Primer Fare Orta Beyin Nöronlarında Spontan Ca²⁺ Akılarının ve Downstream Etkilerinin Ölçülmesi

Hayvan deneklerinin kullanımına ilişkin tüm prosedürler Texas A&M Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımth ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (25 Kasım 2019; AUP# 2019-0346). NOT: Hücre kültürü çözeltilerinin hazırlanması biyolojik bir güvenlik kabininde steril prosedür kullanılarak yapılmalı ve kontaminasyonu önlemek için 0,2 μm’de filtrelenmelidir. 1. Çözüm ve kültür ortamının hazırlanması 20 μL 1 mg/mL laminin stoğunu 2 mL steril distile H2O. Diseksiyon gününde hazırlayarak laminin kaplama çözeltisini hazırlayın. 1x Hank’in Dengeli Tuz Çözeltisi’nin (HBSS) 45 mL’sine 5 mL ES ekleyerek at (at) serum (ES) durdurma çözeltisi hazırlayın. 0,2 μm filtre sistemi veya şırınga filtre ucu kullanılarak steril filtre. 4 °C’de saklayın. 1x fosfat tamponlu saline (PBS) 2 g BSA tozu ekleyerek ve 45 mL’lik son bir hacim getirerek %4 büyükbaş serum albumin (BSA) stok çözeltisini hazırlayın. 0,2 μm filtre sistemi veya şırınga filtre ucu kullanılarak steril filtre. 4 °C’de saklayın. Papaini 1x HBSS’de 3 mg/mL’ye seyrelterek papain stok çözeltisini hazırlayın. 0,2 μm filtre sistemi veya şırınga filtre ucu kullanılarak steril filtre. -20 °C’de saklayın. Steril H2O’ya 20 mg DNase tozu ekleyerek ve 20 mL’lik son bir hacme getirerek deoksiribonükleaz (DNase) çözeltisini hazırlayın. 0,2 μm filtre sistemi veya şırınga filtre ucu kullanılarak steril filtre. -20 °C’de saklayın. Steril distile H2O’ya 352 mg askorbik asit ekleyerek ve 20 mL’lik son bir hacme getirerek askorbik asit çözeltisini hazırlayın. Gerekirse eritmek için 37 °C banyoda ısı. 0,2 μm filtre sistemi veya şırınga filtre ucu kullanılarak steril filtre. -20 °C’de saklayın. 50 mL Nörobazal ortama aşağıdakileri ekleyerek Hücre Kültürü Ortamını hazırlayın: 500 μL Glutamax (100x), 500 μL at serumu, 1 mL B-27, 100 0L askorbik asit, 500 μL penisilin-streptomisin, 50 μL kanamisin ve 50 μL ampicisilin. 0,2 μm filtre sistemi kullanılarak steril filtre. 4 °C’de saklayın. çözüm yapmak için 9 mL 1x PBS içine 1 mL Triton X-100 ekleyerek %0,01 Triton X-100 Çözümü hazırlayın. Triton X-100 viskoz olduğu için, pipet yavaş yavaş ucu tamamen doldurmak için izin verir. Gerekirse eritmek için 37 °C banyoda ısı. 4 °C’de saklayın. Triton X-100 stoğunu %0,01’e seyreltmek için 3 seri 1:10 seyreltme gerçekleştirin. %1 çözelti yapmak için %1’lik 1x PBS’nin 9 mL içine ‘luk stok seyreltin. %0,1 çözelti yapmak için 9 mL 1x PBS içine %1 mL çözeltiyi seyreltin. % 0.01 çözelti yapmak için 1x PBS 9 mL içine% 0.1 çözelti 1 mL seyreltmek. çözüm için 9 mL 1x PBS’ye 1 mL NGS ekleyerek ve %1 normal keçi serumu (NGS) çözeltisini hazırlayın. %1 çözüm yapmak için 9,9 mL 1x PBS’ye 100 μL NGS ekleyin. Steril distile H2O’ya 735 mg L(+)-Glutamik asit ekleyerek glutamat stok çözeltisini (100 mM) hazırlayın ve 50 mL’lik son bir hacme getirin. Bu konsantrasyonda çözünürlük bir sorun olacaktır. 1 M hidroklorik asit küçük hacimler (100 μL) ekleyerek çözünürlüğü artırmak için yeterlidir. Steril distile H2O’ya 50 mg NBQX ekleyerek NBQX stok çözeltisini (10 mM) hazırlayın ve 13 mL’lik son bir hacme getirin. 