यह पेपर चूहों में वयस्क न्यूरोजेनेसिस को मापने के लिए बीआरडीयू सकारात्मक कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए सबसे आम तकनीकों में से चार प्रस्तुत करता है। इस काम में अभिकर्मक तैयारी, थाइमिडीन एनालॉग प्रशासन, ट्रांसकार्डियल छिड़काव, ऊतक तैयारी, पेरोक्सीडेज इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रतिक्रिया, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, सिग्नल प्रवर्धन, काउंटरस्टेनिंग, माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और सेल विश्लेषण के निर्देश शामिल हैं।
वयस्क हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनेसिस (एएचएन) के क्षेत्र में सबसे महत्वपूर्ण चीजों में से एक नई उत्पन्न कोशिकाओं की पहचान है। थाइमिडीन एनालॉग्स (जैसे 5-ब्रोमो-2′-डीऑक्सीयूरिडिन (बीआरडीयू)) का इम्यूनोडिटेक्शन एक मानक तकनीक है जिसका उपयोग इन नई उत्पन्न कोशिकाओं की कल्पना के लिए किया जाता है। इसलिए, बीआरडीयू को आमतौर पर छोटे जानवरों में इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया जाता है, इसलिए थाइमिडीन एनालॉग डीएनए संश्लेषण के दौरान विभाजित कोशिकाओं में शामिल हो जाता है। मस्तिष्क स्लाइस के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण द्वारा पता लगाया जाता है। इस तकनीक का उपयोग करने वाले प्रत्येक शोध समूह इस बात की सराहना कर सकते हैं कि एक सफल दाग प्राप्त करने के लिए मिनट विवरणों पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, एक महत्वपूर्ण कदम एचसीएल के साथ डीएनए विकृतीकरण है, जो इसे दागने के लिए सेल नाभिक तक पहुंचने की अनुमति देता है। हालांकि, मौजूदा वैज्ञानिक रिपोर्टों में ऐसे बहुत कम चरणों का विस्तार से वर्णन किया गया है। इसलिए, तकनीक को मानकीकृत करना नई प्रयोगशालाओं के लिए चुनौतीपूर्ण है क्योंकि सकारात्मक और सफल परिणाम देने में कई महीने लग सकते हैं। इस काम का उद्देश्य थाइमिडीन एनालॉग बीआरडीयू के साथ काम करते समय विस्तार से इम्यूनोस्टेनिंग तकनीक के सकारात्मक और सफल परिणामों को प्राप्त करने के लिए चरणों का वर्णन और विस्तृत करना है। प्रोटोकॉल में अभिकर्मक तैयारी और सेटअप, कृंतक में थाइमिडीन एनालॉग का प्रशासन, ट्रांसकार्डियल छिड़काव, ऊतक तैयारी, पेरोक्सीडेज इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रतिक्रिया, एविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स का उपयोग, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, काउंटरस्टेनिंग, माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और सेल विश्लेषण शामिल हैं।
यह विचार कि पूरे जीवनकाल में वयस्क मानव मस्तिष्क में नए न्यूरॉन्स उत्पन्न होते हैं, दशकों से वैज्ञानिक समुदाय को मोहित किया है। यह ज्ञान कि मस्तिष्क अपने पूरे जीवनकाल में नए न्यूरॉन्स उत्पन्न करता है, विभाजन 1,2 के तहत कोशिकाओं का पता लगाने के माध्यम से प्राप्त किया गया था। वयस्क मस्तिष्क में नए उत्पन्न न्यूरॉन्स का पता लगाने की पहचान पहली बार चूहों में इंट्राक्रैनियल रूप से ट्राइटाइज्ड थाइमिडीन (थाइमिडाइन-एच 3) को इंजेक्ट करके और ऑटोरेडियोग्राम 1,2 द्वारा सेल चक्र में कोशिकाओं का पता लगाकर की गई थी। ग्लिया के कोशिका विभाजन और न्यूरोब्लास्ट्स की उपस्थिति की सूचना दी गई थी, जो प्रसवोत्तर न्यूरोजेनेसिस1 पर पहला आशाजनक डेटा था। फिर भी, थाइमिडीन-एच 3 के उपयोग और पता लगाने से रेडियोधर्मिता का उपयोग निहित होता है, जो इसे प्रबंधित करने वाले लोगों के लिए हानिकारक हो सकता है। तंत्रिका तंत्र में कोशिकाओं के प्रसार, प्रवासन और उत्पत्ति के अध्ययन में बीआरडीयू इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री की उपयुक्तता की जांच करने वाला पहला प्रयास 1988 में मिलर और नोवाकोव्स्की3 द्वारा दिखाई दिया। 1998 में, एरिक्सन और सहयोगियों द्वारा प्रकाशित एक पेपर से पता चला कि 5-ब्रोमो-2′-डीऑक्सीयूरिडाइन (बीआरडीयू)4 के साथ इंजेक्ट किए गए रोगियों के मानव वयस्क मस्तिष्क में नए न्यूरॉन्स पोस्टमॉर्टम की कल्पना की गई थी। इन रोगियों को ट्यूमर4 के विकास को लेबल करने के लिए बीआरडीयू इंजेक्शन (250 मिलीग्राम अंतःशिरा) प्राप्त हुआ। इस तकनीक को पशु मॉडल में अपनाया गया था। इन विधियों की शुरूआत ने क्षेत्र के लिए एक मील का पत्थर चिह्नित किया क्योंकि इसने रेडियोधर्मी यौगिकों के उपयोग के बिना नई उत्पन्न कोशिकाओं का पता लगाने की अनुमति दी। यह प्रक्रिया क्षेत्र में आगे के शोध को बढ़ावा देने के लिए वयस्क मस्तिष्क niches में सेल प्रसार को मापने के लिए स्वर्ण मानक बन गई।
