עיכוב של היווצרות אפידרמיס הפצע באמצעות ניתוח דש עור מלא במהלך התחדשות הגפיים Axolotl
Summary
מאמר זה מתאר כיצד לבצע שיטה כירורגית לעכב היווצרות אפידרמיס הפצע במהלך התחדשות הגפיים axolotl על ידי תפירת עור בעובי מלא באופן מיידי מעל מישור הקטיעה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את התפקידים התפקודיים של אפידרמיס הפצע בשלבים המוקדמים של התחדשות הגפיים.
Abstract
ניסויים קלאסיים בביולוגיה רגנרטיבית סלמנדרה במאה האחרונה קבעו זה מכבר כי אפידרמיס הפצע הוא מבנה איתות מכריע שנוצר במהירות לאחר קטיעה ונדרש להתחדשות גפיים. עם זאת, שיטות ללמוד את תפקודו המדויק ברמה המולקולרית בעשורים האחרונים הוגבלו בשל דלות של טכניקות פונקציונליות מדויקות ומידע גנומי זמין במערכות מודל סלמנדרה. באופן מרגש, שפע טכנולוגיות הרצף האחרונות יחד עם שחרורם של גנומי סלמנדרה שונים והופעתן של שיטות בדיקה גנטיות פונקציונליות, כולל CRISPR, מאפשרות לבקר מחדש בניסויים בסיסיים אלה ברזולוציה מולקולרית חסרת תקדים. כאן, אני מתאר כיצד לבצע את ניתוח דש העור המלא שפותח באופן קלאסי (FSF) באקסולוטלים למבוגרים על מנת לעכב היווצרות אפידרמיס פצע מיד לאחר הקטיעה. האפידרמיס הפצע נוצר בדרך כלל באמצעות הגירה דיסטלית של תאי אפיתל בעור קרוב למישור הקטיעה כדי לאטום את הפצע מהסביבה החיצונית. הניתוח כרוך בתפירה מיידית של עור בעובי מלא (הכולל הן שכבות אפידרמיס והן שכבות עוריות) מעל מישור הקטיעה כדי לעכב את נדידת תאי האפיתל ומגע עם רקמות המזנכימל הפגומות שבבסיסן. ניתוחים מוצלחים גורמים לעיכוב היווצרות בלסטמה והתחדשות גפיים. על ידי שילוב של שיטת ניתוח זו עם ניתוחים מולקולריים ותפקודיים עכשוויים במורד הזרם, החוקרים יכולים להתחיל לחשוף את היסודות המולקולריים של תפקוד אפידרמיס הפצע וביולוגיה במהלך התחדשות הגפיים.
Introduction
מאז Lazzaro Spallanzani דיווח על כך בשנת 17681, התחדשות גפי סלמנדרה כבר אחת התופעה הרגנרטיבית הטבעית הנחקרת ביותר כי יש מאוהב ביולוגים במשך מאות שנים. התחדשות גפיים מוצלחת תלויה בהיווצרות, בצמיחה ובדפוסים הבאים של מבנה תאי בלתי מובחן המכונה הבלסטמה. חוקרים עשו צעדים משמעותיים בהבנת ההרכב התאי של הבלסטמה, כמו גם אילו רקמות תומכות וסוגי תאים נחוצים להיווצרותה2,3,4,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . עם זאת, מנגנוני האיתות המתואמים בין רקמות וסוגי תאים שונים המובילים לייזום היווצרות blastema נשארים מובנים היטב.
דרישה מרכזית להיווצרות והתחדשות מוצלחת של בלסטמה היא אפידרמיס הפצע, אפיתל ארעי ומתמחה המכסה את מישור הקטיעה תוך 12 שעות לאחר הקטיעה10. לאחר קטיעה, תאי אפיתל מהעור השלם קרוב לפציעה נודדים במהירות מעל מישור הקטיעה כדי ליצור אפיתל פצע דק14. כאשר הבלסטמה נוצרת בשבועות הבאים, אפידרמיס הפצע המוקדם מתפתח למבנה איתות אפיתל עבה יותר הנקרא כובע אפיתל אפיתל apical (AEC)15. בעוד עור רגיל בעובי מלא מכיל הן שכבה אפיתל והן שכבה עורית המופרדת על ידי למינה בסיסית, אפידרמיס הפצע / AEC מורכב רק משכבה אפיתל וחסר למינה בסיסית16,17. היעדר הלמינה הבסיסית והדרמיס מאפשר מגע ישיר בין תאי האפיתל של הפצע לבין הרקמות הבסיסיות, מה שמאפשר איתות דו-כיווני בין שני התאים הקריטיים הן להיווצרות הבלסטמה והן לתחזוקה17,18.