2. Kültür yemekleri ve kapak kapaklarının hazırlanması (Diseksiyondan bir gün önce yapılır) NOT: Üç kaplama aracı, poli-L-lizin, poli-L-ornitin ve laminin birleştirilmesinin ideal hücre yapışması ve canlılığını sağladığını bulduk. Biyolojik bir güvenlik dolabına 10 35 mm Petri kabı yerleştirin. Her tabağa iki dairesel 12 mm kapak yerleştirin ve 10 dk için EtOH ile doldurun. EtOH tamamen buharlaşmasını sağlayan, her çanak kalan EtOH aspire etmek için bir vakum hattı kullanın. Pipet ~90-100 μL %0.1 poli-L-lizin çözeltisi her coverslip üzerine, tüm coverslip poli-L-lizin çözeltisi ile kaplı olduğundan emin olun. Bulaşıkları kapaklarla kapatın ve 37 °C’lik bir kuluçka makinesine 1 saat süreyle yerleştirin. Her coverslip’ten kalan poli-L-lizin çözeltisine aspirat ve steril H2O ile durulayın. %0,1 poli-L-ornitin çözeltisi ile 2,2 – 2,3 adımlarını tekrarlayın. Yine, %0,01 laminin çözeltisi ile 2,2 – 2,3 adımlarını tekrarlayın. Bir gün hücre kaplaması için hazır olana kadar °C/5% CO2 kuluçka makinesine yerleştirin. 3. Fare embriyonik diseksiyonları NOT: Biz kültür başına 4 ila 6 zamanlı hamile fareler kullanın. Diseksiyon sürecinin büyük bir kısmı biyolojik bir güvenlik kabininin dışında gerçekleşirken steril prosedürün sürdürülmesi hala önemlidir. Diseksiyonu mikroskobun yakınındaki yüzeylerde ve cerrahi aletlerde EtOH bolca kullanımı idealdir. Kontaminasyonu daha fazla önlemek için diseksiyon sırasında bir maske takılabilir. Ayrıca, kültür ortamında 4 ayrı antibiyotik kullanıyoruz, bu nedenle kontaminasyon olasılığı düşük. Ancak, antibiyotik kullanımı sorunlu ise, Bu diseksiyon kurulum steril bir başlık içinde taşınmış olabilir. Hücre canlılığını korumak için tüm diseksiyon solüsyonları 4 °C’de önceden soğutulmalı ve diseksiyonlar mümkün olan en kısa sürede tamamlanmalıdır. Buz üzerinde diseksiyonları yapmayız. Fare embriyonik orta beyin nöronların diseksiyon yöntemi daha önce açıklananyöntemler9,,10aynıdır. Emici pedli bir diseksiyon mikroskobunun yanındaki bankta bir yer hazırlayın ve EtOH ile serbestçe püskürtün. Sprey iki 100 x 15 mm cam Petri kapları ve bir 50 x 10 mm cam Petri çanak% 70 EtOH ile ve EtOH buharlaşmasını sağlar. Buharlaştıktan sonra, her 100 x 15 mm Petri kabına 50 mL steril 1x HBSS yerleştirin. Sterilize etmek için en az 10 dakika boyunca EtOH’da cerrahi makas, forseps ve mikrotome bıçağı batırın. Kurutmak için emici ped üzerine aletleri yerleştirin. CO2 kullanarak servikal dislokasyon, embriyonik gün 2-3 aylık zamanlanmış gebelik fareler ötanazi 14. Sprey ötanazi farelerin karın% 70 EtOH ile. Forceps kullanarak alt karın kapmak ve cerrahi makas kullanarak karın boşluğu açın. Forceps karın tutan yakın kesme başlayın, karın duvarı geri katlanabilir ve rahim açıkça görülebilir kadar her iki tarafta lateral kesikler yapma. Cerrahi makas kullanarak, rahim boynuzu her iki ucunu kesti. Sonra 1x HBSS ile Petri kabına rahim ve yer çıkarın. Düz uçlu forceps kullanarak dikkatle rahim embriyoları kaldırın. Bu süreç boyunca embriyoları HBSS’de bırakın. Ya forceps veya mikrotome