थाइमिडीन एनालॉग तकनीक की सीमा यह है कि यह नई उत्पन्न कोशिकाओं के लिए सेलुलर पहचान के निर्धारण की अनुमति नहीं देता है। हालांकि, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री हमें एक ही सेल की डबल- या ट्रिपल-लेबलिंग तकनीक करने की अनुमति देता है, जो नई उत्पन्न कोशिकाओं के सेलुलर भाग्य और यहां तक कि परिपक्वता के उनके चरणों को मान्य करता है, जिससे क्षेत्र का और विकास होता है। इस विधि को नई उत्पन्न कोशिकाओं को ग्लिया, अविभाजित न्यूरॉन्स, या पूरी तरह से परिपक्व दानेदार कोशिका में अलग करने की विशेषता थी, और यहां तक कि यह निर्धारित करने के लिए कि क्या वे सर्किटरी में सक्रिय रूप से भाग ले रहे हैं। क्षेत्र में एक और सफलता नेस्टिन के डोमेन के तहत उदासीन कोशिकाओं की पहचान करने के लिए ट्रांसजेनिक मॉडल का उपयोग था। नेस्टिन-जीएफपी ट्रांसजेनिक चूहे एक उन्नत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करते हैं, जो नेस्टिन प्रमोटर के नियंत्रण में है। नेस्टिन एक मध्यवर्ती फिलामेंट है जो पूर्वज कोशिकाओं5 की विशेषता है। नेस्टिन-जीएफपी ट्रांसजेनिक चूहों ने न्यूरोजेनेसिस 6 में शामिल प्रारंभिक विकासचरणों को स्थापित करने की अनुमति दी। हालांकि, एक महत्वपूर्ण सीमा एक प्रयोगशाला सुविधा में विशेष परिस्थितियों में नेस्टिन-जीएफपी ट्रांसजेनिक चूहों की कॉलोनी को बनाए रखने में सक्षम होना है जो कुछ वैज्ञानिक समूहों, विशेष रूप से विकासशील देशों के लिए लागत प्रभावी हो जाता है।
ऊपर बताई गई तकनीकों के फायदे और नुकसान हैं। हालांकि, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) द्वारा प्रसार कोशिकाओं की पहचान और सेल परिपक्वता चरण या सेल भाग्य की पहचान करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा डबल- या ट्रिपल-लेबलिंग तकनीक करने की संभावना वयस्क न्यूरोजेनेसिस को मापने का अब तक का सबसे व्यवहार्य तरीका है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके पहचान प्रक्रिया में प्रोटीन, प्रोटीन डोमेन या न्यूक्लियोटाइड को एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल करना शामिल है जो प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में जाना जाता है। उत्तरार्द्ध को द्वितीयक एंटीबॉडी द्वारा पहचाना जाता है, जिसे द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ युग्मित क्रोमोजेन (जैसे, हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज) या फ्लोरोक्रोम (जैसे, एफआईटीसी) के साथ चिह्नित किया जाता है। माइक्रोस्कोप क्रोमोजेन्स और फ्लोरोक्रोम सिग्नल दोनों का पता लगा सकते हैं। आईएचसी का उपयोग करके, झिल्ली प्रोटीन, साइटोस्केलेटन प्रोटीन, या बीआरडीयू जैसे परमाणु घटकों की पहचान करना संभव है। दूसरी ओर, बीआरडीयू सेलुलर नाभिक में पाया जा सकता है क्योंकि यह प्रतिस्पर्धा द्वारा एस-चरण के दौरान डीएनए में शामिल होता है। इसलिए, एक महत्वपूर्ण कदम एचसीएल के साथ डीएनए विकृतीकरण है, जो डीएनए के भीतर बीआरडीयू एंटीबॉडी को बीआरडीयू तक पहुंच की अनुमति देने के लिए डीएनए बॉन्ड खोलता है। यह जानना आवश्यक है कि बीआरडीयू चूहों और चूहे के सीरम में क्रमशः 15 और 60 मिनट के लिए संतृप्त एकाग्रता में मौजूद है, इंट्रापरिटोनियल प्रशासन के बाद, फिर क्रमशः 60 और 120 मिनट पर अज्ञात स्तर तक तेजी सेगिरता है।
यहां, हम चार अलग-अलग लेकिन निकटता से संबंधित आईएचसी तकनीकों का वर्णन करते हैं: सिग्नल प्रवर्धन (चरण 4.1), एविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स (एबीसी) प्रवर्धन (चरण 4.1), सिग्नल प्रवर्धन के बिना अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन (चरण 4.4) और लेबल स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन (एलएसएबी) प्रवर्धन (चरण 4.3) के साथ हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) प्रतिक्रिया का उपयोग करके क्रोमोजेनिक अप्रत्यक्ष पहचान। प्रत्येक विधि के फायदे और नुकसान हैं और विशिष्ट ऊतक आवश्यकताओं के लिए उपयोगी हो सकते हैं ( तालिका 1 देखें)। हमने असंगत प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते समय क्रोमोजेनिक से फ्लोरोसेंट डिटेक्शन विधियों में बदलाव