מחקרים ניסיוניים קלאסיים המציאו שיטות כירורגיות חדשניות שונות לבדיקת תפקוד אפידרמיס / AEC פצעים והכרח באמצעות עיכוב היווצרותו. שיטות אלה כללו תפירה19 או השתלת עור בעובי מלא20,21 מעל מישור הקטיעה, תפירה מיידית של הגפה הכרותה לחלל הגוף22, והסרה יומית מתמשכת או הקרנה של אפידרמיס הפצע המוקדם ו– AEC23,24. בסך הכל, ניסויים אלה לא רק ביססו את החשיבות של אפידרמיס הפצע / AEC, אלא גם קבעו עוד יותר את תפקידיו בהיסטוליזה מוקדמת של רקמות, כמו גם שמירה על התפשטות תאי האבות וצמיחת הבלסטם 13 לאורך ההתחדשות.
עם זאת, מחקרים קודמים אלה הוגבלו במידה רבה כתמים היסטולוגיים, כמו גם פולסים thymidine tritiated כדי לעקוב אחר התפשטות התא. למעשה, בחינה מחודשת של ניסויים קלאסיים אלה עם טכנולוגיות ריצוף מודרניות וטכניקות פונקציונליות בסלמנדרות נעשתה רק לאחרונה והובילה לגילוי תפקידים נוספים לאפידירמיס הפצע בהתכווצות דלקת ו- ECM השפלה / תצהיר בשלבים מוקדמים של התחדשות25. עם שחרורו של גנום סלמנדרה שונים ורצפי תמלול26,27,28,29,30,31,32,32,33,34, כמו גם המספר המתפתח של שיטות פונקציונליות הזמינות במיני סלמנדרה11,35,36,37,38 החוקרים ממוקמים כעת היטב כדי להתחיל לפענח את המנגנונים המולקולריים המניעים היווצרות אפידרמיס פצעים, פונקציה ופיתוח AEC.,
למרבה הצער, כמה מהשיטות הקלאסיות הללו המשמשות לעיכוב היווצרות אפידרמיס הפצע הן מאתגרות מבחינה טכנית, ומציגות קשיים לשחזור בין משכפלים ביולוגיים באותו ניסוי. לדוגמה, שמירה על שתלי עור יכולה להיות מאתגרת שכן שתלים עלולים בסופו של דבר ליפול מהגפה המארחת והסרת אפידרמיס הפצע / AEC מדי יום קשה מבלי לפגוע ברקמות הבסיסיות. יתר על כן, תפירת האיבר הקטוע לחלל הגוף היא מאתגרת וגם דורשת פגיעה נוספת באתר ההחדרה. מצד שני, תפירת עור בעובי מלא מיד מעל מישור הקטיעה היא פשוטה יחסית, ניתנת לשחזור מבחינה טכנית, ומציגה נזק מינימלי לרקמות. שיטה כירורגית מלאה זו של דש העור (FSF) פותחה בעבר על ידי אנתוני משר בשנת 1976 בחדשות בוגרות (Notophthalmus viridiscens). הוא הוכיח כי ניתוח FSF עיכב היווצרות אפידרמיס פצע ותפקוד על ידי איסור הן הגירת תאי אפיתל מעל מישור הקטיעה והן מגע ישיר בין תאי האפיתל לבין הרקמות הבסיסיות.
