تثبيط تكوين بشرة الجرح عن طريق جراحة سديلة الجلد الكاملة أثناء تجديد الأطراف Axolotl
Summary
توضح هذه المقالة كيفية إجراء طريقة جراحية لمنع تكوين بشرة الجرح أثناء تجديد الأطراف axolotl عن طريق خياطة الجلد كامل السماكة على الفور فوق مستوى البتر. تسمح هذه الطريقة للباحثين بالتحقيق في الأدوار الوظيفية لبشرة الجرح خلال المراحل المبكرة من تجديد الأطراف.
Abstract
أثبتت التجارب الكلاسيكية في بيولوجيا السمندل التجديدية على مدى القرن الماضي منذ فترة طويلة أن بشرة الجرح هي بنية إشارات حاسمة تتشكل بسرعة بعد البتر وهي مطلوبة لتجديد الأطراف. ومع ذلك ، فإن طرق دراسة وظيفتها الدقيقة على المستوى الجزيئي على مدى العقود الماضية كانت محدودة بسبب ندرة التقنيات الوظيفية الدقيقة والمعلومات الجينومية المتاحة في أنظمة نماذج السمندل. ومن المثير للاهتمام أن الوفرة الأخيرة من تقنيات التسلسل إلى جانب إطلاق جينومات السمندل المختلفة وظهور طرق الاختبار الجيني الوظيفية، بما في ذلك كريسبر، تجعل من الممكن إعادة النظر في هذه التجارب التأسيسية بدقة جزيئية غير مسبوقة. هنا ، أصف كيفية إجراء جراحة رفرف الجلد الكامل (FSF) المطورة بشكل كلاسيكي في axolotls البالغين من أجل منع تكوين بشرة الجرح مباشرة بعد البتر. تتشكل بشرة الجرح عادة عن طريق الهجرة البعيدة للخلايا الظهارية في الجلد القريب من مستوى البتر لعزل الجرح عن البيئة الخارجية. تستلزم الجراحة خياطة الجلد كامل السماكة على الفور (والذي يشمل طبقات البشرة والجلد) فوق مستوى البتر لإعاقة هجرة الخلايا الظهارية والاتصال بالأنسجة الوسيطة التالفة الكامنة. تؤدي العمليات الجراحية الناجحة إلى تثبيط تكوين الأرومة وتجديد الأطراف. من خلال الجمع بين طريقة الجراحة هذه والتحليلات الجزيئية والوظيفية المعاصرة ، يمكن للباحثين البدء في الكشف عن الأسس الجزيئية لوظيفة بشرة الجرح والبيولوجيا أثناء تجديد الأطراف.
Introduction
منذ أن أبلغ لازارو سبالانزاني عن ذلك في عام 17681 ، كان تجديد أطراف السمندل أحد أكثر الظواهر التجديدية الطبيعية المدروسة جيدا والتي سحرت علماء الأحياء لعدة قرون. يعتمد تجديد الأطراف الناجح على تكوين بنية خلوية غير متمايزة تعرف باسم الأرومة ونموها ونمطها اللاحق. حقق الباحثون خطوات كبيرة في فهم التركيب الخلوي للبلاتيما وكذلك الأنسجة الداعمة وأنواع الخلايا الضرورية لتكوينها2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12،13 . ومع ذلك ، فإن آليات الإشارات المنسقة بين الأنسجة وأنواع الخلايا المختلفة التي تؤدي إلى بدء تكوين الأرومة لا تزال غير مفهومة بشكل جيد.
أحد المتطلبات الرئيسية لنجاح تكوين الأرومية وتجديدها هو بشرة الجرح، وهي ظهارة عابرة ومتخصصة تغطي مستوى البتر في غضون 12 ساعة بعد البتر10. بعد البتر، تهاجر الخلايا الظهارية من الجلد السليم القريب إلى الإصابة بسرعة فوق مستوى البتر لتشكل ظهارة جرح رقيقة14. مع تشكل الأرومة في الأسابيع التالية، تتطور بشرة الجرح المبكر إلى بنية إشارات ظهارية أكثر سمكا تسمى الغطاء الظهاري القمي (AEC)15. في حين أن الجلد الطبيعي كامل السماكة يحتوي على طبقة ظهارية وجلدية مفصولة بصفيحة قاعدية ، فإن بشرة الجرح / AEC تتكون فقط من طبقة ظهارية وتفتقر إلى صفيحة قاعدية16,17. يسمح غياب الصفيحة القاعدية والأدمة بالاتصال المباشر بين الخلايا الظهارية للجرح والأنسجة الكامنة ، مما يسهل الإشارات ثنائية الاتجاه بين المقصورتين وهو أمر بالغ الأهمية لكل من تكوين الأرومة وصيانتها17,18.
