, CD24, IgM 및 ^IgD22의 발현에 따라 다른 분획 (분수)으로 나눌 수 있는 하디와 동료에 의해 고안된 수십 년 된 명명율을 기반으로 합니다. Hardy 등., B220⁺ CD43 BM B 세포가 BP-1 및 CD24(30F1) 발현을 기준으로 4개의 하위 집합(분수 A-C’)으로 세분화될 수 있는 반면, B220⁺ CD43^{-(dim to neg)} BM B 셀은 이그³의 상이한 발현을 기반으로 3개의 하위 집합(분수 D-F)으로 해결할 수 있음을 보여주었다. 분수 A(pre-pro-B 세포)는 BP-1-CD24(30F1)^–분수 B(초기 프로-B 셀)로 정의되며, 분수 C(초기 프로-B 셀)는 BP-1⁺ CD24(30F1)^{++, 및 분}수 C(초기 BP-1)로 정의^된다. 또한, 분수 D(사전 B 셀)는 B220⁺ CD43-IgM-B 세포로 정의되며, 분수 E(새로 생성된 B 셀, 미숙한 및 과도기의 조합)는 B220⁺ CD43-IgM⁺ B 세포 및 분수 F(성숙하고 재순환하는 B 셀)로 정의됩니다. 대조적으로, 비장에서 발견되는 순진한 B 세포의 대부분은 CD93, CD23 및 IgM의 발현에 따라 성숙한 (B220⁺ CD93^–) B 세포 및 과도기 (T1, T2, T3) 세포로 나눌 수 있다. 성숙한 B 세포는 IgM 및 CD21/CD35의 발현에 기초하여 한계 영역 및 여포 서브세트로 해결될 수 있으며, 여포 서브세트는 그들의 IgM 및 IgD 표면 발현의 수준에 따라 성숙한 여포 타입 I 및 여포형 II B 세포 서브셋으로 더 나눌 수 있다²⁴. 이러한 비장 B 세포 인구는 주로 Igθ 광 사슬을 표현합니다. 마지막으로, 태아 간에서 유래하고 성인 마우스의 복막 및 흉막 구멍에서 주로 발견되는 B-1 B 세포 인구는 문헌에 설명되어 있다. 이러한 회막 B 세포는 CD23 발현의 부족에 의해 이전에 설명된 B-2 B 세포와 구별될 수 있다. 그(것)들은 그 후에 B-1a 또는 B-1b 인구로 더 세분화됩니다, 전자는 CD5의 존재에 의해 정의되고 그것의 부재²⁵에 의해 후자에 의해 정의됩니다. B-1 세포 선조는 태아 간에서 풍부하지만 성인 BM에서는 발견되지 않습니다. B-1a 및 B-1b 세포는 다른 선조에서 유래하는 동안, 둘 다 복막과 흉막 충치^{를 시드24}. B-2 세포와는 달리, B-1 세포는 자기 재생이 유일하게 가능하고 천연 IgM 항체의 생산을 담당합니다.

B 세포 발달의 결함은 ^BCR26,27의 성분에 있는 결핍, BCR 신호 강도에 영향을 미치는 신호 분자의 동요 14,28,29, 또는 B 세포 생존을 조절하는 사이토카인의 중단을 포함하여 많은 경우에 생길 수 있습니다^30,31 . 림프구의 유동 세포 분석은 이들 마우스 및 많은 다른 사람들의 B 세포 발달 블록의 특성화에 기여했다. 림프구의 유동 세포 분석의 한 가지 장점은 살아있는 해리 된 조직에서 얻은 개별 세포에 대한 측정을 할 수있는 능력을 제공한다는 것입니다. 형광의 계속 확장 범위에서 시약의 가용성은 다중 매개 변수의 동시 분석을 허용하고 B 세포 이질성의 평가를 가능하게한다. 더욱이, 유동 세포측정 분석에 의한 B 세포의 열거는 림프구 기관 내에서 세포 국소화를 시각화하는 면역조직화학 방법, 유머 면역의 척도로서 순환 항체 수준을 검출하는 면역학적 분석, 그리고 실제 공간과 시간 ³²에서 B 세포 반응을 측정하는 2개의 광자 현미경 검사법과 같은 다른 면역학적 분석을 보완한다.