כאן, הליך כירורגי זה מוצג צעד אחר צעד באמצעות איבר axolotl. יחד עם טכנולוגיות מולקולריות ורצף מודרניות, טכניקה זו עשויה להיות מועילה מאוד לחוקרים כדי להעמיק את הבנתנו של אפידרמיס הפצע / AEC היווצרות ותפקוד במהלך התחדשות הגפיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר פרוטוקול לביצוע ניתוחי דש עור מלאים בגפיים אקסולוטליות כדי לעכב היווצרות אפידרמיס פצע. בעוד ניתוח זה הוא פשוט יחסית מבחינה טכנית לשחזור בהשוואה לשיטות אחרות של עיכוב היווצרות אפידרמיס הפצע, ישנם מספר צעדים קריטיים שיכולים להשפיע על הצלחת הניתוח. ראשית, כאשר מושכים את דש העור המלא שלם מעל הרקמות הבסיסיות החשופות, יש חשיבות עליונה כי העור בעובי מלא לא להיפגע בכל דרך. נזק לדש העור עדיין יכול להוביל להיווצרות אפידרמיס פצע קטן, אשר יכול לגרום יבול קטן דמוי blastema. שנית, להבטיח תפרים לא לנשור במהלך טיפול לאחר הניתוח כמו זה יכול גם להוביל להיווצרות של אפידרמיס פצע קטן. עד לנקודה זו, חשוב למזער את המגע הפוטנציאלי בין הגפה התפורה לבין כל המשטחים, במיוחד במהלך השבוע הראשון שלאחר הניתוח. מספר דרכים למנוע את זה כרוך דיור והרדמה האקסולוטל במיכל גדול מספיק, כך axolotl יש שפע של מקום לנוע לאחר הניתוח.
לניתוח זה יש גם מספר מגבלות. אולי הבולט ביותר הוא כי ההצלחה של ניתוחים ניתן להעריך רק בשתי דרכים: באמצעות היקף ניתוח במהלך השבועיים הראשונים של הניתוח כדי לחפש היעדר אפידרמיס פצע ו / או לבדוק אם blastema צורות בתוך 3 שבועות. בעוד שיטות אלה יעילות, הם תפוקה נמוכה יחסית. הפיתוח של אקסולוטלים עיתונאיים מהונדסים עתידיים עבור סמנים ספציפיים לאפידרמיס פצע עשוי לסייע בהקרנה מהירה יותר לניתוחים מוצלחים לעומת לא מוצלחים. יתר על כן, ניתוח זה קשה יותר לביצוע על בעלי חיים צעירים יותר כמו העור שלם הוא שביר יותר. לכן מומלץ להשתמש באקסולוטלים תת-מבוגרים או מבוגרים.
בעוד ניתוח זה פותח במקור N. viridiscens19, זה כבר מותאם בקלות עבור axolotls25,39 והוא יכול להיות מיושם ככל הנראה על מינים אחרים סלמנדרה גם כן. לסיכום, יישום טכניקה זו על מחקרים עתידיים של התחדשות גפיים יעצים את החוקרים הן לפתח כלים נוספים לטיפול בביולוגיה של אפידרמיס הפצע ולזהות את המנגנונים הבסיסיים המניעים את תפקידה בייזום היווצרות blastema.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחבר מודה לדאג על עידודו המתמיד והתמיכה הבלתי מעורערת שלו, כמו גם לחברי מעבדת מלטון על המשוב וההערות המועילות שלהם על כתב היד. המחבר רוצה גם להודות למשרד משאבי בעלי החיים של הרווארד (OAR) על הטיפול המסור בבעלי חיים.
Materials
| Curved spring scissors | Fine Scientific Tools | 15009-08 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | Need two pairs |
| Nylon monofilament sutures (9-0) | Roboz | SUT-1000-21 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Stereo microscope | Leica | MZ6 | |
| Sulfamerazine sodium salt | Sigma-Aldrich | 127-58-2 | |
| Surgical scissors | Fine Scientific Tools | 14002-14 |
References
- Spallanzani, L. . Prodromo Di Un’opera Da Imprimersi Sopra Le Riproduzioni Animali. , (1768).
- Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. , (2018).
- Leigh, N. D., et al. Transcriptomic landscape of the blastema niche in regenerating adult axolotl limbs at single-cell resolution. Nature Communications. 9 (1), 5153 (2018).
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- McCusker, C., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. The axolotl limb blastema: cellular and molecular mechanisms driving blastema formation and limb regeneration in tetrapods. Regeneration (Oxford). 2 (2), 54-71 (2015).
- Endo, T., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. A stepwise model system for limb regeneration. Biologie du développement. 270 (1), 135-145 (2004).
- Tsai, S. L. The molecular interplay between progenitors and immune cells in tissue regeneration and homeostasis. Journal of Immunology and Regenerative Medicine. 7, 100024 (2020).
- Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. Macrophages are required for adult salamander limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).
- Tanaka, E. M. The molecular and cellular choreography of appendage regeneration. Cell. 165 (7), 1598-1608 (2016).
- Campbell, L. J., Crews, C. M. Wound epidermis formation and function in urodele amphibian limb regeneration. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (1), 73-79 (2008).
- Fei, J. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).