bıçak kullanarak, hızlı bir şekilde boyun yakın keserek embriyoların kafasını kesmek. Mümkün olduğunca seviye bir kesim yapma. Bir diseksiyon mikroskobu altında, kuru bir 50 mm Petri kabına bir embriyo kafası hareket ettirin ve ventral tarafında yerleştirin. Göz/prout’a yakın bir yere yerleştirerek ve delerek başı forceps ile stabilize edin. Forceps mezensefalon nüfuz önlemek için ~ 45 ° aşağı doğru açılı olmalıdır. Diğer taraftan forseps kullanarak, dikkatle mezensefalon belirgin sırt hemen önce deri ve kafatası yarı saydam tabakası kaldırın. Orta hatta yakın başlayın ve mezensefalon tamamen maruz kalana kadar caudally deri ve kafatası kaldırın. Korteks ve mezensefalon ve beyincik yakın diğer arasında bir ucu ile maruz mezensefalon dik forceps tutun. Tüm orta beyni çıkarmak için forcepleri bastırın ve sıkıştırın. Orta beyin segmenti yaklaşık 0,5 mm kalınlığında olmalıdır. Orta beyin segmentini taze 1x HBSS ile dolu ikinci Petri kabına yerleştirin. Her embriyo için bu işlemi tekrarlayın. Diseksiyonu mikroskobu kullanarak, ventral tarafı yukarı bakacak şekilde beyin segmentini konumlandırın. Menenjler hala bağlıise, forseps ile kapma ve yukarı ve uzak beyin segmentinden kaldırarak dikkatlice kaldırın. Beyin segmentinde 4 görünür quadrant olmalıdır. İki küçük çeyreğin iki büyük çeyreğinden daha üstün konumlandırılmış olacak şekilde segment yerleştirin. Superior iki (küçük) çeyreği alt iki (büyük) kadrandan ayıran belirgin bir sırt vardır. Forceps çimdik kullanarak ve alt quadrants üstün quadrants ayırmak ve sonra üstün quadrants atın. Kalan inferior quadrants yanal dorsal tarafında aşırı doku olacak, Bu doku kalan ventral doku daha az opak bakacağız. Daha az yoğun sırt dokusu çıkarın ve atın. Kalan segment hem Substantia nigra pars compacta (SNc) ve ventral tegmental alan (VTA) içermelidir. Forceps kullanarak 4 küçük parçalar halinde kalan ventral doku segmenti kesilmiş ve 1mL geniş delikli pipet kullanarak 1x HBSS ile 15 mL konik tüp bu segmentleri transfer. Prosedür boyunca buz üzerinde beyin segmentleri ile konik tüp tutun. Kalan tüm beyin segmentleri için bu işlemi tekrarlayın. 4. Hücrelerin dissosiyası Hücrelerin enzimatik sindirimi HBSS’yi orta beyin segmentleri içeren 15 mL konik tüpten dikkatlice aspire edin ve segmentleri tüpün alt kısmında bırakarak. Tüpe ~800 μL papain çözeltisi ekleyin ve 7 dakika boyunca 37 °C’lik bir kuluçka makinesine yerleştirin. Tüpü hareket ettirerek hücreleri yeniden askıya alın ve 37 °C’lik kuvözyerine 7 dakika daha yerleştirin. Geniş delikli 1 mL pipet ucu ile sadece orta beyin parçalarını 1 mL dNase aliquot içine kaldırın. Segmentlerin aliquot’un dibine veya yaklaşık 1 dakika pozlamaya ulaşmasına izin verin. Geniş delikli 1 mL pipet ucu ile sadece orta beyin parçalarını 2 mL stop çözeltisi içeren 15 mL konik bir tüpe çıkarın. Segmentlerin tüpün altına yerleşmesine izin verin ve durulayın durdurma çözeltisi ile dolu ek bir konik tüpte tekrarlayın. Hücre süspansiyonunun mekanik triturasyonu İkinci stop çözeltisinde, geniş delikli 1 mL pipet ucu kullanılarak, büyük doku segmentleri görünmeyene kadar hücreleri 10 kez yukarı