用于液相电子显微镜的化学固定哺乳动物细胞的石墨烯外壳

1. 用聚L-裂明（PLL）和纤维素类蛋白（FLP）清洁微芯片和涂层 将两个带 SiN 膜（2.0 x 2.6 mm）的微芯片放在 50 mL 的丙酮中。小心处理微芯片，平端朝上。使用平嘴钳子避免断裂边缘。使用钳子操作时，避免接触微芯片的顶部表面，以防止 SiN 窗口损坏。注：也可以使用聚四氟乙烯涂层或碳尖端钳子，以防止微芯片的损坏。 小心摇动烧杯，将芯片洗涤 2 分钟，观察微芯片不要翻转。 将微芯片转移到50 mL乙醇中，通过小心摇动烧杯洗涤2分钟。确保传输快速，使多余的丙酮不会干中。 用50 mL水清洗微芯片10分钟。 将微芯片浸入新鲜准备的20 mL乙醇烧杯中。 将微芯片放在洁净室组织上进行干燥。 等离子体在 70 mTorr 时用 11.5 sccm O2 和 35 sccm Ar 清洁微芯片，射频 （RF） 目标为 50 W，为 5 分钟。 将微芯片放在层流罩中，用于无菌细胞工作。 准备水中 0.01% PLL 的溶液。在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中制备 15 μg/mL FLP 溶液。 在层流罩下准备一个24孔板，按以下顺序单独填充5个井，用1 mL的溶液填充：井1 =PLL;井 2 = 水;井 3 = 水;以及 4 = Flp;井 5 = Pbs 和井 6 = Pbs 。注：使用钳子将微芯片浸入指示的 24 或 96 井中几秒钟，执行洗涤步骤。通过将微芯片孵育为指示的时间和温度，在指示溶液中孵育24或96井，执行孵育步骤。在几秒钟内将微芯片转移到另一个井中。 在PLL溶液中孵育微芯片5分钟。然后在水中清洗两次微芯片。 在FLP中孵育微芯片5分钟。然后在PBS中清洗两次微芯片。 将两个微芯片转移到新 96 井板的孔（每个微芯片一个），预填充 50 μL 的无血清培养基，用于细胞播种。 在37°C和5%CO2下孵育微芯片， 直到细胞悬浮液准备好。 2. 在SiN膜微芯片上播种细胞 在层流罩中设置所有耗材和设备，以确保无菌工作。 在具有生长介质的细胞培养瓶中清洗乳腺癌细胞系SKBR3。使用Dulbecco的改良鹰介质（DMEM）含有10%的胎儿小牛血清（FCS）和1%的非必需氨基酸（NEAAs）作为生长介质。 用1mL的细胞分离溶液孵育细胞，直到细胞从烧瓶分离。 向烧瓶中的分离细胞添加5 mL的生长介质。将此悬架转移到离心管。 移液20μL的细胞悬浮液进入血细胞计，以获得细胞浓度。使用以下公式。. 准备 2.5 x 105 细胞/mL 的 分散细胞悬浮液。计算所需的准备细胞悬浮量：并填充生长介质到所需的体积。 将100μL的细胞悬浮液加入含有PLL和FLP涂层微芯片的96孔板的两口井中，该孔的SiN膜朝上，50μL的血清培养基，使每口井含有25，000个细胞。 在37°C和5%CO2下孵育 板5分钟，等待细胞附着在微芯片上。注：此时，细胞可以从微芯片分离，因为它们尚未粘附。 用倒置显微镜检查微芯片上的细胞密度。确保单元格覆盖窗口时有足够的空间来压平并粘附（参见图 1A）。注：如有必要，此时可以添加更多单元格。 将微芯片转移到含有200μL生长介质的新井中，并在37°C和5%CO2下孵 育过夜。 