- Sandoval-Guzman, T., et al. Fundamental differences in dedifferentiation and stem cell recruitment during skeletal muscle regeneration in two salamander species. Cell Stem Cell. 14 (2), 174-187 (2014).
- Tassava, R. A., Mescher, A. L. The roles of injury, nerves, and the wound epidermis during the initiation of amphibian limb regeneration. Differentiation. 4 (1), 23-24 (1975).
- Hay, E. D., Fischman, D. A. Origin of the blastema in regenerating limbs of the newt Triturus viridescens. An autoradiographic study using tritiated thymidine to follow cell proliferation and migration. Biologie du développement. 3, 26-59 (1961).
- Christensen, R. N., Tassava, R. A. Apical epithelial cap morphology and fibronectin gene expression in regenerating axolotl limbs. Developmental Dynamics. 217 (2), 216-224 (2000).
- Repesh, L. A., Oberpriller, J. C. Scanning electron microscopy of epidermal cell migration in wound healing during limb regeneration in the adult newt, Notophthalmus viridescens. American Journal of Anatomy. 151 (4), 539-555 (1978).
- Neufeld, D. A., Day, F. A., Settles, H. E. Stabilizing role of the basement membrane and dermal fibers during newt limb regeneration. Anatomical Record. 245 (1), 122-127 (1996).
- Singer, M., Saltpeter, M. M., Zarrow, M. X. . Growth in Living Systems. , (1961).
- Mescher, A. L. Effects on adult newt limb regeneration of partial and complete skin flaps over the amputation surface. Journal of Experimental Zoology. 195 (1), 117-128 (1976).
- Tassava, R. A., Garling, D. J. Regenerative responses in larval axolotl limbs with skin grafts over the amputation surface. Journal of Experimental Zoology. 208 (1), 97-110 (1979).
- Tornier, G. Der Kampf der Gewebe im Regeneratbei Begunsiigung der Hautregeneralion. Arch. Entwmech. 22, 348-352 (1906).
- Goss, R. J. Regenerative inhibition following limb amputation and immediate insertion into the body cavity. Anatomical Record. 126 (1), 15-27 (1956).
- Thornton, C. S. The effect of apical cap removal on limb regeneration in Amblystoma larvae. Journal of Experimental Zoology. 134 (2), 357-381 (1957).
- Thornton, C. S. The inhibition of limb regeneration in urodele larvae by localized irradiation with ultraviolet light. Journal of Experimental Zoology. 137 (1), 153-179 (1958).
- Tsai, S. L., Baselga-Garriga, C., Melton, D. A. Midkine is a dual regulator of wound epidermis development and inflammation during the initiation of limb regeneration. Elife. 9, (2020).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Elewa, A., et al. Reading and editing the Pleurodeles waltl genome reveals novel features of tetrapod regeneration. Nature Communications. 8 (1), 2286 (2017).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Looso, M., et al. A de novo assembly of the newt transcriptome combined with proteomic validation identifies new protein families expressed during tissue regeneration. Genome Biology. 14 (2), 16 (2013).
- Abdullayev, I., Kirkham, M., Bjorklund, A. K., Simon, A., Sandberg, R. A reference transcriptome and inferred proteome for the salamander Notophthalmus viridescens. Experimental Cell Research. 319 (8), 1187-1197 (2013).
- Burns, J. A., Zhang, H., Hill, E., Kim, E., Kerney, R. Transcriptome analysis illuminates the nature of the intracellular interaction in a vertebrate-algal symbiosis. Elife. 6, (2017).
- Nakamura, K., et al. A transcriptome for the study of early processes of retinal regeneration in the adult newt, Cynops pyrrhogaster. PLoS One. 9 (10), 109831 (2014).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 29 (2), 317-324 (2019).
- Arenas Gomez, C. M., Woodcock, R. M., Smith, J. J., Voss, S. R., Delgado, J. P. Using transcriptomics to enable a plethodontid salamander (Bolitoglossa ramosi) for limb regeneration research. BMC Genomics. 19 (704), (2018).
- Fei, J. F., et al. Application and optimization of CRISPR-Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
- Joven, A., Elewa, A., Simon, A. Model systems for regeneration: salamanders. Development. 146 (14), (2019).
- Johnson, K., Bateman, J., DiTommaso, T., Wong, A. Y., Whited, J. L. Systemic cell cycle activation is induced following complex tissue injury in axolotl. Biologie du développement. 433 (2), 461-472 (2018).
