Mapeo cerebral preciso para realizar imágenes in vivo repetitivas de dinámica neuroinmunitaria en ratones

El sistema nervioso central (SNC) se rige por una compleja interacción de interacciones entre varios tipos de células residentes, incluyendo neuronas, glia y células asociadas a vasos. Tradicionalmente, las células neurales se estudiaban en contextos aislados, co-cultivados^1,,2,^3,4,5 (in vitro) o de tejido cerebral extirpado (ex vivo)^6,7,,8,^9,10. Sin embargo, es necesario comprender mejor el comportamiento de las células neuronales y las interacciones en el entorno nativo del cerebro in vivo in vivo. En este protocolo, describimos un método para asignar regiones in vivo de interés y volver a escuchar con precisión esas regiones en futuras sesiones de imágenes para realizar un seguimiento de las interacciones complejas entre los distintos tipos de células CNS durante largos períodos de tiempo.

El desarrollo de enfoques de imagen in vivo ha proporcionado ganancias significativas para la comprensión adecuada de la función neuronal^{11,12,13,14,15}. Específicamente, estos enfoques proporcionan varias ventajas sobre los enfoques tradicionales in vitro y ex vivo. En primer lugar, los sistemas de imágenes in vivo tienen componentes celulares y tisulares fisiológicamente relevantes, como la vasculatura, con todo el repertorio de interacciones celulares para proporcionar una comprensión completa de la fisiología de la red neuronal. En segundo lugar, los hallazgos recientes sugieren que cuando se eliminan de su entorno nativo, ciertas células neuronales (como la microglia) pierden características importantes de su identidad y, por lo^tanto,la fisiología¹⁶,¹⁷ que se pueden conservar en el entorno in vivo. En tercer lugar, los sistemas de imágenes in vivo proporcionan la oportunidad de realizar investigaciones longitudinales estables de semanas a meses para estudiar las interacciones celulares del SNC. Por último, dada la creciente evidencia de las contribuciones del sistema inmunitario periférico^18,19 y el microbioma^20,21 en la fisiología del SNC, los sistemas in vivo proporcionan una plataforma para interrogar tales contribuciones y efectos en las células del SNC. Por lo tanto, los enfoques que emplean imágenes in vivo longitudinales para estudiar la fisiología neuroinmune y las interacciones en estados sanos, lesionados y enfermos son una gran adición complementaria a los enfoques tradicionales.

En este protocolo, describimos un enfoque confiable para la imagen de diferentes tipos de células en el cerebro, incluyendo microglia, neuronas y NG2⁺ células como ejemplos. Se han desarrollado dos enfoques para visualizar las células neuronales in vivo: el enfoque del cráneo adelgazado y el cráneo abierto con un enfoque craneal de la ventana. Aunque los enfoques del cráneo adelgazado están en uso y son preferidos porque superan algunas de las desventajas del enfoque del cráneo abierto, como la activación de células gliales, la dinámica de la columna vertebral más alta que fisiológica y el uso de agentes antiinflamatorios^{22,,23,,24,,25,}los enfoques del cráneo adelgazado también muestran algunos inconvenientes críticos. En primer lugar, el procedimiento de adelgazamiento es un procedimiento muy delicado que muchos investigadores encuentran difícil de perfeccionar, especialmente cuando es necesario volver a adelgazar. Este es el caso porque a menudo es difícil para los experimentadores determinar que han adelgazado el cráneo a una profundidad de 20 m. En segundo lugar, para las comparaciones adecuadas entre ratones, el adelgazamiento tendría que ser idéntico y una variedad de éxito de adelgazamiento entre sesiones de diagnóstico por imágenes o ratones podría complicar la visualización de las estructuras neuronales. En tercer lugar, cuando se emplean para imágenes longitudinales, los animales con cráneos adelgazados sólo se pueden utilizar para un número limitado de sesiones cuando se emplea el re-adelgazamiento del cráneo. En adelante, dado que todavía queda parte del tejido óseo, la claridad en profundidad de las imágenes podría verse comprometida a partir del enfoque del cráneo adelgazado, lo que permite una gran visualización de las regiones más superficiales pero no tan profundas. A la luz de esto, las estructuras cerebrales más profundas, como el hipocampo, no se pueden imaginar con éxito con el enfoque del cráneo adelgazado. Estas consideraciones plantean la necesidad de enfoques alternativos y complementarios que puedan superar estas preocupaciones.

Alternativamente al enfoque del cráneo adelgazado, el enfoque de implantación de la ventana del cráneo abierto utiliza un procedimiento en el que el cráneo se reemplaza con un cubreobjetos de vidrio ópticamente transparente. Esto permite un número casi ilimitado de sesiones de imágenes. Además, dado el reemplazo del cráneo por el cubreobjetos de vidrio, este método permite una ventana de visualización clara de células cerebrales etiquetadas fluorescentemente durante largos períodos de tiempos de horas a meses y, por lo tanto, se puede emplear para estudiar la actividad celular y las interacciones que son relevantes para la fisiología, el envejecimiento y la patología.

En general, detallamos los pasos que se pueden seguir para implantar ventanas craneales crónicas a través de una craneotomía estereotaxica que permite la toma de imágenes in vivo de las regiones cerebrales de interés. También describimos cómo la vasculatura cerebral muy estable o las dendritas etiquetadas fluorescentemente podrían utilizarse para generar un mapa grueso o fino, respectivamente de las regiones cerebrales de interés. Este enfoque se puede utilizar para imágenes repetidas durante varias sesiones. La importancia de esta técnica, por lo tanto, radica en su capacidad para imaginar los cambios a largo plazo o éxtasis en los elementos cerebrales, incluyendo la disposición, morfología, y las interacciones de los diferentes tipos celulares.