Single Myofiber isolatie en cultuur van een Murine Model van Emery-Dreifuss Spierdystrofie in de vroege post-natale ontwikkeling

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd onder de ethische goedkeuring van het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid en de Institutional Animal Care and Use Committee (vergunning n. 83/2019-PR). De dieren werden gehouden in een erkende faciliteit in het San Raffaele Ziekenhuis in Milaan, Italië (vergunning n. N. 127/2012-A). 1. Spierdissectie en myofibercultuur Voorbereiding van de apparatuur. Bereid voordat u begint alle benodigde oplossingen voor zoals beschreven in tabel 1. Deze oplossingen moeten vers worden bereid. Reinig alle oppervlakken en gereedschappen die tijdens de procedure worden gebruikt met 70% ethanol. Voordat u begint met muizenofferen, voert u coatings uit van 100 mm en 35 mm petrischaaltjes met Horse Serum (HS). Coat alle gerechten om te voorkomen dat myofibers hechten aan het plastic. Overweeg het gebruik van een 100 mm schotel en vier 35 mm gerechten per muis. Na het verwijderen van het overschot aan GS, bewaar gecoate gerechten in een couveuse op 37 °C gedurende 30 min. Vul het vervolgens met wasoplossing of kweekmedium (twee gerechten van 35 mm per muis).OPMERKING: Als alternatief kan een oplossing van 10% GS in dulbecco’s gemodificeerde Eagle’s medium (DMEM) worden gebruikt om gerechten te coaten. Gebruik altijd gecoate gerechten. Het is mogelijk om cultuurgerechten van verschillende grootte te gebruiken, maar kleine afmeting Petri gerechten worden aanbevolen. Voor vezels isolatie, bereiden steriele Pasteur pipetten zoals weergegeven in figuur 2. Voor elke muis bereiden een groot gat boring pipet voor spierbehandeling en mechanische disaggregatie (Figuur 2A) en een klein gaatpipet voor vezels selectie (Figuur 2B). Snijd elke glazen pipet, eventueel met behulp van een diamantpen, tot de gewenste lengte en gladde pipet randen op een vlam. Coat elke pipet door het kort nat te maken met GS voor gebruik. Muisoffer en spierdissectie Verwarm de spijsverteringsoplossing 10 minuten voor op kamertemperatuur voordat u met de ontledingsprocedure begint. Polypropyleen FACS ronde bodem buizen zijn de meest geschikte containers voor het doel. Onmiddellijk voor het begin van het ophalen van de spier, offer de muis volgens de juiste nationale IACUC aanbeveling. Nat zijn onderlichaam met 70% ethanol voor het snijden van de huid om de verwijdering van het haar gemakkelijker te maken. Zet de muis in een gevoelige positie op een steun van polystyreen bedekt met aluminium papier en snijd de huid vanaf het midden van de rug in de lengterichting en in de richting van de benen. Verwijder de huid voorzichtig zonder de spieren en pezen aan te raken. Het is mogelijk om alle huid af te trekken. Snijd de twee poten van de muis en ga snel verder met de dissectie.OPMERKING: Als het comfortabeler is, is het mogelijk om de dissectie op de hele muis voort te zetten, maar werken aan het been zorgt voor meer mobiliteit en precisie in de latere sneden. Bevestig het been op de steun op het niveau van de voet met behulp van een pin en beginnen met het isoleren van skeletspieren van belang in deze volgorde: TA, EDL, Gastrocnemius en Soleus. Til de onderste pees van TA met een scherpe pincet op enkelhoogte en snijd het, dan gesneden met fijne schaar rondom de TA spier naar de andere pees op het niveau van de knieschijf(Figuur 3A). Breng over in de spijsverteringsoplossing. Til de onderste pees van EDL op en scheid deze van andere spieren door deze voorzichtig omhoog te trekken naar de andere pees. Snijd en plaats het in de spijsverteringsoplossing.OPMERKING: Aangezien EDL extreem klein kan zijn om afzonderlijk van TA te worden gesneden, kunnen ze samen worden ontleed(figuur 3B). Dan, als de hele spier is te groot, snijd het in 2-3 stukken vanaf de pees en na de vezels in een longitudinale richting(Figuur 3C). Draai het been met de rugspieren en bevestig de voet met behulp van de pin. Til de pees van de Achille op, Gastrocnemius zal automatisch scheiden van andere spieren. De bovenste pees zit achterin de knieschijf. Snijd het en voeg de spier aan de spijsvertering. Til de uitwendige pees van het been (ten opzichte van het lichaam) op en verkrijg de Soleus. Voorzichtig