करने के लिए उनकी सामर्थ्य और सादगी के कारण अप्रत्यक्ष आईसीएच विधियों का पालन करने का फैसला किया। एचआरपी दृष्टिकोण इसकी सामर्थ्य, उच्च स्थिरता, उच्च टर्नओवर दर और सब्सट्रेट्स की पूर्ण उपलब्धता के कारण आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली आईएचसी विधि है। फिर भी, हम यह पुष्टि करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करने की सलाह देते हैं कि धुंधला विधि सटीक रूप से काम करती है और एंटीबॉडी फ़ंक्शन का प्रभावी ढंग से परीक्षण करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करती है। मल्टीपल इम्यूनोस्टेनिंग या मल्टीप्लेक्स आईएचसी विधियां (चरण 6 देखें) एक ही प्रयोग में ऊतक अनुभाग से बड़ी मात्रा में डेटा प्राप्त करने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं। यह तकनीक विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब नमूने की उपलब्धता सीमित है। एक और लाभ ऊतक अखंडता को संरक्षित करते हुए एक ही सेलुलर स्थान में सह-व्यक्त विशिष्ट प्रोटीन की एक साथ पहचान करने की संभावना है। मल्टीप्लेक्स विशिष्ट प्रोलिफेरेटिव चरणों (जैसे, नेस्टिन, जीएफएपी, डीसीएक्स, केआई -67) के दौरान व्यक्त विभिन्न मार्करों को दागने की अनुमति देता है, जिससे हमें अधिक विस्तृत प्रसार और भेदभाव अनुसंधान तक पहुंचने में मददमिलती है। क्रॉस-रिएक्टिविटी से बचने के लिए उपयोग की जाने वाली निर्धारण तकनीक के साथ संगत एंटीबॉडी चुनना महत्वपूर्ण है। हम विधि को समायोजित और परिष्कृत करने के लिए प्रत्येक नए एंटीबॉडी (बीआरडीयू सहित) का व्यक्तिगत रूप से परीक्षण करने की सलाह देते हैं। फिर, डबल अनुक्रमिक धुंधलापन पेश करें और अंत में, एक साथ इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रिया शुरू करें जब अनुक्रमिक विधि पूरी तरह से हावी हो। इस विधि के लिए उपयुक्त द्वितीयक एंटीबॉडी चुनना महत्वपूर्ण है।
पद्धति | विशिष्ट विधि | लाभ | नुकसान |
अप्रत्यक्ष पहचान विधि | डीएबी के साथ पेरोक्सीडेज प्रतिक्रिया | 1. प्रत्यक्ष पहचान और अप्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति विधि की तुलना में उच्च संवेदनशीलता। 2. फ्लोरोक्रोम की तुलना में फोटोब्लीचिंग के लिए उच्च प्रतिरोध। 3. फ्लोरेसेंस डिटेक्शन विधि की तुलना में कम लागत |
1. कम रंग रंगों के साथ मल्टीप्लेक्सिंग के लिए मुश्किल। 2. एक ही सेलुलर स्पेस में सह-व्यक्त लक्ष्यों के लिए जटिल। 3. एक ही ऊतक पर एक साथ दुर्लभ और उच्च प्रचुर मात्रा में लक्ष्यों के लिए कम गतिशील रेंज। |
प्रतिदीप्ति | 1. अधिक रंग रंगों के साथ मल्टीप्लेक्सिंग के लिए सबसे अच्छा और आसान। 2. एक ही सेलुलर स्पेस में सह-व्यक्त लक्ष्यों के लिए सबसे अच्छा। 3. एक ही ऊतक पर एक साथ दुर्लभ और उच्च प्रचुर मात्रा में लक्ष्यों के लिए बेहतर गतिशील रेंज। 4. कोई अतिरिक्त कदम नहीं। |
1. डीएबी विधि के साथ अप्रत्यक्ष पेरोक्सीडेज प्रतिक्रिया की तुलना में कम संवेदनशीलता। 2. समय के साथ फोटोब्लीचिंग के लिए कमजोर प्रतिरोध। 3. अधिक महंगा। |
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सिग्नल प्रवर्धन विधि | एविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स (एबीसी) | 1. प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष पहचान विधि की तुलना में उच्च संवेदनशीलता। 2. पृष्ठभूमि कम करें |
1. अतिरिक्त कदम। 2. प्रवर्धन नहीं होने की तुलना में अधिक महंगा। |
लेबल स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन (LSAB) | 1. प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष पहचान विधि की तुलना में उच्च संवेदनशीलता। 2. एबीसी विधि की तुलना में अधिक पर्याप्त ऊतक प्रवेश। 3. पृष्ठभूमि कम करें |
1. अतिरिक्त कदम। 2. एबीसी विधि की तुलना में अधिक महंगा। |
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अतिरिक्त प्रवर्धन विधि नहीं | 1. कम लागत। 2. कोई अतिरिक्त कदम नहीं। 3. उच्च प्रचुर लक्ष्यों के लिए आदर्श। |
1. कम संवेदनशीलता: बिना किसी प्रचुर लक्ष्य के समस्याग्रस्त। |
तालिका 1: आईएचसी तकनीकों के फायदे / यह तालिका अप्रत्यक्ष पहचान विधियों के लिए फायदे / नुकसान दिखाती है: (3,3′-डायमिनोबेंज़िडाइन) डीएबी और प्रतिदीप्ति के साथ पेरोक्सीडेज प्रतिक्रिया; और सिग्नल प्रवर्धन विधियां: एविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स (एबीसी), लेबल स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन (एलएसएबी), और अतिरिक्त प्रवर्धन विधि नहीं।
