성인 인간 뇌 조직에서 인간 마이크로글리아 획득
Summary
이 프로토콜은 살아있는, 성인, 인간의 뇌 조직에서 기본 microglia를 격리하는 효율적이고 비용 효율적이며 강력한 방법입니다. 고립 된 1 차적인 인간 microglia는 항상성 및 질병에 있는 세포 프로세스를 공부하기 위한 공구역할을 할 수 있습니다.
Abstract
Microglia는 중추 신경계 (CNS)의 거주자 타고난 면역 세포입니다. Microglia는 개발 중, 항상성을 유지 하며 감염 또는 부상 중에 중요한 역할을 합니다. 몇몇 독립적인 연구 단은 microglia가 자기 면역 질병, 자가 염증성 증후군 및 암에서 재생하는 중앙 역할을 강조했습니다. 몇몇 신경학상 질병에 있는 microglia의 활성화는 병원성 프로세스에 직접 참여할 수 있습니다. 1 차적인 microglia는 두뇌에 있는 면역 반응을 이해하는 강력한 공구입니다, 세포 세포 상호 작용 및 질병에 있는 dysregulated microglia 표현형. 1 차적인 microglia는 불멸한 microglial 세포주 보다는 더 나은 생체 내 microglial 속성에서 모방합니다. 인간 성인 microglia 인간의 태아와 설치류 microglia에 비해 뚜렷한 속성을 전시. 이 프로토콜은 성인 인간의 뇌에서 기본 마이크로 글리아의 격리를위한 효율적인 방법을 제공합니다. 이러한 microglia를 연구 하는 microglia와 CNS에 있는 다른 상주 세포 인구 사이 세포 세포 상호 작용에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다., oligodendrocytes, 뉴런 및 성상 세포. 또한, 다른 인간의 두뇌에서 microglia 개인화 된 약및 치료 응용 프로그램의 무수한에 대 한 독특한 면역 반응의 특성화를 위해 배양 될 수 있습니다.
Introduction
중추 신경계(CNS)는 뉴런 과 신경교 세포1의복잡한 네트워크로 구성된다. 신경교 세포 중, 마이크로글리아는 CNS2,,3의타고난 면역 세포로서 기능한다. Microglia는 건강한 CNS4에서항상성을 유지하는 데 책임이 있습니다. Microglia는 또한 시냅스2를가지치기하여 신경 발달에 중요한 역할을합니다. Microglia는 여러 신경 질환의 병리생리학의 중심이지만 제한되지 는 않습니다. 알츠하이머병5,파킨슨병6,뇌졸중7,다발성 경화증8,외상성 뇌손상9,신경병성 통증10,척수 손상11, 진모(12) 등의 뇌종양이 있다.12
CNS 항상성 및 질병과 관련된 연구는 비용 효율적이고 시간 효율적인 인간 1 차 적인 microglia 격리 프로토콜13의땅때문에 설치류 microglia를 이용합니다. 설치류 마이크로글리아는 Iba-1, PU.1, DAP12 및 M-CSF 수용체와 같은 유전자의 발현에서 1차 인간 마이크로글리아를 유사하게 하며, 병든뇌(13)뿐만아니라 정상을 이해하는 데 효과적이었다. 흥미롭게도, TLR4, MHC II, 시글리크-11 및 시그렉-3과 같은 여러 면역 관련 유전자의 발현은 인간과 설치류마이크로글리아(13)사이에 다릅니다. 여러 유전자의 발현은 또한 두 종14,,15에서측현현 및 신경 퇴행성 질환에서 변화한다. 이러한 중요한 차이는 인간 microglia 항상성 및 질병에 있는 microglia 기능을 공부하는 필수적인 모형을 만듭니다. 1차 인간 마이크로글리아는 잠재적약물후보(16)의전임상 검진을 위한 효과적인 도구가 될 수 있다. 위에서 언급 한 이유는 기본 인간 microglia의 격리를위한 비용 효율적인 프로토콜에 대한 필요성을 강조한다.
우리는 종양 절제술 또는 그밖 외과 절제술을 위해 생성된 외과 창결과로 집합된 성인 인간 두뇌 조직에서 1 차적인 인간 microglia의 격리를 위한 프로토콜을 개발했습니다. 여기서 방법은 기존 방법과 상당히 다릅니다. 우리는 조직 수집 현장에서 실험실에서 격리 프로토콜을 시작하는 약 75 분의 전송 시간 후에 격리하고 배양 microglia를 할 수 있었습니다. 우리는 격리 된 microglia의 성장을 촉진하기 위해 L929 섬유 아세포 세포의 상체를 사용했습니다. 이 방법은 특히 1 차 microglia의 문화와 개발에 초점을 맞추고 있습니다. 준비된 결과 배양은 약 80% 마이크로글리아입니다. 다른 프로토콜은 밀도 그라데이션 원심 분리, 유동 세포측정 및 자기 구슬에 의해 미세글리아의 농축 된 배양을 제공하지만, 프로토콜은 1차,인간 microglia17,18,19,,20을배양하는 신속하고 간단하며 견고하며 비용 효율적인 방법입니다., 시체에서 고정 된 뇌 조직 대신 외과적으로 제거 된 살아있는 성인 뇌 조직을 활용하는 능력은 기존 절차(18,,21)와는 대조적으로이 방법의 추가 이점을 입증한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia는 정상적인 뇌의 항상성을 보장하고 다양한 신경 질환4의 병리4생리학에서 중심적인 역할을한다. Microglia는 신경 발달과 시냅스2의형성의 중심입니다. Microglial 연구는 다양한 신경질환4의발달과 진행을 이해하는 데 중추적 인 것으로 입증되었습니다. 설치류 microglia는 1 차적인 microglial 연구 결과를 위한 선택의 널리 퍼진 모형입니다, ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SJ의 실험실은 IITJ의 기관 보조금으로 설립되었으며 생명공학부(BT/PR12831/MED/30/1489/2015)와 인도 전자정보기술부(No.4(16호)/2019-ITEA의 보조금으로 지원받고 있습니다. 인간의 뇌 조직 섹션은 기관 윤리위원회 허가 후 의학의 모든 인도 연구소 (AIIMS) Jodhpur에서 얻은. 비디오 그래피 지원을 위해 디자인 및 예술 협회 IIT Jodhpur의 B.Tech 학생 회원인 마야크 라토르에게 감사드립니다.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
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