scheiden van de andere spieren door te scrollen onder met de pincet. Doe hetzelfde voor de andere etappe (stappen van 1.2.7. tot 1.2.11.). Spiervertering Broed de spijsverteringsoplossing met alle spieren in een waterbad bij 37 °C gedurende ongeveer 45-50 min. Controleer tijdens de spijsverteringstijd regelmatig de spier om oververtering te voorkomen. Om de 10 minuten omkeren de spijsvertering buizen 10x met een energetische beweging (vermijd vortexing). Stop de spijsvertering wanneer de spieren beginnen los te komen en myofibers zichtbaar zijn. Helemaal aan het einde van de spijsvertering schudden de monsters. Om de spijsvertering te stoppen, breng je de spijsverteringssuspensie voorzichtig over op een voorverwarmde petrischaal van 100 mm met een wasoplossing van 10 mL.OPMERKING: Vermijd spierovertering, omdat dit onvermijdelijk zal resulteren in de isolatie van hyper-gecontracteerde myofibers. Meestal met dit protocol, spieren van homozygoot mutant muizen nemen 45 min te worden verteerd, terwijl de spieren van wilde type muizen nemen 50-55 min. Spijsvertering tijd moet experimenteel worden gevalideerd. Single myofibers isolatie Eerst isoleren van de vezels al gescheiden onder een ontleden microscoop door ze individueel te plukken met een gecoate P200 pipet of klein gaatje Pasteur en breng ze van de 100 mm Petri in een nieuwe 35 mm Petri schotel met 5 mL van voorverwarmde wasoplossing. Om verder myofibers vrij te geven, pipette de spier op en neer gebruikend een groot gat boring glaspipet met warm middel, tot de vezels mechanisch worden vrijgegeven. Wees niet te persistent, want dit zal leiden tot schadelijke vezels. Doorgaan met het vrijgeven van myofibers uit de spier totdat het gerecht bevat een wenselijke hoeveelheid. Als de petrischaal langer dan 8 min op kamertemperatuur wordt gehouden, stop en voer dan minimaal 5 min incubatie uit bij 37 °C, 5% CO2 om het medium opnieuw te equiliberen. Voordat u de single myofibers naar het kweekmedium overzet, laat u ze op 37 °C, 5% CO2 in wasschaal gedurende ten minste 1 uur. Dit helpt myofibers aan te passen aan de in vitro conditie.LET OP: Volwassen myofibers zijn minder gevoelig voor stress en kunnen worden gewassen ~ 2-3x. Echter, in deze toestand (op 19 dagen postnatale leeftijd) is het beter om slechts een wasstap uit te voeren om myofiberschade te voorkomen. Let daarom altijd op om geselecteerde myofibers voldoende schoon te houden door geen vuil of hypercontracted vezels te dragen. Single myofiber cultuur Breng individuele myofibers over naar een nieuwe voorverwarmde schotel met het juiste kweekmedium (hoog serummedium om activering van satellietcellen mogelijk te maken, zie figuur 1). Verander het medium in de geïsoleerde myofibers, door ze over te dragen aan een nieuw gecoate gerecht met nieuw cultuurmedium, pas na 48-72 uur cultuur om stress te voorkomen die zal leiden tot myofibers hypercontractie en verstoring. 2. Downstream toepassingen: Myofibers crosslinking en immunofluorescentie OPMERKING: De aan myofibers geassocieerde satellietcellen kunnen worden gevisualiseerd door immunofluorescentie (IF) op het moment van belang. Aangezien de meeste gepubliceerde protocollen zijn geoptimaliseerd om IF uit te voeren op volwassen myofibers, wordt hier een gedetailleerd protocol gepresenteerd om betrouwbare resultaten te verkrijgen, ook op myofibers geïsoleerd van postnatale spieren. Myofiber crosslinking Bereid voordat u begint alle benodigde oplossingen voor zoals beschreven in tabel 2. Precoat met GS maar liefst 1,5 mL microcentrifugebuizen als het aantal monsters. Zorg ervoor dat u alle GS verwijdert voordat u verdergaat. Aangezien crosslinked vezels zijn harder dan de levende en moeilijker te pipette, zorg ervoor dat crosslink ongeveer 200-300 vezels afzonderlijk per buis. Onder een ontleden microscoop, verzamel alle vezels die kunnen worden beschouwd als gezond, breng ze naar de microcentrifuge buis en laat de buis verticaal gedurende 5 minuten in de incubator om vezels te vestigen. Verwijder de supernatant heel langzaam uit de buis. Crosslink vezels door het toevoegen van 1 mL van 4% paraformaldehyde (PFA) bij RT aan de buis. Doe het voorzichtig om vezels nood te voorkomen. Om te voorkomen dat vezels verweven tijdens de crosslinking, houd de buis in zeer