उचित विश्लेषण करने और परिणामों को प्रस्तुत करने के लिए एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि मौलिक है। रिज़ॉल्यूशन को बेहतर बनाने के लिए दो दृष्टिकोण हैं: 1) एक बेहतर माइक्रोस्कोप डिज़ाइन का उपयोग (जैसे, कॉन्फोकल, मल्टीफोटॉन) या 2) संख्यात्मक रूप से डीकॉन्वोल्यूशन9 का उपयोग करके छवियों को बढ़ाने के लिए धुंधली प्रक्रिया को उलटना। दुर्भाग्य से, उपकरणों की उच्च लागत और इसकी सर्विसिंग10 के कारण कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सस्ती नहीं है। एक वाइड-फील्ड एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप और जेड-स्टैक छवियों के बाद के डीकन्वोल्यूशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 8,9 के लिए एक उपयुक्त, कम लागत वाला विकल्प प्रदान करते हैं। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, डीकॉन्वोल्यूशन लक्ष्य गणितीय निष्कासन एल्गोरिदम10 का उपयोग करके एपिफ्लोरेसेंस या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा प्राप्त छवि में दिखाए गए धुंध, आउट-ऑफ-फोकस धुंध और विकृति को कम करके अधिग्रहण प्रणाली9 द्वारा अवक्रमित मूल संकेत को बहाल करना है। अधिग्रहित धुंधली छवि को गणितीय रूप से 3 डी पॉइंट-स्प्रेड फ़ंक्शन (पीएसएफ) के साथ देखी गई वस्तुओं को संयोजित करने के परिणामस्वरूप मॉडलिंग की जा सकती है। पीएसएफ ऊतक के नमूने द्वारा उत्सर्जित प्रकाश के बिंदुओं का एक सैद्धांतिक विवर्तन पैटर्न है और माइक्रोस्कोप द्वारा एकत्र किया जाता है। पीएसएफ फ़ाइल प्रत्येक छवि की विशिष्ट स्थितियों के साथ बनाई गई है, जैसे कि कैमरे की सीसीडी सेल स्पेसिंग, उपयोग किए गए मीडिया का अपवर्तक सूचकांक, उद्देश्य लेंस का संख्यात्मक एपर्चर, फ्लोरोफोरे की उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य, छवि आकार, जेड-स्टैक प्रोसेसिंग विधि में छवियों की संख्या और उनके बीच का स्थान (तालिका 2 में तकनीकी विनिर्देश देखें)। दूसरे शब्दों में, पीएसएफ फ़ाइल माइक्रोस्कोप अवलोकन 9 पर इमेजिंग सेटअप के प्रभावों को सारांशित करतीहै। हालांकि, हम प्रत्येक जेड-स्टैक छवि के लिए अपनी विशिष्ट पीएसएफ फ़ाइल बनाने के लिए विवर्तन पीएसएफ 3 डी प्लगइन (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) का उपयोग करते हैं। जेड-स्टैक छवियां स्लाइड के एक ही एक्सवाई स्थान पर परिभाषित गहराई (जेड-अक्ष) से डिजिटाइज्ड ऑप्टिकल वर्गों की एक श्रृंखला हैं। एक कंप्यूटर फोकस प्लेन से प्राप्त जानकारी को उन संकेतों को फिर से असाइन करके संकलित करता है जो अन्य फोकल विमानों में स्थित वस्तुओं से उत्पन्न हुए हैं। जेड-स्टैक छवियां बनाने के लिए, स्लाइड की विभिन्न केंद्रित परतों से छवियां लेना आवश्यक है (उदाहरण के लिए, हर 1 μm गहराई पर एक ही XY क्षेत्र की दस अलग-अलग छवियां)। फिर, हम जेड-स्टैक या 3 डी छवि बनाने के लिए निर्माता या फिजी द्वारा प्रदान किए गए माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हैं। परिणाम एक एकल स्टैक छवि फ़ाइल होगी (उदाहरण के लिए, विभिन्न फोकस के साथ दस छवियां)। कई ग्राहक-विशिष्ट उपकरण और सॉफ्टवेयर समाधान हैं, जैसे कि डीकॉन्वोल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर। हम डीकन्वोल्यूशनलैब 29 का उपयोग करके डीकॉन्वोल्यूशन प्रक्रिया के आउटपुट दिखाएंगे जो एक फिजी11 प्लगइन (इमेजजे12 का वितरण) है। डीकॉन्वोल्यूशन अंतिम माइक्रोग्राफ के संकल्प को बेहतर बनाने में मदद करेगा (चित्रा 1बी, सी देखें)। अधिक जानकारी और निर्देश के लिए, हम दृढ़ता से संदर्भ13 पढ़ने की सलाह देते हैं।
चित्रा 1: कई रंग चैनलों के लिए 3 डी डीकन्वोल्यूशन की प्रतिनिधि छवि। (ए) कम आवर्धन पर डीजी। (बी) प्रत्येक चैनल और विलय की गई छवि के लिए मूल जेड-स्टैक छवियां। (सी) प्रत्येक चैनल और विलय की गई छवि के लिए 3 डी जटिल जेड-स्टैक छवियां। यह मस्तिष्क चूहे से था जो शारीरिक गतिविधि समूह का हिस्सा था। लेबल स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन (एलएसएबी) प्रवर्धन विधि का उपयोग किया गया था। इसमें बीआरडीयू (लाल), डीएपीआई को काउंटरस्टेनिंग (नीला) और ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) को एस्ट्रोग्लियाल मार्कर (हरे) के रूप में इंगित करने के लिए साइ3 स्ट्रेप्टाविडिन संयुग्मित एंटीबॉडी दिखाया गया है। एमएल = आणविक परत; जीसीएल = दानेदार कोशिका परत; एसजीजेड = उप-समूह क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