在第二天下午，将两个微芯片转移到无血清介质（血清饥饿介质），如果细胞已经变平并粘附在视觉检查的汇合（即被细胞覆盖的窗口区域的分数）约2/3（见图1B）。根据需要更换无血清介质，使细胞处于定义的起始状态，以便比较不同的实验25。 在37°C和5%CO2过夜孵 育。注意：请注意，细胞量可能因其他细胞系的生长速率和细胞形态而不同。 3. HER2 标签和固定 准备补充表 1 中所述的解决方案。 在层流罩下工作，确保无菌工作。使用称为标签板 I 的 96 孔板，用 200 μL 的标签板 I 溶液填充每个微芯片 6 孔：PBS/BSA、PBS/BSA/GS、抗体模仿、PBS/BSA、PBS/BSA、PBS/BSA。使用每微芯片井板的一行（每行一个字母，例如 A1 到 A6）。将标签板加热至37°C。 在烟气罩下，准备一个称为固定板的24孔板，用500μL的固定板溶液填充8孔：CB、FA、CB、PBS、PBS、PBS、PBS、PBS、PBS、PBS/甘氨酸、PBS/BSA。注意：CB 因吸入或口服而具有剧毒性，对水有害。在烟气罩下工作，提供适当的保护，并根据安全数据表 （SDS） 处置 CB。FA 具有腐蚀性，对皮肤和健康有害。在烟罩下工作，并参考 SDS 了解处理和处置信息。 准备一个称为标签板II的96孔板，用200μL的标签板II溶液填充4孔，即QD、PBS/BSA、PBS/BSA、PBS/BSA、PBS/BSA。注：在这里，24孔板用于更好地看到井中的微芯片。要少使用抗体模仿（步骤3.2）和QD（步骤3.4），请使用96孔板执行这些步骤。 在单元格中标记 HER2。 准备好这些板后，通过将微芯片放入标签板 1 的第一排孔中开始标记。 用标有标签板 I 的 96 井板中的 PBS/BSA 清洗微芯片。 通过用PBS/BSA/GS在37°C和5%CO2下孵育5分钟，阻断非特异性位点，防止抗体模仿的不特异性结合。 在37°C和5%CO2下用200 nM抗体模仿孵育10分钟。 在PBS/BSA中清洗微芯片三次。 修复单元格。 将微芯片转移到烟罩中的 24 个井固定板。注：这里不需要无菌工作。 用 CB 洗一次几秒钟。 用 3% FA 修复单元格 10 分钟。 用 CB 洗一次，用 PBS 洗三次。 使用 PBS-甘氨酸孵育 2 分钟，阻止无醛组 FA。 用 PBS-BSA 清洗一次微芯片。 附加 QD。 将微芯片移动到 96 井标板 II。 用 20 nM QD 孵育 12 分钟。 用 PBS/BSA 清洗微芯片两次。 将微芯片存放在含有 PBS/BSA 的井中。 4. 固定细胞的光显微镜 使用 2 mL PBS/BSA 溶液准备一个直径为 3.5 厘米的玻璃底盘。 拿第一个微芯片，倒置（朝下细胞）放入玻璃底盘，将盘子放入荧光显微镜中。将微芯片慢慢放入液体中，以防止对细胞造成损害。 通过 40 倍的目标和适当的荧光通道获取每个微芯片的差分干扰对比度 （DIC） 和荧光图像。注：此处，激发波长为 540-580 nm，发射波长为 607-683 nm，用于检测 QD655。 对第二个微芯片重复此过程。 5. 固定后 在烟罩下执行所有步骤。 用 200 μL 的固定后溶液填充 96 孔板每微芯片 6 孔：CB， GA， CB， PBS， PBS， PBS.注意：GA对水有害，对皮肤、呼吸系统和眼睛有害。