초기 산후 발달에 있는 에머리 드레이푸스 근 이영양증의 Murine 모형에서 단 근섬유 격리 및 문화
Summary
여기서, 우리는 동종구균 돌연변이 라민 Δ8-11 마우스 모델, 에머리-드레이퍼스 근 위축증(EDMD)에 대한 매우 가혹한 모델으로부터 초기 산후 발달 단계에서 단일 근육 섬유를 효율적으로 획득하는 방법을 제안한다.
Abstract
자가 지배적 인 에머리 드레이퍼스 근이영양증 (EDMD)은 핵 봉투와 핵 봉투의 성분을 유지하는 A 형 핵 라민, 중간 필라멘트 단백질을 인코딩하는 LMNA 유전자의 돌연변이에 의해 발생합니다. 우리는 최근에 EDMD에 있는 근육 낭비가 근육에 영향을 미치는 본질적인 후생유전학 역기능에 기인할 수 있다는 것을 보고했습니다 (위성) 줄기 세포 재생 용량. 단일 근섬유의 격리 및 문화는 섬유와 사르콜렘을 둘러싼 기저 라미나 사이에 남아 있기 때문에 틈새 시장 내에서 위성 세포 행동을 모니터링하는 가장 생리적인 전 생체 접근법 중 하나입니다. 따라서, 다양한 뮤린 모델으로부터 위성 세포를 연구하는 귀중한 실험 패러다임을 나타낸다. 여기서, 우리는 산후 뒷다리 근육(티비아리스 전방, 엑스텐소르 디포룸 롱투스, 위장혈증 및 솔레우스)에서그대로 실행 가능한 단일 근섬유를 분리하는 재적응 된 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에 따라, 우리는 라빈 Δ8-11 -/- 생쥐에서 위성 세포를 연구할 수 있었다, 심한 EDMD 뮤린 모델, 출생 후 불과 19 일.
우리는 격리 절차뿐만 아니라 근섬유와 그 관련 위성 세포 유래 자손의 양수를 얻기위한 배양 조건을 자세히 설명합니다. 성장인자가 풍부한 배지에서 배양될 때, 야생형 마우스에서 유래한 위성 세포는 활성화, 증식, 그리고 결국 자기 재생을 분화하거나 겪는다. homozygous Lamin Δ8-11 -/- 돌연변이 마우스에서 이러한 기능은 심각하게 손상된다.
이 기술은, 엄격하게 따르는 경우에, 초기 산후 발달 단계 및 연약한 근육에서조차 근섬유 관련 위성 세포에 연결된 모든 프로세스를 공부할 수 있습니다.
Introduction
골격 근은 운동 또는 외상 1 후에 재생하는 가장 확장된 능력 중 하나를 가진분화조직이다. 이러한 특성은 주로 줄기 세포의 존재 에 기인, 때문에 기저 라미나와 근섬유의 혈장 사이의 그들의 주변 위치의 위성 세포라고2. 산후 발달 도중, 위성 세포는 증식하고 점진적으로 분화하여, 따라서 골격 근육 성장에 기여합니다. 성인기에 일단, 위성 세포는 가역적인 정지 상태에 들어가고, 생리적 또는 병리학적 외상에, 손상된 근육을 복구하기 위하여 활성화하고, 증식하고 분화하고3. 이러한 상이한 재생 단계를 통해 제대로 통과하고 자기 갱신을 거치는 위성 세포의 용량에 결함이 단단히 근육 낭비에 연결되어, 생리노화동안4,5,,6 또는 근육 이영양증 과 같은 근육 퇴행성 질환에서7,,8,,9,,10.
두 가지 주요 배양 접근법은 위성 세포 전 생체 내 연구를 위해 존재합니다: 단핵 세포에서 1차 근생 배양, 기계적 및 화학적으로 전체근육에서 분리11,,12; 또는 격리된 근섬유의배양(13,,14,,15,16,,17,,18,,,19,,20). 첫 번째 경우, 위성 세포 격리 과정은 마우스에서 추출된 전체 근육의 트리튜레이션, 화학 소화, 여과 및 형광 활성화 세포 정렬(FACS)21을포함한다. 이 절차는 다양한 모델에서 위성 세포를 격리하는 데 효과적이지만 위성 세포를 스트레스에 노출시키고 생리적 틈새 시장을 방해하는 여러 변수를 수반합니다22,,23. 대조적으로, 근섬유 분리는 매트릭스 분해 효소와 줄기 세포에 감소 된 외상을 일으키는 기계적 파쇄와 근육 조직의 부드러운 소화를 포함한다20. 이 두 번째 접근 은 생존 가능한 위성 세포의 훨씬 더 효율적인 검색을 허용, 그 물리적으로 기저 라미나와 사르콜렘 사이 그들의 근섬유에 부착 남아, 따라서 그들의 생리 틈새 시장 내에서 분석을 허용19,,20.