इस काम का उद्देश्य इम्यूनोस्टेनिंग के साथ सकारात्मक और सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए चरणों का विस्तृत विवरण प्रदान करना है और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग के बिना बीआरडीयू-आधारित अध्ययनों में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले चरणों को सूचीबद्ध करना है। बीआरडीयू धुंधला एक ऐसी तकनीक है जिसके लिए कई चरणों की आवश्यकता होती है जिन्हें एक सफल दाग प्राप्त करने के लिए सावधानीपूर्वक पालन किया जाना चाहिए। इन धुंधला तकनीकों को मानकीकृत करने में आमतौर पर महीनों लगते हैं और यह समय और संसाधन गहन है। हमने अनुमान लगाया कि यह आलेख समय और त्रुटियों को कम करके इस फ़ील्ड के भीतर शुरू होने वाले समूहों को जानकारी प्रदान कर सकता है।
वयस्क न्यूरोजेनेसिस एक ऐसी प्रक्रिया है जो वयस्क तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं के आला में सबसे अधिक बार होती है जिसमें उनके जीवनकाल में नए न्यूरॉन्स उत्पन्न करने की क्षमता होती है। ब्रोमोडॉक्स्यूरिडिन (बीआरडीयू) लेबलिंग का व्यापक रूप से इम्यूनोलॉजी में वयस्क मस्तिष्क में नई उत्पन्न कोशिकाओं की संख्या को चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है। बीआरडीयू को मुख्य रूप से असतत मस्तिष्क क्षेत्रों (न्यूरोजेनिक क्षेत्रों) की कोशिकाओं में शामिल किया जाएगा। ये कोशिकाएं उप-वेंट्रिकुलर ज़ोन (एसवीजेड) में स्थित होती हैं, हिप्पोकैम्पस के डेंटेट गाइरस- हिलस और दानेदार कोशिकाओं के बीच जिन्हें उप-दानेदार क्षेत्र (एसजीजेड) 1,2,18 के रूप में जाना जाता है। इसके अलावा, वयस्कता में कम प्रोलिफेरेटिव क्षमता की विशेषता वाले विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्र हैं, जिनमें हाइपोथैलेमस, स्ट्रेटम, नियोकॉर्टेक्स और एमिग्डाला19 शामिल हैं। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, बीआरडीयू धुंधलापन सेल प्रसार का पता लगाने के लिए वयस्क न्यूरोजेनेसिस अनुसंधान के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है। हालांकि, मार्कर के रूप में बीआरडीयू के उपयोग की सीमाएं और नुकसान हैं। पहला यह है कि बीआरडीयू एक सेल चक्र मार्कर है। इसलिए, सेल भाग्य की पहचान करने के लिए डबल या ट्रिपल स्टेनिंग किया जाना चाहिए और लेबल की गई कोशिकाओं के विशिष्ट विकास चरण का पता लगाने के लिए सेल मार्करों को शामिल करना चाहिए। बीआरडीयू के बारे में एक और चिंता यह है कि यह एक विषाक्त और म्यूटाजेनिक समाधान है जो डीएनए स्थिरता को संशोधित करता है जो सेलुलर फ़ंक्शन और सेल चक्रों को बदल सकता है। प्रशासन प्रोटोकॉल और प्रशासन खुराक (50 \u2012600 mg / kg) का पालन करने का निर्णय लेते समय पिछली जानकारी पर विचार किया जाना चाहिए। एक और महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि बीआरडीयू एक डीएनए संश्लेषण मार्कर है, न कि सेल प्रसार मार्कर14। इसलिए, सेल प्रसार को अन्य घटनाओं जैसे डीएनए की मरम्मत, गर्भपात सेल चक्र पुन: प्रवेश और जीन दोहराव से अलग करना प्रासंगिक है। शोधकर्ताओं को बीआरडीयू के उचित उपयोग को सुनिश्चित करने के लिए उचित नियंत्रणों का पालन करना चाहिए। इन समस्याओं और सीमाओं के बारे में अधिक विस्तृत चर्चा के लिए, हम ताउपिन के काम14 की समीक्षा करने की सलाह देते हैं। एक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल की मानकीकरण प्रक्रिया धीमी और चुनौतीपूर्ण हो सकती है। इस काम में, हमने एक सफल आईएचसी प्रोटोकॉल का प्रबंधन करने के लिए सभी सामान्य चरण प्रस्तुत किए हैं। हालांकि, हम अनुशंसा करते हैं कि प्रत्येक शोध समूह पहले से ऊतक, एंटीबॉडी और स्थितियों का परीक्षण और मूल्यांकन करता है। परीक्षण और मूल्यांकन प्रत्येक एंटीबॉडी और ऊतक परीक्षण के लिए ऊष्मायन, धोने के चरणों और शक्तियों के कम से कम तीन अलग-अलग स्तरों के साथ किया जाना चाहिए। हम यह भी अनुशंसा करते हैं कि शोधकर्ता 20,21,22,23,24,25 विशिष्ट आवश्यकताओं और आवश्यकताओं को पूरा करने वाले सर्वोत्तम को चुनने में सक्षम होने के लिए अतिरिक्त प्रोटोकॉल की समीक्षा करें।