ve aşağı inceletin. Bu minimal hücre lisis için tritürasyon üzerinde önlemek için önemlidir. Yavaş pipet 300 μL 4% BSA çözeltisi beyin segmentleri içeren 15 mL konik tüp altına. Süspansiyon tabakasını korumak için pipet ucunu dikkatlice çıkarın. Santrifüj 0.4 x g 3 dk. Daha sonra 400 μL hücre kültürü ortamında süpernatant ve resuspend hücreleri dikkatlice aspire edin. 5. Hücreleri kaplamak NOT: Deneyime dayanarak, embriyo başına yaklaşık 100.000 canlı hücre toplanır. 2-3 aylık zamanlanmış hamile fareler genellikle 8-10 embriyo çöp boyutları var; bu nedenle, zamanlanmış gebe fare başına hücrelerin toplam verimi için kaba bir tahmin yaklaşık 1 milyon hücredir. Bir hemositometre preform kullanarak bir hücre sayısı ve daha sonra hücre kültürü ortamı kullanarak 2.000 hücre / μL süspansiyon seyreltmek. Karıştırmak için kısaca triturate. 2. adımdan laminin solüsyonu olan kapakları çıkarın ve kalan laminin çözeltisini vakum kullanarak kaplamalı kapaklardan aspire edin. Kapakkapaklarının tamamen kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde plakalayın. Pipet 100°L (2,0 x 105 hücre/coverslip) her bir kapak kayması üzerine ve Petri kaplarını 1 saat boyunca 37 °C’lik bir kuluçka makinesine yerleştirin. Her çanağa 3 mL hücre kültürü ortamını dikkatlice ekleyin ve 37 °C’lik kuluçka makinesine geri yerleştirin. Preform yarım orta değişiklikler 2 hafta boyunca haftada 2 kez. 6. Adeno-ilişkili viral (AAV) vektörleri ile 14 DIV hücre kültürünün enfeksiyonu Her yemek için 1 μL hSyn-GCaMP6f AAV (1,0 x 1013 titre) ile 1 mL serumsuz DMEM ortamı hazırlayın Her yemekten hücre kültürü ortamını aspire edin ve hSyn-GCaMP6f içeren 1 mL serumsuz DMEM ile değiştirin. Yemekleri 37 °C’lik kuluçka makinesine 1 saat süreyle yerleştirin. ATV içeren serum içermeyen ortamı aspire edin ve 3 mL hücre kültürü ortamı ile değiştirin. Yemekleri 37 °C’lik kuluçka makinesine geri yerleştirin. Biz AAV enfeksiyonu 5-7 gün GCaMP ifade ideal düzeyde sağlar bulduk. Viral enfeksiyon bu dönemde her 2-3 günde bir orta değiştirmeye devam edin. 7. Canlı konfokal Ca2+ görüntüleme 19-21 DIV arasında NOT: 6.3. adımda da belirtildiği gibi viral enfeksiyonu takip eden 5-7 gün arasında görüntüleme yapılabilir. Bu, spontan Ca2+ aktivitesinin saptanmasına olanak sağlayan seviyelerde floroforun görünür bir şekilde ifade sini elde etmek için ideal bir penceredir. Kayıt arabelleklerinin hazırlanması 1 L HEPES kayıt arabelleği yapmak için, eklemek: 9.009 g NaCl, 0.3728 g KCl, 0.901 g D-glikoz, 2.381 g HEPES, 2 mL 1 M CaCl2 stok çözeltisi ve 500 μL 1 M MgCl2 stok çözeltisi 800 mL steril distile H2O. NaOH ile pH’ı 7,4’e getirin. 1 L’lik son bir sese getirin. 200 mL 200 mL 20μM glutamat kayıt tamponu yapmak için, seyreltik 40 μL 100 mM glutamat stok çözeltisi içine 200 mL HEPES kayıt tampon yukarıda açıklanan. 10 μM NBQX kayıt tamponunun 200 mL’sini yapmak için 200 mL 10 mM NBQX stok çözeltisini 200 mL HEPES kayıt tamponuna seyreltin. Konfokal görüntüleme Steril 35 mm Petri kabını 3 mL kayıt tamponuyla doldurun. 