zachte agitatie gedurende 10 min. Houd de buis in een verticale positie gedurende 5 minuten op RT om vezels te vestigen, gooi dan de supernatant ervoor te zorgen dat de meerderheid van het PFA-volume te verwijderen. Voeg 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe en houd de buizen 5 minuten verticaal bij RT om de vezels aan sediment te laten. Verwijder de supernatant en herhaal de wasprocedure (stap 2.1.8.) twee maal opnieuw. Houd gekruiste monsters op 4 °C.LET OP: Het is mogelijk om crosslinked myofibers een week op 4 °C te houden. Als de vezels blijven meer dan een week in deze toestand, zal dit onvermijdelijk resulteren in myofibers verstrengeling. Immunofluorescentie Houd de buizen met de vezels staan op RT voor ten minste 5 minuten om voor vezel sedimentatie. Verwijder de supernatant, waardoor slechts een klein volume om zeker te zijn geen vezels te verwijderen. Voeg 1 mL van 0,5% Triton X-100 toe in PBS en broed gedurende 5 minuten met zachte agitatie. Zet buizen in verticale positie gedurende 5 min, verwijder dan supernatant. Voeg 1,5 mL PBS toe en broed gedurende 5 minuten met zachte agitatie. Houd buizen in verticale positie gedurende 5 minuten, verwijder dan de supernatant. Voeg 1 mL blokkeeroplossing toe en incubeer 1 uur bij RT met zachte agitatie. Houd buizen 5 min in verticale positie, verwijder dan de supernatant. Verdun primaire antilichamen bij blokkeeroplossing, voeg ze toe aan de buizen en broed ze ‘s nachts uit bij 4 °C bij zachte agitatie (voor voorgestelde concentraties zie Tabel van Materialen).OPMERKING: Als alternatief kan het primaire antilichaam 3 uur worden geïncubeerd bij RT. Echter, ‘s nachts incubatie gaf optimale kleuring. Het incubatievolume voor zowel primaire als secundaire antilichamen moet 300 μL zijn wanneer sedimenteerde vezels de 100 μL-inkeping van de 1,5 mL microcentrifugebuis bereiken. Wanneer vezels minder overvloedig zijn, wordt een volume van 100-200 μL aanbevolen. Laat de buizen 5 minuten in verticale positie staan en verwijder vervolgens de supernatant. Voer 3 wasbeurten uit in 1 mL van 0,25% Tween-20 in PBS, broed gedurende 5 minuten in zachte agitatie en laat de buizen telkens 5 minuten staan.OPMERKING: Vanaf hier voer u alle stappen in het donker uit om fluorchromes bleken te voorkomen. Verdun secundaire antilichamen in blokkeeroplossing, voeg ze toe aan de buizen en broed ze 1 uur bij RT uit met zachte agitatie (voor concentraties zie Tabel van Materialen). Was twee maal in 1 mL van 0,1% Tween-20 in PBS, uitbroeden gedurende 5 min met zachte agitatie en laat de buizen vervolgens in staande positie voor 5 min. Verwijder de supernatant, voeg 1 mL DAPI-oplossing toe en broed gedurende 5 minuten in met zachte agitatie. Laat de buizen 5 minuten verticaal in een rek staan en verwijder vervolgens de supernatant. Was met 1 mL PBS, uitbroed gedurende 5 minuten met zachte agitatie en laat de buizen vervolgens 5 minuten in een rek staan. Verwijder de supernatant, waardoor een volume van ongeveer 50 μL. Montage van fluorescerend gelabeld myofibers op microscoopdia’s Snijd een P200 pipet tip en coat het met blokkeren oplossingLET OP: Om de tip te coaten, pipet de oplossing op en neer meerdere malen voor het plukken van de vezels, zal dit voorkomen dat vezels te houden aan de tip muur. Verzamel de vezels van de buis en verspreid ze op een microscoop glas dia. Gebruik onder een ontledenmicroscoop, met alleen het natuurlijke licht dat door de spiegel wordt gereflecteerd, een nieuwe (niet gesneden) P200 pipettip om de vezels te verspreiden en de overtollige vloeistofoplossing te verwijderen. Laat de glijbanen in het donker ongeveer 10-15 minuten drogen, totdat er een zeer lage hoeveelheid oplossing overblijft. Voeg het montagemedium op de glijbaan toe (de juiste hoeveelheid montagemedium moet worden gekalibreerd op de afmeting van de coverslip: voor een coverslip van 24 x 40 mm is 20 μL voldoende) en leg dan langzaam een afdekglas op het gebied met de vezels. Let erop dat er geen bubbels tussen de glazen ontstaan. Druk op de coverslip, zodat de vezels zal leggen op een enkel horizontaal plan. Bevestig de coverslip met nagellak. Bewaar de monsters maximaal 4 weken op 4 °C. Verwerf de gewenste beelden van fluorescerend gelabeld myofibers met een confocale microscoop.