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, प्रक्रिया में कई चरण और पद्धतिगत विचार शामिल हैं जो आमतौर पर वैज्ञानिक लेखों में उपयोग और उल्लेख किए जाते हैं, जिन पर बाद में चर्चा की जाएगी। हम अनुशंसा करते हैं कि शोधकर्ता तकनीक, बजट, उपकरण, सेटअप और मुख्य अनुसंधान लक्ष्य के संदर्भ में एंटीबॉडी को सावधानीपूर्वक और सही ढंग से चुनें। एंटीबॉडी को उसी प्रकार के ऊतक के साथ परीक्षण किया जाना चाहिए जिसे बाद में प्रयोग में परीक्षण किया जाएगा। हम एक एंटीबॉडी के उपयोग की भी सलाह देते हैं जिसे एक ही उद्देश्य (आईएचसी) के लिए परीक्षण किया गया था (यानी, न केवल पश्चिमी धब्बा या प्रवाह साइटोमेट्री तकनीकों में) निर्धारण तकनीक के साथ इसकी संगतता का परीक्षण करने के लिए। बीआरडीयू धुंधला करने के लिए विभिन्न मार्गों का उपयोग किया जा सकता है जैसे कि इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन, इंट्रापरिटोनियल इन्फ्यूजन, मौखिक अंतर्ग्रहण, या इंट्रावेंट्रिकुलर इन्फ्यूजन (प्रत्येक तकनीक के अधिक विस्तृत विवरण के लिए, संदर्भ26 देखें)। यदि इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन का चयन किया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि बीआरडीयू आंत क्षेत्र से बचने के लिए पेरिटोनियल गुहा में प्रशासित है। चूंकि आंत में दोहराव में कई कोशिकाएं होती हैं जो मस्तिष्क तक पहुंचने से पहले बीआरडीयू को समाप्त कर सकती हैं जो लेबल कोशिकाओं की संख्या को प्रभावित करेगी। पतले वर्गों को प्राप्त करना महत्वपूर्ण है क्योंकि वे समाधानों के बेहतर प्रवेश की अनुमति देते हैं। केम्परमैन एट अल.27 द्वारा प्रस्तावित स्टीरियोलॉजिकल प्रक्रिया का पालन करते हुए, 40 μm मोटी कोरोनल स्लाइस को रोस्ट्रो-पुच्छल रूप से काटा गया था और 24-वेल सेल कल्चर प्लेट में स्थानांतरित कर दिया गया था। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को स्लाइड पर लगाए गए ऊतक के साथ या फ्री-फ्लोटिंग सेक्शन के रूप में किया जा सकता है। चूंकि बीआरडीयू कोशिका नाभिक में गहराई से स्थित है, इसलिए यह मुक्त-फ्लोटिंग वर्गों में समाधानों के प्रवेश की अनुमति देता है जो रुचि के क्षेत्र में बेहतर परिणाम और बेहतर पहुंच प्रदान करता है। प्राथमिक एंटी-बीआरडीयू एंटीबॉडी पहुंच की अनुमति देने के लिए डीएनए बॉन्ड (डीएनए विकृतीकरण) खोलना महत्वपूर्ण है। इस काम में, हमने एचसीआई इनक्यूबेशन के उपयोग के साथ इन विशिष्ट प्रक्रियाओं को अंजाम दिया। दूसरी ओर, अस्पष्ट एपिटोप्स को अवरुद्ध करने की प्रक्रिया ने सेल सिग्नल की अधिक सटीक पहचान की अनुमति दी।
अच्छी झिल्ली परमेबिलाइजेशन एंटीबॉडी को हित क्षेत्र में ठीक से प्रवेश करने की अनुमति देता है। पीबीएस ++ और पीबीएस + समाधानों में ट्राइटन एक्स -100 जैसे परमेबिलाइज़र को जोड़ने से झिल्ली परमेबिलाइजेशन में सुधार होता है। इस प्रोटोकॉल में पीबीएस और ट्राइस-बफर्ड सेलाइन (टीबीएस) अभिकर्मकों दोनों का उपयोग किया जा सकता है। बजट के संदर्भ में, टीबीएस पीबीएस की तुलना में सापेक्षता सस्ता हो सकता है। हालांकि, पीबीएस एंटी-फॉस्फेट एंटीबॉडी के साथ हस्तक्षेप कर सकता है और क्षारीय फॉस्फेट-संयुग्मित एंटीबॉडी को रोक सकता है, इसलिए पीबीएस के उपयोग से बचें यदि लक्ष्य फॉस्फोराइलेशन (यानी, फॉस्फोराइलेटेड) द्वारा पोस्ट ट्रांसलेशनल रूप से संशोधित है। हमने इस काम के लिए पीबीएस का उपयोग किया, और हमें पता चला कि ऊतक धोने के कदमों ने अधिक विशिष्ट संकेत दिया। हम शोधकर्ताओं को टीबीएस ओ पीबीएस का उपयोग करके कम से कम तीन धोने के चक्र करने की भी सलाह देते हैं। समाधान ताजा तैयार किया जाना चाहिए। एंटीजन पुनर्प्राप्ति (एआर) एक विधि है जिसका उद्देश्य निर्धारण के कारण एंटीजेनिसिटी के नुकसान को कम करना है जो तृतीयक और चतुर्धातुक एंटीजन की संरचना को संशोधित करता है। यह कमी एंटीजन को एंटीबॉडी28,29 द्वारा पता लगाने योग्य बनाती है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले गर्मी-प्रेरित एपिटोप पुनर्प्राप्ति (HIER) ने उच्च तापमान या मजबूत क्षारीय हाइड्रोलिसिस (ईडीटीए पीएच 8.5 या ट्रिस पीएच 9.5 के रूप में अन्य बफर समाधानों के साथ) द्वारा फॉर्मलाडेहाइड और प्रोटीन के बीच रासायनिक प्रतिक्रियाओं को उलटने का प्रयास किया। परिणामों की तुलना करने और प्रोटोकॉल के लिए सबसे अच्छा चुनने के लिए विभिन्न एआर प्रोटोकॉल के साथ नए एंटीबॉडी का परीक्षण करना आवश्यक है। यह अंतिम चरण एक नियमित प्रोटोकॉल में वैकल्पिक हो सकता है; हालांकि, हमने इस प्रोटोकॉल के लिए बेहतर परिणाम प्रदान करने के लिए एंटीजन पुनर्प्राप्ति प्रोटोकॉल के साथ ऊतकों का इलाज किया।