在烟罩下工作，并参考 SDS 了解处理和处置信息。 将两个微芯片放在各自的孔中，细胞朝上。 用 Cb 洗一次。 用 2% GA 修复单元格 10 分钟。 用 Cb 洗一次。 使用 PBS/BSA 清洗三次。注：FA的第一个固定步骤已经固定了生物结构，但膜蛋白扩散水平可能仍然降低，可能导致标签诱导聚类，因为存在多个链球菌蛋白每个QD。因此，尽可能缩短实验步骤从FA固定到GA的时间，以尽量减少膜中蛋白质的扩散。 储存在PBS/BSA中，以防止渗透冲击和0.02%的阿齐德钠（NaN3），以防止细菌在4°C生长，直到石墨烯涂层在一个新的井板。用石蜡膜密封井板，防止干燥。微芯片和细胞在4°C下储存时稳定长达2周。注意：NaN3 对水有危害，对皮肤和呼吸系统有口服严重毒性。在烟罩下工作，并参考 SDS 了解处理和处置信息。 6. 清洁石墨烯并将盐晶体转移到盐晶体上 从聚合物上的PMMA-石墨烯（图2A）中去除聚（甲基甲基丙烯酸酯）石墨烯（图2A）。 在PMMA-石墨烯周围的聚合物上滴几滴水。注：确保PMMA-石墨烯漂浮在水面上时，很容易从支撑聚合物上脱落。 将PMMA-石墨烯浸入水中，角度为30-45°，释放PMMA-石墨烯。注：聚合物应仅稍微湿润。在聚合物上移液太多水会提升并可能折叠PMMA-石墨烯。 使用硫酸钠溶液的蚀刻铜基污染物（图2B）。注：在铜箔上生长的商业石墨烯通常含有亚微米铜残留物，可用铜蚀刻溶液去除22。 准备 50 mL 溶液中的 0.42 M 硫酸钠。 使用标准玻璃幻灯片将PMMA-石墨烯与石墨烯侧向下转移至硫酸钠溶液中。PMMA-石墨烯将浮在溶液顶部。 将PMMA石墨烯留在硫酸钠溶液中过夜。 从硫酸钠溶液中去除 PMMA-石墨烯，并使用玻璃滑梯将其放在净水的顶部。让它在水面上漂浮半小时。 重复上一步共三次，以去除PMMA-石墨烯中所有硫酸钠残留物。 将 PMMA-石墨烯转移到氯化钠 （NaCl） 晶体上。 在培养皿中在水中准备 NaCl 的饱和溶液。 使用玻璃滑梯将 NaCl 溶液顶部的 PMMA 石墨烯与石墨烯侧向下传输。 用钳子拿着一个 NaCl 水晶， 拿起漂浮的 PMMA 石墨烯。注：NaCl晶体的大小应略大于PMMA石墨烯的大小，以避免折叠盐边缘突出的石墨烯或用钳子接触石墨烯。在这些实验中，12 mm x 12 mm x 0.5 mm 的 NaCl 晶体用于拾取 10 mm x 10 mm 石墨烯片并随后支撑它。 将 PMMA-石墨烯垂直保持盐上 2 分钟，让多余的水流出。 让PMMA-石墨烯在室温下干燥30分钟，在100°C的烤箱中烘烤20分钟，以完全去除水。 使用丙酮洗涤去除PMMA（图2C）。 在玻璃培养皿中预热丙酮至烟罩中的热板上 +50°C。仔细观察温度，避免着火。 将PMMA-石墨烯浸入装满丙酮的培养皿中，让其溶解PMMA30分钟。 使用新的清洁丙酮共重复上一步三次。 在样品制备之前，让盐上的石墨烯彻底干燥。 7. 石墨烯涂层 注：图3A中图中显示了石墨 烯涂层工艺。 用固定细胞清洗一个微芯片，并在纯水中标记 HER2，以清除缓冲液中残留的盐。将微芯片放在滤纸上。这些细胞以黑点可见（图3B）。 使用剃须刀将 NaCl 晶体上的多层石墨烯切成适合微芯片的 SiN 窗口的一块。 准备纯水烧杯，将晶体与水面倾斜约 45° 角并接触水，从 NaCl 晶体中去除石墨烯。