37 °C’lik kuvözden enfekte kültürleriçeren 35 mm’lik petri kabını çıkarın. İnce uçlu forceps kullanarak, dikkatle bir coverslip kenarına kapmak ve kayıt tampon dolu Petri kabına hızlı bir şekilde aktarın. Kalan kapak kaymasını orta kısımda 37 °C’lik kuluçka makinesine yerleştirin. Kayıt tamponu ile kabı konfokal mikroskoba taşıyın. Görüntüleme yazılımını başlatın. Bir sonraki adıma geçin ve baş harfe doğru ilerleyin. Peristaltik pompayı çalıştırın ve hattı kayıt tamponuna yerleştirin. Akış hızını 2 mL/dk olarak kalibre edin. 35 mm Petri kabından enfekte kapak fişini kayıt banyosuna aktarın. 10x su daldırma hedefi ve BF ışık kullanarak, odak düzlemi bulmak ve nöron hücre organlarının yüksek yoğunluklu bir bölge arayın. 40x su daldırma hedefine geçin ve BF ışığını kullanarak numuneyi yeniden odaklayın. FluoView içindeki “Boyalar listesi” penceresinde AlexaFluor 488’i seçin ve uygulayın. AAV ifadesi değişken olabilir; bu nedenle, floroforların aşırı maruz kalmasını ve fotobeyazlmasını önlemek için düşük HV ve lazer güç ayarları ile başlayın. AlexaFluor 488 kanalı için, yüksek gerilimi (HV) 500’e, kazancı 1x’e ve 0’a mahsup edin. 488 lazer hattı için% 5 güç ayarlayın. Z düzleminde görüntülenebilen etkin hacmi artırmak için iğne deliği boyutunu 300 μm’ye yükseltin. Emisyon sinyallerini alt doygunluk düzeylerine en iyi şekilde ayarlamak için “focus x2” tarama seçeneğini kullanın. Buradan, ayarlar her kanalın ideal görünürlüğü elde edilene kadar ayarlanabilir.NOT: GCaMP ile Ca2+ akılarının tamamını doğru bir şekilde yakalamak için, dedektörü aşırı dozatmadan floresan yoğunluğunda artışa izin vermek için temel HV ve lazer güç ayarlarını ayarlayın. Mikroskop ayarları optimize edildikten sonra, GCaMP6f floresansında spontan değişiklikler gösteren birden fazla hücreye sahip bir bölgeyi bulmak için sahneyi hareket ettirin ve görüntüleme için istenilen düzleme odaklanın. Görüntüleme çerçevesini 1 saniyenin altında bir kare aralığına ulaşabilecek bir boyuta çekmek için “Küçük rekt” aracını kullanın. Bu, görüntüleme aralığını saniyede 1 kare olarak ayarlamak için gereklidir. “Aralık” penceresini 1,0, “Num” penceresini 600 değerine ayarlayın.NOT: İstenilen zaman noktasında (300 s) farklı kayıt tamponları sağlamak için, banyoya yeni bir çözüm sunmak için pompanın gecikme süresini kalibre etmek önemlidir. Bu çözelti perfüzyon hızına (2 mL/dk) ve çözelti pompalamak için kullanılan hattın uzunluğuna bağlı olacaktır. Bir t-serisi filmi yakalamak için “Zaman” seçeneğini seçin ve ardından görüntülemeye başlamak için “XYt” tarama seçeneğini kullanın. Görüntüleme ilerleme çubuğunu izleyin ve hattı HEPES kayıt tamponundan uygun zaman noktasında20 μM glutamat kayıt tamponuna taşıyın (örneğin, pompanın gecikme süresi 60’s’da çözüm sağlamak üzere kalibre edilmişse, 300 s’de glutamat sağlamak için hattı 240 karede glutamat arabellene doğru hareket ettirin). Görüntüleme tamamlandığında, Seri Bitti düğmesini seçin ve bitmiş t-serisi filmi kaydedin. Ek bir 5 dakika için 20 μM Glutamat perfuse devam, böylece kültürlü nöronlar toplam 10 dakika glutamata maruz kalmıştır. Görüntülenecek her kapak için bu işlemi tekrarlayın. 