गैर-धुंधला संरचना को दृश्यमान बनाने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से प्राथमिक धुंधला रंग को ढंकने से बचने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक धुंधला रंग और विधि को ध्यान में रखते हुए सही अंतिम विपरीत रंग और काउंटरस्टेन तकनीक का चयन करना महत्वपूर्ण है। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए, DAPI (4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल) एक बहुत लोकप्रिय परमाणु और क्रोमोसोम काउंटरस्टेन है जो डीएनए के एटी क्षेत्रों से जुड़ने पर नीले प्रतिदीप्ति (अवशोषण: 360 एनएम, उत्सर्जन: 460 एनएम) का उत्सर्जन करता है। DAPI युक्त माउंटिंग माध्यम उपलब्ध है और उपयोग करना आसान है; यह छवि अधिग्रहण के लिए उत्कृष्ट संकेत प्रतिधारण प्रदान करता है। पेरोक्साइड प्रतिक्रिया के लिए, आईएचसी विभिन्न विकल्पों में उपलब्ध था जैसे कि क्रेसिल वायलेट, हेमेटॉक्सिलिन, तटस्थ लाल, या मिथाइल ग्रीन स्टेनिंग। कई इम्यूनोस्टेनिंग तकनीकों के लिए, क्रॉस-रिएक्टिविटी30 से बचने के लिए उपयोग की जाने वाली निर्धारण तकनीक के साथ एक संगत एंटीबॉडी चुनना महत्वपूर्ण है। जब एकल धुंधलापन के साथ मुद्दों और जटिलताओं को हल किया जाता है, तो आवश्यक समझे जाने पर एक और रंग धुंधला करें। द्वितीयक एंटीबॉडी के बीच गैर-विशिष्ट बंधन को नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है। यह प्राथमिक एंटीबॉडी की एक ही मेजबान प्रजाति में उत्पादित द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करने से पहले प्राथमिक एंटीबॉडी को संतृप्त करके किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, बकरी द्वितीयक एंटीबॉडी में उत्पादित खरगोश और एंटी-खरगोश में उत्पादित एंटी-माउस का उपयोग करते समय, बकरी एंटीबॉडी में उत्पादित एंटी-खरगोश का उपयोग खरगोश एंटीबॉडी में उत्पादित एंटी-माउस से पहले किया जाना चाहिए। जब अनुक्रमिक विधि पूरी तरह से हावी हो जाती है, तो एक साथ इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रिया शुरू की जा सकती है। इस विधि में, माध्यमिक एंटीबॉडी को उचित रूप से चुनना आवश्यक है। आदर्श रूप से, क्रॉस-रिएक्टिविटी से बचने के लिए उन सभी एंटीबॉडी को एक ही मेजबान जानवर से आना चाहिए। हम यह पुष्टि करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण चलाने की सलाह देते हैं कि धुंधला विधि प्रसवोत्तर हिप्पोकैम्पस ऊतक (इस उम्र के आसपास प्रचुर मात्रा में न्यूरोजेनेसिस) में सटीक रूप से काम करती है। यदि सकारात्मक नियंत्रण ऊतक धुंधला समस्याएं दिखाता है, तो प्रक्रिया की समीक्षा करें और उस पर जाएं, सुधार और समायोजन करें, और तब तक दोहराएं जब तक कि एक अच्छा धुंधलापन उत्पन्न न हो। फिर, यह परीक्षण करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण चलाएं कि एंटीबॉडी सामान्य सीरम (प्राथमिक एंटीबॉडी के समान प्रजाति) के साथ एक विशेष प्राथमिक एंटीबॉडी को छोड़कर या प्रतिस्थापित करके सही ढंग से काम करता है। जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया है, छवि डीकन्वोल्यूशन एक शक्तिशाली उपकरण है और एक विकल्प प्रदान करता है जब एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप उपलब्ध नहीं होता है। यह प्रेषित प्रकाश उज्ज्वल-क्षेत्र, वाइड-फील्ड फ्लोरेसेंस और कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्राप्त सभी छवियों पर छवि डीकन्वोल्यूशन को लागू कर सकता है। छवि डीकॉन्वोल्यूशन का अंतिम उद्देश्य मूल संकेत का पुनर्निर्माण करना है कि अधिग्रहण प्रणाली10 खराब हो जाती है।
सारांश में, थाइमिडीन एनालॉग बीआरडीयू के इम्यूनोडिटेक्शन द्वारा कल्पना की गई नई उत्पन्न कोशिकाओं की पहचान एक जटिल लेकिन शक्तिशाली तकनीक है। यह काम वैज्ञानिकों की मदद करने का एक प्रयास है, विशेष रूप से वयस्क हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनेसिस के क्षेत्र में, नई कोशिकाओं को अधिक सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए। हमें उम्मीद है कि यह प्रयास वैज्ञानिक समुदाय के लिए सहायक रहा है और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री तकनीक द्वारा सेल प्रसार के अध्ययन को ठीक करना आसान बनाता है।
The authors have nothing to disclose.