많은 다른 프로토콜은 골격 근육에서 단일 근섬유를 적절하고 효율적으로 분리하기 위해 지난 몇 년 동안 제안되었습니다. 이미 1986 년 Bischoff는 1995 년, 로젠 블라트 등 에서 Flexorum Brevis13에서 섬유를 분리하는 프로토콜을제안했다. 그 이후로, 다른 많은 저자는 엑스텐소 디포럼 롱우스 (EDL) 및 티비아리스 전방 (TA),15,16,,17,18,,19,20과같은 다른 근육에 대한 조정 절차를 제안, 더 연약하더라도, 근육14.,, 그 후 분리된 근섬유는 위성 세포 유래 근막세포의 팽창을 허용하기 위해, 또는 부동 조건에서 최대 96시간, 단일 위성 세포로부터 유래된 자손을 따라갈 수있다(도1). 배양 배지 내의 혈청의 가변 농도는 위성 세포 활성화, 증식 및/또는 분화를 유발하는 데 사용되며, 이러한 상이한 단계1을통해 적절하게 통과할 수 있는 능력을 연구한다.
우리는 최근에 EDMD의 마우스 모델에서 위성 줄기 세포 풀의 고갈 뒤에 후성 유전학 적 메커니즘을 설명, 라빈 Δ8-11 -/- 마우스7. 이 마우스는 일반적으로 나이의 4-8 주 사이 정지 하기 때문에24,심한 근육 손실 때문에, 산후 근육 개발에 우리의 분석을 집중 하 여 질병의 초기 발병의 근본적인 분자 결함을 캡처 하는 시도 했다. 부동 단일 심근섬유는 야생형 및 라민 Δ8-11-/- 돌연변이7 19일 생쥐로부터 분리및 배양되었다. 이 단계에서, 근육 결함은 이미 분명, 하지만 마우스는 여전히 실행 가능한. 그러나, 단일 근섬유 추출을 위한 모든 위에서 언급한 프로토콜이 성인 마우스의 골격 근육에 최적화되었기 때문에, 우리는 우리의 목적에 적응할 필요가 있었습니다: 나이와 크기의 기간에 아주 작은 마우스, 아주 깨지기 쉬운 근섬유. 따라서, 우리는 여기에 Rudnicki 실험실에 의해 제안된 프로토콜의 우리의 재적응을설명합니다 (19 산후 발달 도중 마우스에서 단 하나 실행 가능한 근섬유의 상당수를 얻기 위하여 및 라민 Δ8-11-/- 마우스24에서유래한 것과 같은 가혹한 dystrophic 근육에서. 이 접근법의 최종 목표는 산후 발달의 초기 단계가 관심있을 때 또는 마우스 모델이 기계적 스트레스에 더 취약하게 만드는 특정 질병을 운반하는 마우스 모델의 경우 다른 마우스 모델에서 근섬유 와 관련된 근육 줄기 세포의 연구를위한 표준화 된 절차를 제공하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
그대로 단일 근섬유의 분리는 주요 목적이 그들의 틈새 시장 내에서 근육 줄기 세포의 세포 자율 재생 용량을 특성화하는 것입니다 때 근신생 의 분야에서 필수적인 방법입니다, 건강하고 병리학적인 조건에서. 그러나 생화학적 또는 유전체 연구가 관심이있을 때 FACS 격리 위성 세포가 최선의 선택이 될 수 있습니다.
단일 심섬유 격리는 전 생체 외를 따를 수 있지만, 가장 생리적인 방법으로, 단일 위성 세포가 근육 재생 중에 겪는 모든 단계의 역학, 즉 활성화, 세포 분열 (비대칭 및 대칭), 분화 및 자기 갱신에 의한 퀴시즈로 돌아갑니다. 근섬유가 부동 조건에서 성장하면 단일 위성 세포가 활성화되어 확장하여 동일한 위성 세포에서 파생됩니다. 증식, 분화, 활성화 또는 줄기 마커를 위한 면역 형광 분석은 세포 단계 사이의 비율을 정량화하는 것이 최적입니다.