ابتكرت الدراسات التجريبية الكلاسيكية العديد من الطرق الجراحية المبتكرة لفحص وظيفة البشرة / AEC الجرح وضرورته عن طريق تثبيط تكوينه. وشملت هذه الطرق خياطة 19 أو تطعيم الجلد بسمك كامل20,21 فوق مستوى البتر، وخياطة الطرف المبتور على الفور في تجويف الجسم22، والإزالة اليومية المستمرة أو التشعيع لبشرة الجرح المبكر وAEC23,24. وإجمالا، لم تثبت هذه التجارب أهمية بشرة الجرح / AEC فحسب، بل حددت أيضا أدوارها في انحلال الأنسجة المبكر بالإضافة إلى الحفاظ على تكاثر الخلايا السلفية ونمو الأرومات13 طوال فترة التجديد.
ومع ذلك ، اقتصرت هذه الدراسات السابقة إلى حد كبير على التلطيخ النسيجي وكذلك نبضات الثيميدين المثلثة لتتبع انتشار الخلايا. في الواقع ، لم تتم إعادة النظر في هذه التجارب الكلاسيكية باستخدام تقنيات التسلسل الحديثة والتقنيات الوظيفية في السمندل إلا مؤخرا وأدت إلى اكتشاف أدوار إضافية لبشرة الجرح في تعديل الالتهاب وتدهور / ترسب ECM خلال المراحل المبكرة من التجديد25. مع إطلاق مختلف تسلسلات جينوم السمندل والنسخ 26،27،28،29،30،31،32،33،34 ، بالإضافة إلى العدد المتزايد من الطرق الوظيفية المتاحة في أنواع السمندل11،35،36،37،38 ، أصبح الباحثون الآن في وضع جيد للبدء في كشف الآليات الجزيئية التي تقود تكوين بشرة الجرح ووظيفتها وتطوير AEC.
لسوء الحظ ، فإن العديد من هذه الطرق الكلاسيكية المستخدمة لمنع تكوين بشرة الجرح تشكل تحديا تقنيا ، مما يمثل صعوبات في التكاثر بين النسخ المتماثلة البيولوجية في نفس التجربة. على سبيل المثال ، يمكن أن يكون الحفاظ على ترقيع الجلد أمرا صعبا لأن الطعوم قد تسقط في النهاية من الطرف المضيف وإزالة بشرة الجرح / AEC يوميا أمر صعب دون إتلاف الأنسجة الكامنة. علاوة على ذلك ، فإن خياطة الطرف المبتور في تجويف الجسم أمر صعب ويتطلب أيضا إصابة إضافية في موقع الإدخال. من ناحية أخرى ، فإن خياطة الجلد بسمك كامل مباشرة فوق مستوى البتر بسيط نسبيا ، ويمكن استنساخه تقنيا ، ويدخل الحد الأدنى من تلف الأنسجة. تم تطوير هذه الطريقة الجراحية لرفرف الجلد الكامل (FSF) من قبل أنتوني ميشر في عام 1976 في نيوتس البالغين (Notophthalmus viridiscens). وأظهر أن جراحة FSF تمنع تكوين بشرة الجرح ووظيفتها من خلال حظر كل من هجرة الخلايا الظهارية فوق مستوى البتر والاتصال المباشر بين الخلايا الظهارية والأنسجة الكامنة.