हम तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए श्री मिगुएल बर्गोस और गुस्तावो लागो को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम अभिकर्मकों और सामग्री प्रदान करने में उनके समर्थन के लिए डॉ. क्लोरिंडा एरियस, डॉ. कार्ला हर्नांडेज़ और डॉ. ऑस्कर गैलिसिया को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। हम इस काम के प्रदर्शन के लिए धन प्रदान करने और वीडियो उत्पादन खर्चों को कवर करने के लिए यूनिवर्सिड इबेरोअमेरिकाना सियुदाद डी मेक्सिको के डिविज़ियन डी इन्वेस्टिगासियोन वाई पोस्ग्राडो को भी धन्यवाद देते हैं।
REAGENT PREPARATION AND SETUP | |||
Donor Horse Serum | BioWest | S0900 | Blocking and incubation solutions in PBS |
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | toxic, flammable |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 746436-500G | |
Potassium Phosphate, monobasic | J.T Bker | 3246-01 | |
Sacarose | J.T Baker | 4072-01 | |
Sodium Chloride | Meyer | 2365-500G | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Corrisive, to calibrate pH |
Sodium Phophate Dibasic | Sigma-Aldrich | S9763-5KG | |
Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
THYMIDINE ANALOGUE BRDU ADMINISTRATION | |||
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
23–27G hypodermic needle | BD PrecisionGlide | ||
Saline solution | PiSA | 30130032 | |
Syringes 1 mL | NIPRO | ||
TISSUE PREPARATION | |||
15-ml polypropylene conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
50-ml polypropylene conical tube | Thermo Scientific | 339652 | |
Dissecting tools | |||
Guillotine | Stoelting | ||
Microtome Cryostat | MICROM | HM525 | |
Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3477 | pre-loaded in 12-well culture plates |
Netwell plastic 12-well carrier kit | Corning | 3520 | for 15 mm polyester mesh membrane inserts |
Netwell plastic 6-well carrier kit | Corning | 3521 | |
Perfusion pump | Cole-Parmer | 7553-70 | |
Shaker | IKA | ROKCER 3D Digital | |
IMMUNOSTAINING | |||
Cresyl violet | Sigma-Aldrich | C5042 | 1%, Light sensitive |
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine | Vector Laboratories | SK-4100 | carcinogenic, light sensitive |
Hydochloric Acid | J.T.Baker | 9535-05 | Corrosive, to calibrate pH |
Hydrogen Peroxide, 50% | Meyer | 5375-1L | Toxic, oxidative |
Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Light sensitive |
VECTASTAIN® Elite® ABC Kit Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories | PK-6100 | enzymatic, avidin/biotin based amplification system |
Primary antibodies | |||
Anti-GFAP antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | HPA056030 | 1:500 |
Monoclonal Anti-BrdU antibody produced in Mouse | Sigma-Aldrich | B2531 | 1:250 |
Secondary antibodies | |||
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-065-151 | 1:250 |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP | Invitrogen | G-21040 | 1:1000 |
Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule), TRITC | Sigma-Aldrich | T5393 | 1:250 |
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, FITC | Invitrogen | F-2765 | 1:250 |
Streptavidin, Cy3 | Vector Laboratories | SA-1300 | 1:250 |
IMAGING AND ANALYSIS | |||
Computer | Dell Computer Company | T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB | For controlling and monitoring protocols’ processes |
CCD-camera | Olympus | UC50 | |
CellSens Standard software | Olympus | cellSens Standard Edition | Acquisition Software |
Epifluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
High-pressure 130 W mercury arc lamp | Olympus | U-HGLGPS | |
low autofluorescence immersion oil | Olympus | MOIL-30 Type F | |
Micro cover-glasses (VWR, cat no 48404 454; 24 60 mm) | |||
Microscope slides (VWR, cat no 48323-185; 76 26 mm) | |||
U-FBW filter cube | Olympus | U-FBW | excitation 460 – 495 nm, dichroic mirror 505 nm, suppression 510 nm |
U-FGW filter cube | Olympus | U-FGW | excitation 530 – 550 nm, dichroic mirror 570 nm, suppression 575 nm |
U-FUW filter cube | Olympus | U-FUW | excitation 340 – 490 nm, dichroic mirror 410 nm, suppression 420 nm |