실행 가능하고 그대로 근섬유를 얻기 위한 프로토콜의 핵심 단계는 힘줄에서 힘줄 간 격리에 의하여 근육 손상을 피하기 위해 빠르지만 부드러운 근육 해부로 간주될 수 있습니다. 우리의 조언은 날카로운 가위와 작은 날카로운 핀셋만 사용하고 전체 근육 해부 절차를 10 분으로 제한하는 것입니다. 아주 작은 근육(즉, EDL 및 TA)을 분리하기가 어려울 때, 섬유에 따른 세로 계획을 따라 절단된 미세 가위를 사용하여 함께 절단하고 나중에 분할할 수 있습니다. 이 전략은 결국 덜 그대로 근섬유를 줄 것이다, 하지만 생존은 손상되지 않습니다. 소화를 용이하게 하기 위해 위트로크리혈증과 같은 큰 근육에서도 동일한 결과를 수행해야 합니다. 경험적으로 검증되어야 하는 소화 시간의 최적화, 격리된 섬유의 최소한의 조작은 후속 분석의 긍정적인 결과에 대한 두 가지 중요한 측면이기도 합니다.
여기에 보고된 프로토콜의 장점은 근육이 매우 연약하더라도 매우 작은 쥐 (나이와 차원에서)에 적용 될 수 있다는 것입니다. 위에서 언급하지 않더라도, 지하 막 코팅 된 접시18,,19를사용하여 장기간 동안 가능한 근섬유를 배양하기 위해 해부의 이 프로토콜을 따를 수 있다. 이 상황은 접착 자극과 근접 자극이 없는 부동 상태와 완전히 다르다는 것을 고려하는 것이 중요합니다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 안드레아 비안치, 라미노 파리스의 이탈리아 네트워크와 지원과 모든 건설적인 의견에 대한 실험실의 구성원을 감사드립니다. 우리는 공초점 현미경에서 귀중한 도움에 대한 키아라 코르디글리에감사드립니다. 저자는 베아트리체 비페랄리 박사에게 그림 촬영을 도와준 것에 대해 감사를 표합니다. 여기에 제시 된 작품은 내 첫 번째 AIRC 그랜트 n에 의해 지원되었다. 18535, AFM-Telethon n. 21030, 이탈리아 보건 장관 n. GR-2013-02355413 및 Cariplo 2017-0649 to C.L. C.M.은 나의 첫 번째 AIRC 보조금 n.18993 및 AFM-Telethon n249.
Materials
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma | D9542 | |
| Chicken embryo extract | Seralab | CE650-DL | |
| Collagenase type I | SIGMA | C0130-500MG | |
| Donkey anti-Rabbit 488 antibody | Thermofisher | R37118 | to be used 1:200 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| MyoG antibody | Millipore | 219998 | to be used 1:100 |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Pax7 antibody | Developmental studies Hybridoma bank |
to be used 1:20 | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Phosphate saline buffer | Euroclone | ECB4004L | |
| Prolong gold antifade mountant | Thermofisher | P36930 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Tween-20 | SIGMA | P1379 | |
| Lab equipment | Manufacturer | ||
| Bunsen burner | |||
| Confocal microscope | Leica | ||
| Diamond pen | bio-optica | ||
| Dissection pins | |||
| FACS polypropylene tubes | Falcon | ||
| Falcon tubes (50 and 15 mL) | Falcon | ||
| Glass coverslips | Thermofisher | ||
| Glass Pasteur pipettes (22cm) | VWR | ||
| Glass slides | Thermofisher | ||
| Micro dissecting scissors | |||
| Micropipette (1 mL and 200 µL) | Gilson | ||
| Micropipette tips | Corning | ||
| Petri dishes (100 and 35 mm diameter) | Thermofisher | ||
| Plastic pipettes (5 and 10 mL) | VWR | ||
| Rubber pipette bulbs | VWR | ||
| Sharp tweezers | |||
| Stereo dissection microscope with transmission illumination | Leica | ||
| Tissue culture hood or lamina flow cabinet | |||
| Tissue culture incubator (humidified, 37°C, 5% CO2) | |||
| Water bath at 37°C | VWR |
References
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