هنا ، يتم عرض هذا الإجراء الجراحي خطوة بخطوة باستخدام طرف axolotl. إلى جانب التقنيات الجزيئية والتسلسل الحديثة ، قد تثبت هذه التقنية أنها مفيدة جدا للباحثين لتعميق فهمنا لتكوين بشرة الجرح / AEC ووظيفتها أثناء تجديد الأطراف.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه المقالة بروتوكولا لإجراء جراحات سديلة الجلد الكاملة في أطراف axolotl لمنع تكوين بشرة الجرح. في حين أن هذه الجراحة بسيطة نسبيا وقابلة للتكرار تقنيا مقارنة بالطرق الأخرى لتثبيط تكوين بشرة الجرح ، إلا أن هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي يمكن أن تؤثر على نجاح الجراحة. أولا ، عند سحب رفرف الجلد الكامل السليم فوق الأنسجة الكامنة المكشوفة ، من الأهمية بمكان ألا يتلف الجلد ذو السماكة الكاملة بأي شكل من الأشكال. لا يزال من الممكن أن يؤدي تلف رفرف الجلد إلى تكوين بشرة جرح صغيرة ، مما قد يؤدي إلى نمو صغير يشبه الأرومة. ثانيا ، تأكد من عدم سقوط الغرز أثناء الرعاية بعد العملية الجراحية لأن هذا يمكن أن يؤدي أيضا إلى تكوين بشرة جرح صغيرة. حتى هذه النقطة ، من المهم تقليل الاتصال المحتمل بين الطرف المخيط وأي أسطح ، خاصة خلال الأسبوع الأول بعد الجراحة. هناك عدة طرق لمنع ذلك تستلزم السكن وتخدير axolotl في حاوية كبيرة بما فيه الكفاية بحيث يكون لدى axolotl مساحة كبيرة للتنقل بعد الجراحة.
هذه الجراحة لديها أيضا العديد من القيود. ولعل أبرزها هو أنه لا يمكن تقييم نجاح العمليات الجراحية إلا بطريقتين: استخدام نطاق التشريح خلال الأسبوعين الأولين من الجراحة للبحث عن عدم وجود بشرة جرح و / أو التحقق مما إذا كانت الأرومة تتشكل في غضون 3 أسابيع. في حين أن هذه الأساليب فعالة ، إلا أنها منخفضة الإنتاجية نسبيا. قد يساعد تطوير محاور المراسل المعدلة وراثيا في المستقبل للعلامات الخاصة ببشرة الجروح في إجراء فحص أسرع للجراحات الناجحة مقابل العمليات الجراحية غير الناجحة. علاوة على ذلك ، يصعب إجراء هذه الجراحة على الحيوانات الأصغر سنا لأن الجلد السليم أكثر هشاشة. وبالتالي يوصى باستخدام axolotls دون البالغين أو البالغين.
في حين تم تطوير هذه الجراحة في الأصل في N. viridiscens19 ، فقد تم تكييفها بسهولة مع axolotls25,39 ويمكن تطبيقها على أنواع السمندل الأخرى أيضا. باختصار ، فإن تطبيق هذه التقنية على الدراسات التجديدية المستقبلية للأطراف سيمكن الباحثين من تطوير المزيد من الأدوات لمعالجة بيولوجيا بشرة الجرح وتحديد الآليات الأساسية التي تقود وظيفتها في بدء تكوين الأرومة.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلف دوغ على تشجيعه المستمر ودعمه الثابت ، وكذلك أعضاء مختبر ميلتون على ملاحظاتهم وتعليقاتهم المفيدة على المخطوطة. يود المؤلف أيضا أن يشكر مكتب هارفارد للموارد الحيوانية (OAR) على رعايته المتفانية للحيوانات.
Materials
| Curved spring scissors | Fine Scientific Tools | 15009-08 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | Need two pairs |
| Nylon monofilament sutures (9-0) | Roboz | SUT-1000-21 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Stereo microscope | Leica | MZ6 | |
| Sulfamerazine sodium salt | Sigma-Aldrich | 127-58-2 | |
| Surgical scissors | Fine Scientific Tools | 14002-14 |
References
- Spallanzani, L. . Prodromo Di Un’opera Da Imprimersi Sopra Le Riproduzioni Animali. , (1768).
- Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. , (2018).
- Leigh, N. D., et al. Transcriptomic landscape of the blastema niche in regenerating adult axolotl limbs at single-cell resolution. Nature Communications. 9 (1), 5153 (2018).
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- McCusker, C., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. The axolotl limb blastema: cellular and molecular mechanisms driving blastema formation and limb regeneration in tetrapods. Regeneration (Oxford). 2 (2), 54-71 (2015).
- Endo, T., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. A stepwise model system for limb regeneration. Biologie du développement. 270 (1), 135-145 (2004).
- Tsai, S. L. The molecular interplay between progenitors and immune cells in tissue regeneration and homeostasis. Journal of Immunology and Regenerative Medicine. 7, 100024 (2020).
- Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. Macrophages are required for adult salamander limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).
- Tanaka, E. M. The molecular and cellular choreography of appendage regeneration. Cell. 165 (7), 1598-1608 (2016).
- Campbell, L. J., Crews, C. M. Wound epidermis formation and function in urodele amphibian limb regeneration. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (1), 73-79 (2008).