20 μM Glutamate ilave 5 dk maruz kaldıktan sonra, kapak kaymasını banyodan çıkarın ve görüntüleme günü tamamlanana kadar kayıt tamponu içeren 35mm Petri kabına geri yerleştirin. Bittiğinde, adım 8’e geçin. Ca2+ iz analizi ImageJ’de görüntü çözümlemesi gerçekleştirin. ImageJ için BIO-FORMATS eklentisini yükleyin, hangi izin verir. OIB resim dosyaları açılacak. ImageJ araç çubuğunda, Analiz Et | Ölçümleri ayarlayınve Ortalama gri değeri (MGV) için kutuyu seçin. ImageJ’de, bir t-serisi filmi hyperstack olarak açın. Film için kaydırıcıyı sürükleyin ve glutamata yanıt veren tüm nöronları görselleştirmek için çerçeveyi maksimal glutamat yanıtı ile tanımlayın. Tüm görünür nöron hücre vücutlarını izlemek için çokgen aracını kullanın, “ROI yöneticisi” listesine roi’lerini ekleyerek. İzleme ve roi ekleme tamamlandığında, YG Yöneticisi penceresindeki tüm ROI’ları seçin ve daha fazla seçenek listesinde Çoklu ölçü seçimini kullanın. Bu verileri bir elektronik tabloya kopyalayıp yapıştırın. Tüm filmlerin analiz edilmesi için bu işlemi tamamlayın. Her Yatırım Getirisi için, her bir çerçevedeki ham MGV verilerini δf/f0 değerlerine dönüştürün denklemi: ΔF/F0 = [F(t) – F0] / F0. Herhangi bir çerçevenin F(t) = MGV ve ~100 karelerin ortalama taban çizgisi MGV’sinin bulunduğu yerde Ca2+ akıları yoktur. OriginPro 2020 gibi istatistiksel bir yazılım kullanılarak, dönüştürülmüş ΔF/F0 izleri çizgi grafiklere dönüştürülebilir. “Peak analyzer” işlevi glutamat yanıtının tepe genliğini ölçmek için (veya farklı bir yazılım kullanıyorsa benzer bir işlev) kullanılabilir, glutamata yanıt vermek için gecikme ve eğrinin altındaki alan. 8. Kültürlerin İmmünostaining NOT: Formalin fiksasyonundan sonra, kapaklar 4 °C’de 1x PBS’de saklanabilir ve immünboyama için işleme hazır olunabilir. Primer ve sekonder antikor inkübasyonu seri bir şekilde yapıldı, anti-Caspase-3 primer antikor ve tamamlayıcı sekonder antikor anti-TH primer antikor ve tamamlayıcı sekonder antikor ile birlikte inkübasyondan önce gelen ler gibi. Glutamat maruziyetinden hemen sonra, coverslip’i 35 mm Petri kabına geri yerleştirin, kayıt tamponunu aspire edin ve formalin 3 mL ekleyin. Oda sıcaklığında 40 dakika (RT) oturalım. 1x PBS ile yemeği 3 kez durulayın. PBS aspire ve permeabilize hücreleri 1 mL 0.01% Triton X-100 PBS için 2 dakika. 1x PBS ile yemeği 3 kez durulayın. PBS’de NGS’nin 1 mL’sinde PBS ve blok hücrelerini 40 dakika aspire edin. 1x PBS ile yemeği 3 kez durulayın. PBS’de %1 NGS’nin 1 mL’sine 1 μL tavşan anti-Caspase-3 primer antikor ekleyin (1:1000 seyreltme). Çanak tan PBS aspire ve birincil antikor çözeltisi ile değiştirin. Rt’de 1,5 saat çalkalayıcı ve kuluçka ya tıkıştın. 1x PBS ile yemeği 3 kez durulayın. 1 μL keçi anti-tavşan AlexaFluor 488 ikincil antikor pbs (1:1000 seyreltme) % 1 NGS 1 mL ekleyin. Çanaktan PBS aspire edin ve ikincil antikor solüsyonu ile değiştirin. Bir shaker üzerine yerleştirin ve RT 1 saat için kuluçka. 