石墨烯将漂浮在水面上（图3C）。 用金属环从水面捕捉石墨烯。石墨烯将漂浮在循环下方的液滴内（图3D）。 用下环表面触摸微芯片的上表面。微芯片将粘在金属环上。石墨烯可以在微芯片的顶部看到（图3E）。 在立体显微镜下，使用滤纸从微芯片中去除剩余的水，使石墨烯覆盖SiN窗口上的所有细胞。注：石墨烯在被污污时会移动。只需用滤纸边缘触摸微芯片，即可确保石墨烯停留在窗口顶部。 使用钳子从金属环中取出微芯片并将其放在滤纸上。石墨烯在微芯片上以紫色微光可见（图3F）。 将微芯片从纸张转移到隔间培养皿中。 将一滴水滴入其中一个自由隔间，然后合上盖子，以提供水饱和的大气。 如果需要进一步测量，用石蜡薄膜密封隔间，并在 4°C 时存放在冰箱中。 8. 茎 通过调整冷凝器透镜、探针电流 I = 180 pA（ 制造商在 5% 精度范围内提供不同显微镜设置的探针电流信息）和通过插入孔径提供的 13.2 mrad 的光束收敛半角，使用至少 0.2 nm 的探针尺寸调整 200 kV 光束能量的 STEM。通过调整投影仪镜头设置，将 ADF STEM 探测器的半角度范围（内角和外角）打开范围设置为 68-280 mrad。将 STEM 图像大小设置为 2048 x 2048 像素，像素停留时间 t = 6 μs。 将微芯片与石墨烯涂层的电池装载到 TEM 的标准试样支架中，使细胞朝上。 将支架加载到电子显微镜中。 使用步骤 8.1 中的设置以放大倍率 （ M ） = 800x （图 4） 获取概览图片。 标识单元格上感兴趣的区域。 使用 ADF 探测器在M = 80，000x 以像素大小d = 1.3 nm （图 4 ） 使用步骤 8.1 中的设置对 QD 进行图像。Figure 4 以较低的放大倍率（此处 ，M = 50，000x）获得曝光后的区域图像，以显示暴露区域（图4）。 计算电子剂量其中 e 是基本费用。以上设置后，和5%的错误。 获得20个图像的剂量系列具有相同的设置，但与 t = 60 μs导致累积剂量. 要确认石墨烯的存在，请将显微镜切换到 M = 1，200 倍的 TEM，选择细胞附近的区域，然后切换到衍射模式。在曝光时间为 0.5 s、2048 x 2048 x 3 像素以及所选区域光圈 50 μm 时记录衍射模式（图 4）。 在会议结束时，从显微镜中取出样品，将微芯片放回隔间中，用石蜡膜密封盘子，如果需要进一步测量，将其储存在冰箱中，温度为 4°C。 选择第二个微芯片，其准备方式与第一个微芯片相同，但无石墨烯涂层。 重复步骤 8.2-8.11，但现在对于此示例。将与上述设置相同的衍射模式记录为比较（图 4）。 9. 分析 注：对于STEM图像中的QD位置的自动检测，分析使用了 ImageJ（NIH）的本地设计的插件，如其他地方所述20。插件可应要求提供。 该软件会自动应用以下步骤来检测 STEM 图像中的粒子： 应用高斯滤镜以降低像素噪音。 应用快速四叶变换 （FFT） 带通滤波器，仅获取纳米粒子。 设置将图像二进制化的阈值。 使用容差系数为 2 的 10 nm 的粒子直径进行粒子检测。 检测粒子位置。 测量每个系列 10 对 QD 之间的中心到中心距离。在这里，每个系列测量了 10 个大小不同的距离。 通过使用以下方法比较每个粒子距离与第一个图像中的距离，计算粒子距离的相对变化：.