- Fei, J. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).
- Sandoval-Guzman, T., et al. Fundamental differences in dedifferentiation and stem cell recruitment during skeletal muscle regeneration in two salamander species. Cell Stem Cell. 14 (2), 174-187 (2014).
- Tassava, R. A., Mescher, A. L. The roles of injury, nerves, and the wound epidermis during the initiation of amphibian limb regeneration. Differentiation. 4 (1), 23-24 (1975).
- Hay, E. D., Fischman, D. A. Origin of the blastema in regenerating limbs of the newt Triturus viridescens. An autoradiographic study using tritiated thymidine to follow cell proliferation and migration. Biologie du développement. 3, 26-59 (1961).
- Christensen, R. N., Tassava, R. A. Apical epithelial cap morphology and fibronectin gene expression in regenerating axolotl limbs. Developmental Dynamics. 217 (2), 216-224 (2000).
- Repesh, L. A., Oberpriller, J. C. Scanning electron microscopy of epidermal cell migration in wound healing during limb regeneration in the adult newt, Notophthalmus viridescens. American Journal of Anatomy. 151 (4), 539-555 (1978).
- Neufeld, D. A., Day, F. A., Settles, H. E. Stabilizing role of the basement membrane and dermal fibers during newt limb regeneration. Anatomical Record. 245 (1), 122-127 (1996).
- Singer, M., Saltpeter, M. M., Zarrow, M. X. . Growth in Living Systems. , (1961).
- Mescher, A. L. Effects on adult newt limb regeneration of partial and complete skin flaps over the amputation surface. Journal of Experimental Zoology. 195 (1), 117-128 (1976).
- Tassava, R. A., Garling, D. J. Regenerative responses in larval axolotl limbs with skin grafts over the amputation surface. Journal of Experimental Zoology. 208 (1), 97-110 (1979).
- Tornier, G. Der Kampf der Gewebe im Regeneratbei Begunsiigung der Hautregeneralion. Arch. Entwmech. 22, 348-352 (1906).
- Goss, R. J. Regenerative inhibition following limb amputation and immediate insertion into the body cavity. Anatomical Record. 126 (1), 15-27 (1956).
- Thornton, C. S. The effect of apical cap removal on limb regeneration in Amblystoma larvae. Journal of Experimental Zoology. 134 (2), 357-381 (1957).
- Thornton, C. S. The inhibition of limb regeneration in urodele larvae by localized irradiation with ultraviolet light. Journal of Experimental Zoology. 137 (1), 153-179 (1958).
- Tsai, S. L., Baselga-Garriga, C., Melton, D. A. Midkine is a dual regulator of wound epidermis development and inflammation during the initiation of limb regeneration. Elife. 9, (2020).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Elewa, A., et al. Reading and editing the Pleurodeles waltl genome reveals novel features of tetrapod regeneration. Nature Communications. 8 (1), 2286 (2017).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Looso, M., et al. A de novo assembly of the newt transcriptome combined with proteomic validation identifies new protein families expressed during tissue regeneration. Genome Biology. 14 (2), 16 (2013).
- Abdullayev, I., Kirkham, M., Bjorklund, A. K., Simon, A., Sandberg, R. A reference transcriptome and inferred proteome for the salamander Notophthalmus viridescens. Experimental Cell Research. 319 (8), 1187-1197 (2013).
- Burns, J. A., Zhang, H., Hill, E., Kim, E., Kerney, R. Transcriptome analysis illuminates the nature of the intracellular interaction in a vertebrate-algal symbiosis. Elife. 6, (2017).
- Nakamura, K., et al. A transcriptome for the study of early processes of retinal regeneration in the adult newt, Cynops pyrrhogaster. PLoS One. 9 (10), 109831 (2014).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 29 (2), 317-324 (2019).
- Arenas Gomez, C. M., Woodcock, R. M., Smith, J. J., Voss, S. R., Delgado, J. P. Using transcriptomics to enable a plethodontid salamander (Bolitoglossa ramosi) for limb regeneration research. BMC Genomics. 19 (704), (2018).
- Fei, J. F., et al. Application and optimization of CRISPR-Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
- Joven, A., Elewa, A., Simon, A. Model systems for regeneration: salamanders. Development. 146 (14), (2019).
- Johnson, K., Bateman, J., DiTommaso, T., Wong, A. Y., Whited, J. L. Systemic cell cycle activation is induced following complex tissue injury in axolotl. Biologie du développement. 433 (2), 461-472 (2018).