1x PBS ile yemeği 3 kez durulayın. Tekrar adımlar 8.7 – 8.10, ama tavuk anti-TH birincil antikor kullanarak (1:1000) adım 8.7 ve keçi anti-tavuk AlexaFluor 594 ikincil antikor (1:1000) adım 8.9. Son PBS durulamadan sonra, 30 μL’lik montaj ortamını mikroskop slaytına yerleştirin. Forceps kullanarak 35 mm Petri çanak bir coverslip kapmak ve montaj orta içine aşağı bakan hücreleri ile coverslip yerleştirin. Doğru yerleştirilirse her iki kapak kapağı da tek bir mikroskop slaytına sığar. Kuru, karanlık bir alana yerleştirin ve montaj ortamının bir gecede kurumasını bekleyin. 9. İmmünosif kültürlerin konfokal görüntülemesi Konfokal görüntüleme Görüntüleme yazılımını başlatın. Örneği mikroskop aşamasına yerleştirin. Mikroskop parçaları ile, tritc filtre ile 20x büyütme hedefi ve epifloresan ışık kullanarak, örnek odaklanmak ve bir TH + hücre gövdesi için arama. Bir TH+ hücre gövdesini bir kez bularak, görüş alanına ortalayın ve ardından 60x büyütme hedefine geçin. “Boya listesi” penceresinde AlexaFluor 488 ve AlexaFluor 594 boyalarını seçin. Canlı görüntülemede olduğu gibi, fotobeyaztlamayı önlemek için düşük HV, kazanç, ofset ve lazer güç ayarlarıyla başlayın. Her kanalın floresan yoğunluğunu değerlendirmek ve buna göre ayarlamak için “focus x2” tarama seçeneğini kullanın. Bu görüntüler daha sonra floresan yoğunluğu için ölçüleceği için görüntüleme ayarlarını tüm görüş alanlarında tutarlı tutmak gerekir. Bu nedenle, örnekler arasında floresan yoğunluğu aralığı hakkında bir fikir elde etmek için her durumun birkaç örnek bakmak en iyisidir. İdeal görüntüleme ayarları belirlendikten sonra “focus x2” taraması seçeneğini seçin ve ilgi hücresini görüş alanının merkezine taşıyın. “Yakınlaştırma” kaydırıcısını kullanarak dijital yakınlaştırmayı 3 katartırın. Odak tonuzunu kullanarak, en parlak floresan ile odak düzlemini bulun ve tek bir düzlemxy görüntü yakalayın. Görüntüyü bitirmek için kaydedin. Başka bir TH+ hücresi aramak için 20x büyütme hedefine geri dön. İstenilen sayıda hücre her koşuldan örneklenene kadar bu işlemi tekrarlayın. Görüntü analizi ImageJ araç çubuğunda, Analiz Et | Ölçümleri ayarlayınve Alan, Tümleşik yoğunluk ve Ortalama gri değeri için kutuları seçin. Görüntüyü, ImageJ araç çubuğuna sürükleyip bırakarak veya dosya menüsünden görüntüyü seçerek her kanal ayrılmış bir hiperyığın olarak açın. Hücre gövdesi nin etrafına ROI çizmek için TH kanalını (594 nm) kullanın. ImageJ’deki çokgen izleme aracını kullanarak hücre gövdesinin dış kenarını yakından takip edin. Hücre zarı ile hücre çekirdeği arasındaki mesafenin en küçük olduğu yerde, sitosol dan çekirdeğin kenarına doğru düz bir çizgi izleyin ve sonra onu dışlamak için çekirdeğin anahatlarını yakından takip edin. Daha sonra dış zara kadar düz bir çizgi izleyin, mümkün olduğunca yakın olarak ilk satırı sınırlayan, ve YG tamamlanana kadar hücre gövdesinin anahat izlemeye devam. Klavye kısayolunu “T” veya araç çubuğu menü yolunu kullanarak Çözümle | Araçlar | YG Yöneticisi,YG yöneticisini açın ve listeye yeni çekilen Yatırım Getirisi’ni ekleyin. Caspase-3 kanalının penceresini (488 nm) seçin ve ardından “YG Yöneticisi” listesinde eklenen YG’yi seçin. YG Yöneticisi penceresinde Ölçüle düğmesini seçin. Sonuçlar penceresi daha önce ayarlanan ölçümlerle görünür. Bunları bir elektronik tabloya kopyalayın ve her hücre için bu işlemi yineleyin.